Subretinale Transplantation von MACS gereinigten Photorezeptor-Vorläuferzellen in die adulte Maus-Retina

Zusammenfassung

Die Zelltransplantation stellt eine Strategie zur Behandlung der Netzhautdegeneration dar, die durch Photorezeptorverlust gekennzeichnet ist. Hier beschreiben wir eine Methode zur Anreicherung von transplantierbaren Photorezeptoren und deren subretinaler Transplantation in erwachsene Mäuse.

Zusammenfassung

Sehstörungen und Erblindung durch den Verlust der lichtempfindlichen Zellen der Netzhaut, d.h. Photorezeptoren, stellen den Hauptgrund für behinderungen in Industrieländern dar. Der Ersatz degenerierter Photorezeptoren durch Zelltransplantation stellt eine mögliche Behandlungsoption in zukünftigen klinischen Anwendungen dar. Tatsächlich haben jüngste präklinische Studien gezeigt, dass unreife Photorezeptoren, die am 4. Tag der Neugeborenen mausisoliert wurden, das Potenzial haben, sich nach subretinaler Transplantation in die netzretinale Netzhaut der erwachsenen Maus zu integrieren. Spenderzellen erzeugten eine ausgereifte Photorezeptormorphologie mit inneren und äußeren Segmenten, einem runden Zellkörper an der äußeren Kernschicht und synaptischen Terminals in unmittelbarer Nähe zu endogenen bipolaren Zellen. Tatsächlich haben jüngste Berichte gezeigt, dass Spenderphotorezeptoren sich funktionell in die neuronalen Schaltkreise von Wirtsmäusen integrieren. Für eine zukünftige klinische Anwendung eines solchen Zellersatzansatzes müssen gereinigte Suspensionen der Zellen der Wahl erzeugt und an die richtige Position für eine ordnungsgemäße Integration in das Auge gebracht werden. Für die Anreicherung von Photorezeptor-Vorläufern sollte die Sortierung auf bestimmten Zelloberflächenantigenen basieren, um eine genetische Reporterveränderung von Spenderzellen zu vermeiden. Hier zeigen wir magnetisch-assoziierte Zellsortierung (MACS) - Anreicherung von transplantierbaren Stabphotorezeptor-Vorläufern, die aus der neonatalen Netzhaut von photorezeptorspezifischen Reportermäusen auf Basis des Zelloberflächenmarkers CD73 isoliert sind. Die Inkubation mit Anti-CD73-Antikörpern gefolgt von mikro-bead-konjugierten sekundären Antikörpern ermöglichte die Anreicherung von Rod-Photorezeptor-Vorläufern durch MACS auf ca. 90%. Im Vergleich zur Durchflusszytometrie hat MACS den Vorteil, dass es einfacher auf GMP-Standards angewendet werden kann und dass große Mengen an Zellen in relativ kurzen Zeiträumen sortiert werden können. Die Injektion angereicherter Zellsuspensionen in den subretinalen Raum erwachsener Wildtypmäuse führte zu einer 3-fach höheren Integrationsrate im Vergleich zu unsortierten Zellsuspensionen.

Einleitung

Vision ist einer der wichtigsten Sinne des Menschen. Beeinträchtigung dieses Sinns und Blindheit sind einer der Hauptgründe für Behinderungen in Industrieländern. Die vorherrschende Ursache für Sehbehinderung oder Erblindung ist die Netzhautdegeneration, die durch Photorezeptorzellverlust gekennzeichnet ist, da sie bei Makuladegeneration, Retinitis pigmentosa, Kegelstabdystrophie und anderen Bedingungen beobachtet werden kann. Bis heute ist eine wirksame Therapie zur Wiederherstellung des verlorenen Sehvermögens nicht verfügbar. In den Jahren 2006 und 2008 berichteten zwei verschiedene Labore unabhängig voneinander über eine erfolgreiche Transplantation von Rod-Photorezeptor-Vorläuferzellen in adulte Wildtyp-Mäuse-Retinas^1,2. So entsteht die Möglichkeit der Photorezeptor-Vorläuferzelltransplantation auch in eine degenerierte Netzhaut, um degenerierte Photorezeptoren zu ersetzen und das Sehvermögen wiederherzustellen. Tatsächlich wurde in jüngster Zeit gezeigt, dass solche transplantierten Photorezeptor-Vorläuferzellen morphologische Kriterien von reifen Wildtyp-Photorezeptoren entlocken, wie z. B. richtig entwickelte äußere Segmente³, synaptische Klemmen in unmittelbarer Nähe zu endogenen bipolaren Zellen und einem runden Zellkörper in der äußeren Kernschicht^2-4, sowie die Fähigkeit, sich funktional in die neuronale Schaltanlage des Wirts zu integrieren^5-7. Eines der Hauptprinzipien dieser Strategie ist die Verwendung von postnatalen Tag 4 (PN 4, PN0 ist definiert als Tag der Geburt) junge Mäuse Netzhaut, was zu einer Mischung von verschiedenen Zelltypen für die Transplantation. Vor dem Hintergrund einer zukünftigen therapeutischen Anwendung muss diese Mischung für Photorezeptor-Vorläuferzellen gereinigt werden. CD73 wurde als erster Zelloberflächenmarker speziell für junge Photorezeptoren in der Netzhaut^8-10beschrieben. Hier zeigen wir eine Photorezeptor-Vorläuferzellreinigungsmethode auf Basis dieses Zelloberflächenmarkers und unter Verwendung der magnetisch-assoziierten Zellsortierungstechnik (MACS). MACS könnte aufgrund der schnellen Sortierzeiten und der einfacheren Anpassung an GMP-Bedingungen Vorteile gegenüber fluoreszierend aktivierten Zellsortiertechniken haben. Wir könnten eine Anreicherung von 90 % und eine bis zu dreifach höhere Integrationsrate nachweisen, wenn wir die angereicherte Population in den subretinalen Raum in erwachsenen Wild-Retinas transplantieren. So sind MACS-basierte Photorezeptor-Vorläuferzellanreicherung und subretinale Transplantation zuverlässige und vielversprechende Techniken für die Entwicklung einer regenerativen therapeutischen Strategie zur Behandlung der Netzhautdegeneration.

Protokoll

Ethische Nutzung und Pflege von Tieren Aussage:

Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Gesetzen der Europäischen Union und der Deutschen (Tierschutzgesetz) durchgeführt und hielten sich an die ARVO-Erklärung zur Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung. Alle Tierversuche wurden von der Tierethikkommission der TU Dresden und der Landesdirektion Dresden genehmigt (Zulassungsnummer: 24D-9168.11-1/2008-33).

1. Vor dem Starten der Zelldissoziation und Zellsortierung

1. Etikettieren Sie drei 15 ml Reaktionsröhrchen mit: Waschen (W), Positiver Bruch (+) und Negativfraktion (-).

2. Netzhautdissoziation

1. Enthaupten Sie die PN 4 Welpen mit einer Schere.
2. Spülen Sie den Kopf der Welpen kurz in 70% Ethanol gefolgt von Waschen in PBS.
3. Übertragen Sie den Kopf auf kalte HBSS und enukleate das Auge (wiederholen Sie diesen Schritt für alle Köpfe). Um zu enukleieren, öffnen Sie die Augenlider und fixieren Sie das Auge mit gekrümmten Zangen an der Sehnervenregion. Ziehen Sie dann das Auge vorsichtig aus dem Orbit.
4. Nachdem Sie alle Augen eingeschlossen haben, isolieren Sie die Netzhaut: führen Sie eine geschlossene Schere in den Sehnerv ein und öffnen Sie die Klingen. Peal die RPE / chorid aus. Entfernen Sie die Linsen und Blutgefäße mit gebogenen Zangen.
5. Übertragen Sie die isolierten Netzhaut in ein 1,5 ml Reaktionsrohr, das die Papainlösung enthält (bereitgestellt durch das Papain-Dissoziationskit).
6. Inkubieren Sie die Netzhaut in der Papainlösung für 30-60 min in einem Wasserbad oder Shaker (400 Rpm) bei 37 °C.
   1. Während Die Netzhaut in der Papainlösung brütet, pipette 1 ml Ovomucoidlösung zu einem 15 ml Reaktionsröhrchen (Label "1").
   2. Fügen Sie 60 l DNase I (10 mg/ml) + 60 l Ovomucoid-Lösung (vom Kit bereitgestellt) + 520 l EBSS in ein 15 ml Reaktionsröhrchen (Label "2" ) ein.
7. Nach der Papain-Inkubation die Papainlösung mit den teilweise verdauten Netzhaut in die Reaktionsröhre "2" übertragen.
8. Mit einer feuerpolierten Pipette, führen Sie mechanische Dissoziation (10x nach oben und unten).
9. Pipette die einzellige Suspension zu Reaktionsrohr "1". Versuchen Sie, 2 Schichten zu erzeugen, indem Sie die Zellsuspension vorsichtig auf die Ovomucoid-Lösung schichten.
10. Zentrifuge für 5 min bei 300 x g (ca. 1.300 U/min).
11. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in 500 l MACS-Puffer wieder aus.

3. Zellsortierung mit magnetisch zugeordneter Zellsortierung (MACS)

1. Fügen Sie den Anti-CD73-Antikörper von X l Ratte zu den 500 l hinzu, um eine Endkonzentration von 10 g/ml zu erreichen.
2. 5 min auf Eis inkubieren.
3. Füllen Sie das 15 ml Reaktionsröhrchen mit MACS-Puffer auf 10 ml und zentrifugieren Sie es 5 min bei einer Geschwindigkeit von 300 x g.
4. Entfernen Sie den Überstand.
5. Setzen Sie das Pellet in 480 l MACS-Puffer wieder auf und fügen Sie 120 l Ziegen-Anti-Ratten-IgG-Mikroperlen hinzu.
6. 15 min auf Eis inkubieren; nicht rühren, schütteln oder mischen.
7. Füllen Sie das 15 ml Reaktionsröhrchen mit MACS-Puffer auf 5 ml und zentrifugieren Sie es 5 min bei 300 x g.
8. Da das Reaktionsrohr zentrifugiert ist:
   1. Stellen Sie eine LS-Säule in den magnetischen Ständer ein.
   2. Setzen Sie den Vortrennfilter auf die LS-Säule.
   3. Hydratisieren Sie den Vortrennfilter und die LS-Säule mit 3 ml MACS-Puffer und sammeln Sie den MACS-Puffer in das Waschrohr (W).
9. Entfernen Sie den Überstand.
10. Setzen Sie das Pellet im 500-l-MACS-Puffer wieder auf.
11. Laden Sie die 500-l-Zellsuspension in den Filter, fügen Sie dem Filter 1 ml MACS-Puffer hinzu und sammeln Sie den negativen Bruch in das negative Bruch (-) Reaktionsrohr.
12. Fügen Sie als Nächstes 3 x 3 ml MACS-Puffer zur Spalte hinzu, um die Zellen abzuwaschen, die nicht an die Spalte gebunden sind.
13. Sobald diese 9 ml durch die LS-Säule sind, entfernen Sie die Säule aus dem magnetischen Ständer und installieren Sie sie auf dem positiven Bruch (+) Reaktionsrohr.
14. Laden Sie schnell 5 ml MACS-Puffer in die LS-Säule und legen Sie den Kolben in die LS-Säule und drücken Sie ihn nach unten, bis der gesamte Puffer durch die Spalte ist.
15. Zentrifugieren Sie das Reaktionsrohr, das die positive Fraktion für 5 min bei 300 x g enthält.
16. Den Überstand entfernen, in 500 l MACS-Puffer wieder aufhängen und bei 4 °C halten.
17. Zählen Sie die Gesamtanzahl der Zellen mit einem gemeinsamen Zellzählgerät.
18. Bereiten Sie eine Zellsuspension aus der positiv sortierten Fraktion vor, die 2 x 10⁵ Zellen/l im MACS-Puffer enthält, und halten Sie sie bei 4 °C

4. Transplantation von MAC-sortierten Photorezeptor-Vorläuferzellen in die Maus-Retina

1. Stellen Sie sicher, dass alle folgenden Lösungen bereit sind: 1 ml sterile PBS oder HBSS, 10 l DNAse I, 1-2 ml steril deionisiert H₂O, Aliquots der Zellsuspensionsfraktionen bei 4 °C.
2. Anästhetisieren Sie die erwachsene Maus(d. h. 2-4 Monate alt) mit einer intraperitonealen Injektion von Medetomidinhydrochlorid (0,01 mg/10 g Körpergewicht), Ketamin (0,75 mg/10 g Körpergewicht). Dann eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0,05 mg/kg Körpergewicht) zur Schmerzlinderung.
3. Delate Schüler mit einem Rückgang von Phenylephrin 2,5%-Tropicamid 0,5%.
4. Fix Maus in Mauskopfhalter und unter Stereomikroskop platzieren.
5. Tragen Sie einen Tropfen Visidisches Gel auf, um eine Trocknung des Auges zu verhindern.
6. Machen Sie ein kleines Loch an der Grenze zwischen Sklera und Hornhaut (bzw. ora serrata) mit einer sterilen 30 G 1/2 in der Nadel.
7. Schneiden Sie eine gemeinsame Abdeckung gleiten in kleine (ca. 5 mm x 5 mm) Stücke mit einem Diamant-Stift, legen Sie eines dieser Stücke auf die Hornhaut, so dass eine direkte Visualisierung der Netzhaut.
8. Spülen Sie die vorsterilisierte Mikroliterspritze mehrmals mit entionisiertem Wasser.
9. Die Mikroliterspritze mit 1 l Zellsuspension beladen, die Nadel tangential durch die Bindehaut und Sklera leiten und unter visueller Kontrolle in die Nasenhälfte der Netzhaut stellen.
10. Punch sanft ein Loch in die Netzhaut, bis er den subretinalen Raum erreicht, injizieren Sie die Zellsuspension in den subretinalen Raum.
11. Beobachten Sie die bullöse Ablösung der Netzhaut, die einheitlich sein sollte und etwa 1/4 des Netzhautraums ohne Blutungen abdeckt.
12. Ziehen Sie die Spritze sanft zurück, das Netzhautloch versiegelt automatisch.
13. Spülen Sie die Mikroliterspritze mehrmals mit entionisiertem Wasser.
14. Lösen Sie die Maus vom Kopfhalter.
15. Wecken Sie die Maus durch Injektion von Atipamozolhydrochlorid zur Umkehrung des Medetomidin-Hydrochlorideffekts.
16. Die Maus für die Aufwachzeit in eine warme dunkle Kammer (ca. 25 °C) stellen.
17. Die nächsten 2 Tage nach der Transplantation sollte Buprenorphin (0,05 mg/kg Körpergewicht) morgens und nachmittags zur Schmerzlinderung subkutan verabreicht werden.

Ergebnisse

Um die Fähigkeit von Stabphotorezeptoren zur Integration in die Mausnetzhaut zu beurteilen, wurde eine Mausreporterlinie verwendet, in der GFP vom neuronalen Retina-Leucin-Reißverschluss (Nrl, Nrl-GFP) Promotor¹¹angetrieben wird. Nrl ist der früheste Marker von Stabphotorezeptoren, die seine Expression bei E12.5 während des gesamten Erwachsenenalters beginnen, was eine spezifische Kennzeichnung von Spenderstab-Photorezeptorzellen ermöglicht.

PN 4 Nrl-GFP Welpen wurden enthauptet und...

Diskussion

Die subretinale Transplantation von Photorezeptor-Vorläuferzellen stellt ein zuverlässiges Werkzeug dar, um die Integration dieser lichtempfindlichen Zellen in die Wirtsnetzhaut in signifikanten Zahlen^1,2zu erreichen. Dies könnte die Etablierung einer Zelltherapie zur Behandlung von netzretinalen degenerativen Erkrankungen in Zukunft ermöglichen⁶. Die Spenderpopulation von Zellen, die derzeit aus PN 4-Retinas isoliert ist, ist eine Mischung aus verschiedenen Zelltypen, aus der sich nach subretinaler Injektion nur die Ph...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Papain-Dissoziationssystem	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	geliefert DNase I wird nicht in der Methode
verwendet Gereinigte Ratte Anti-Maus CD73, Klon TY/23	BD Pharmingen	550738	Stammkonzentration 0,5 mg/ml
Ziege Anti-Ratte IgG MikroBeads	Miltenyi	130-048-501	Gesamtvolumen von 2 ml
PBS	Gibco	10010-015	Zur Zählung der Gesamtzahl der Zellen
DNase I	Sigma	D5025-150KU
HBSS	Gibco	14025050	Zur Dissoziation der Netzhaut
Trypanblau	Sigma	Fluka93595	Zur Zählung der Gesamtzahl der Zellen
Vidisic	Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
Domitor	Pfizer	76579
Ketamin 10%	Ratiopharm	7538843
Antisedan	Pfizer	76590
Phenylephrin 2,5%-Tropicamid 0,5%	Universitätskliniken Dresden Apotheke
Vorabscheidefilter	Miltenyi	130-041-407
LS Säulen	Miltenyi	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi	130-042-303
QuadroMACS Separator	Miltenyi	130-090-976
Feuerpolierglas Pasteur-Pipette	Marke	74777 20	Die Pipette Die Spitzen müssen feuerpoliert und autoklaviert werden.
MACS 15 ml Röhrchengestell	Miltenyi	130-091-052
Zellzahlkammer	Carl Roth	T728.1
Sterile 15 ml Röhrchen	Greiner Bio-One	188271
Leica M651 MSD Leica M651 MSD			kann anstelle von Olympus SZX10 verwendet werden
Olympus SZX10	Olympus	SZX10	kann anstelle von Leica M651 MSD
verwendet werdenOlympus inverses Stereomikroskop CKX41	Olympus	CKX41
Zellkulturhaube Thermo Scientific MSC-Advance	Thermo Scientific	51025411
1,5 ml Reaktionsröhrchen	Sarstedt	727706400
2 ml Reaktionsröhrchen	Sarstedt	72695
Eppendorf Centrifuge 5702	VWR (Eppendorf)	521-0733
Mauskopfhalter	myNeurolab	471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 in	BD Pharmingen	304000
Hamilton Mikroliter Spritze 5 & Mikro; l, 75RN	Hamilton	065-7634-01	wird ohne Nadeln geliefert
Hamilton RN Spezialnadel 34 G	Hamilton	065-207434	Blunt, 12 mm Länge
Vannas-Tü bingen Federschere - 5 mm Klingen Gerade	Fine Science Tools	15003-08
Dumont #7 Pinzette - Titanium Biologie	Fine Science Tools	11272-40
Diamond Pen	Tools-tech
15 mm x 15 mm Deckgläser	Sparks	MIC3366