Subretinale Transplantation von MACS gereinigten Photorezeptor-Vorläuferzellen in die adulte Maus-Retina

Zusammenfassung

Die Zelltransplantation stellt eine Strategie zur Behandlung der Netzhautdegeneration dar, die durch Photorezeptorverlust gekennzeichnet ist. Hier beschreiben wir eine Methode zur Anreicherung von transplantierbaren Photorezeptoren und deren subretinaler Transplantation in erwachsene Mäuse.

Zusammenfassung

Sehstörungen und Erblindung durch den Verlust der lichtempfindlichen Zellen der Netzhaut, d.h. Photorezeptoren, stellen den Hauptgrund für behinderungen in Industrieländern dar. Der Ersatz degenerierter Photorezeptoren durch Zelltransplantation stellt eine mögliche Behandlungsoption in zukünftigen klinischen Anwendungen dar. Tatsächlich haben jüngste präklinische Studien gezeigt, dass unreife Photorezeptoren, die am 4. Tag der Neugeborenen mausisoliert wurden, das Potenzial haben, sich nach subretinaler Transplantation in die netzretinale Netzhaut der erwachsenen Maus zu integrieren. Spenderzellen erzeugten eine ausgereifte Photorezeptormorphologie mit inneren und äußeren Segmenten, einem runden Zellkörper an der äußeren Kernschicht und synaptischen Terminals in unmittelbarer Nähe zu endogenen bipolaren Zellen. Tatsächlich haben jüngste Berichte gezeigt, dass Spenderphotorezeptoren sich funktionell in die neuronalen Schaltkreise von Wirtsmäusen integrieren. Für eine zukünftige klinische Anwendung eines solchen Zellersatzansatzes müssen gereinigte Suspensionen der Zellen der Wahl erzeugt und an die richtige Position für eine ordnungsgemäße Integration in das Auge gebracht werden. Für die Anreicherung von Photorezeptor-Vorläufern sollte die Sortierung auf bestimmten Zelloberflächenantigenen basieren, um eine genetische Reporterveränderung von Spenderzellen zu vermeiden. Hier zeigen wir magnetisch-assoziierte Zellsortierung (MACS) - Anreicherung von transplantierbaren Stabphotorezeptor-Vorläufern, die aus der neonatalen Netzhaut von photorezeptorspezifischen Reportermäusen auf Basis des Zelloberflächenmarkers CD73 isoliert sind. Die Inkubation mit Anti-CD73-Antikörpern gefolgt von mikro-bead-konjugierten sekundären Antikörpern ermöglichte die Anreicherung von Rod-Photorezeptor-Vorläufern durch MACS auf ca. 90%. Im Vergleich zur Durchflusszytometrie hat MACS den Vorteil, dass es einfacher auf GMP-Standards angewendet werden kann und dass große Mengen an Zellen in relativ kurzen Zeiträumen sortiert werden können. Die Injektion angereicherter Zellsuspensionen in den subretinalen Raum erwachsener Wildtypmäuse führte zu einer 3-fach höheren Integrationsrate im Vergleich zu unsortierten Zellsuspensionen.

Einleitung

Vision ist einer der wichtigsten Sinne des Menschen. Beeinträchtigung dieses Sinns und Blindheit sind einer der Hauptgründe für Behinderungen in Industrieländern. Die vorherrschende Ursache für Sehbehinderung oder Erblindung ist die Netzhautdegeneration, die durch Photorezeptorzellverlust gekennzeichnet ist, da sie bei Makuladegeneration, Retinitis pigmentosa, Kegelstabdystrophie und anderen Bedingungen beobachtet werden kann. Bis heute ist eine wirksame Therapie zur Wiederherstellung des verlorenen Sehvermögens nicht verfügbar. In den Jahren 2006 und 2008 berichteten zwei verschiedene Labore unabhängig voneinander über eine erfolgreiche Transplantation von Rod-Photorezeptor-Vorläuferzell....

Protokoll

Ethische Nutzung und Pflege von Tieren Aussage:

Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Gesetzen der Europäischen Union und der Deutschen (Tierschutzgesetz) durchgeführt und hielten sich an die ARVO-Erklärung zur Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung. Alle Tierversuche wurden von der Tierethikkommission der TU Dresden und der Landesdirektion Dresden genehmigt (Zulassungsnummer: 24D-9168.11-1/2008-33).

1. Vor dem Starten der Zelldissoziation und Zellsortierung

1. Etikettieren Sie drei 15 ml Reaktionsröhrchen mit: Waschen (W), Positiver Bruch (+) und Negativfraktion (-).

Ergebnisse

Um die Fähigkeit von Stabphotorezeptoren zur Integration in die Mausnetzhaut zu beurteilen, wurde eine Mausreporterlinie verwendet, in der GFP vom neuronalen Retina-Leucin-Reißverschluss (Nrl, Nrl-GFP) Promotor¹¹angetrieben wird. Nrl ist der früheste Marker von Stabphotorezeptoren, die seine Expression bei E12.5 während des gesamten Erwachsenenalters beginnen, was eine spezifische Kennzeichnung von Spenderstab-Photorezeptorzellen ermöglicht.

PN 4 Nrl-GFP Welpen wurden enthauptet und.......

Diskussion

Die subretinale Transplantation von Photorezeptor-Vorläuferzellen stellt ein zuverlässiges Werkzeug dar, um die Integration dieser lichtempfindlichen Zellen in die Wirtsnetzhaut in signifikanten Zahlen^1,2zu erreichen. Dies könnte die Etablierung einer Zelltherapie zur Behandlung von netzretinalen degenerativen Erkrankungen in Zukunft ermöglichen⁶. Die Spenderpopulation von Zellen, die derzeit aus PN 4-Retinas isoliert ist, ist eine Mischung aus verschiedenen Zelltypen, aus der sich nach subretinaler Injektion nur die Ph.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Papain-Dissoziationssystem	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	geliefert DNase I wird nicht in der Methode
verwendet Gereinigte Ratte Anti-Maus CD73, Klon TY/23	BD Pharmingen	550738	Stammkonzentration 0,5 mg/ml
Ziege Anti-Ratte IgG MikroBeads	Miltenyi	130-048-501	Gesamtvolumen von 2 ml
PBS	Gibco	10010-015	Zur Zählung der Gesamtzahl der Zellen
DNase I	Sigma	D5025-150KU
HBSS	Gibco	14025050	Zur Dissoziation der Netzhaut
Trypanblau	Sigma	Fluka93595	Zur Zählung der Gesamtzahl der Zellen
Vidisic	Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
Domitor	Pfizer	76579
Ketamin 10%	Ratiopharm	7538843
Antisedan	Pfizer	76590
Phenylephrin 2,5%-Tropicamid 0,5%	Universitätskliniken Dresden Apotheke
Vorabscheidefilter	Miltenyi	130-041-407
LS Säulen	Miltenyi	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi	130-042-303
QuadroMACS Separator	Miltenyi	130-090-976
Feuerpolierglas Pasteur-Pipette	Marke	74777 20	Die Pipette Die Spitzen müssen feuerpoliert und autoklaviert werden.
MACS 15 ml Röhrchengestell	Miltenyi	130-091-052
Zellzahlkammer	Carl Roth	T728.1
Sterile 15 ml Röhrchen	Greiner Bio-One	188271
Leica M651 MSD Leica M651 MSD			kann anstelle von Olympus SZX10 verwendet werden
Olympus SZX10	Olympus	SZX10	kann anstelle von Leica M651 MSD
verwendet werdenOlympus inverses Stereomikroskop CKX41	Olympus	CKX41
Zellkulturhaube Thermo Scientific MSC-Advance	Thermo Scientific	51025411
1,5 ml Reaktionsröhrchen	Sarstedt	727706400
2 ml Reaktionsröhrchen	Sarstedt	72695
Eppendorf Centrifuge 5702	VWR (Eppendorf)	521-0733
Mauskopfhalter	myNeurolab	471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 in	BD Pharmingen	304000
Hamilton Mikroliter Spritze 5 & Mikro; l, 75RN	Hamilton	065-7634-01	wird ohne Nadeln geliefert
Hamilton RN Spezialnadel 34 G	Hamilton	065-207434	Blunt, 12 mm Länge
Vannas-Tü bingen Federschere - 5 mm Klingen Gerade	Fine Science Tools	15003-08
Dumont #7 Pinzette - Titanium Biologie	Fine Science Tools	11272-40
Diamond Pen	Tools-tech
15 mm x 15 mm Deckgläser	Sparks	MIC3366