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जीन पर्यावरण बातचीत मॉडल पार्किंसंस रोग में अप्रेलता तंत्र अनमास्क करने के लिए

Published: January 7, 2014 doi: 10.3791/50960
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Center for Health Sciences, SRI International, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California-Santa Cruz

Summary

लिपऑक्सीजेनेज (एलओएक्स) आइसोजाइम ऐसे उत्पाद उत्पन्न कर सकता है जो न्यूरोइंफ्लैमेशन और न्यूरोडिजनरेशन को बढ़ा या घटा सकते हैं। एक जीन पर्यावरण बातचीत अध्ययन LOX isozyme विशिष्ट प्रभावों की पहचान कर सकता है । दो LOX isozyme-कमी ट्रांसजेनिक लाइनों में निग्रोस्ट्रिटल क्षति के 1-मिथाइल-4-फिनाइल-1, 2,3, 6-टेट्राहाइड्रोहाइड्रिडीन (एमपीटीपी) मॉडल का उपयोग करना डोपामिनेर्गिक अखंडता और सूजन पर LOX आइसोजिम्स के योगदान की तुलना के लिए अनुमति देता है।

Abstract

लिपऑक्सीजेनेज (LOX) गतिविधि को अल्जाइमर रोग जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में फंसाया गया है, लेकिन पार्किंसंस रोग (पीडी) रोगजनन में इसके प्रभाव को कम समझा जाता है। जीन-पर्यावरण इंटरैक्शन मॉडल में विषाक्तता में विशिष्ट सेलुलर रास्तों के प्रभाव को अनमास्किंग करने में उपयोगिता होती है जिसे केवल आनुवंशिक या विषाक्त रोग मॉडल का उपयोग करके नहीं देखा जा सकता है। मूल्यांकन करने के लिए यदि अलग LOX isozymes चुनिंदा पीडी से संबंधित न्यूरोडिजेनरेशन, ट्रांसजेनिक(यानी 5-LOX और 12/15-LOX कमी) चूहों एक विष है कि विकार में कोशिका की चोट और मौत की नकल के साथ चुनौती दी जा सकती है योगदान । यहां हम एक न्यूरोटॉक्सिन के उपयोग का वर्णन करते हैं, 1-मिथाइल-4-फिनाइल-1, 2, 3, 6-टेट्राहाइड्रोहाइड्रिडीन (एमपीटीपी), जो पीडी से संबंधित न्यूरोडिजेनरेशन के लिए LOX आइसोज़िम्स के विशिष्ट योगदान को स्पष्ट करने के लिए एक निग्रोस्ट्रिटल घाव पैदा करता है। माउस में एमपीटीपी का उपयोग, और अमानवीय रहनुमा, पीडी में निग्रोस्ट्रियाटल क्षति को पुनः प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित है। एमपीटीपी-प्रेरित घाव की सीमा को डोपामाइन के एचपीएलसी विश्लेषण और इसके मेटाबोलाइट्स और टायरोसिन हाइड्रोक्सीलेज (टीएच) के लिए स्ट्राटम के अर्ध-मात्रात्मक पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा मापा जाता है, जो डोपामाइन के संश्लेषण के लिए दर-सीमित एंजाइम है। भड़काऊ मार्कर का आकलन करने के लिए, जो LOX isozyme-चयनात्मक संवेदनशीलता, ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (GFAP) और आईबीए-1 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को सब्सटेंटिया निग्रा युक्त मस्तिष्क वर्गों पर किया जाता है, और जीएफएपी पश्चिमी दाग विश्लेषण स्ट्रारियल होमोजेनेट पर किया जाता है। यह प्रयोगात्मक दृष्टिकोण जीन-पर्यावरण बातचीत अंतर्निहित निग्रोस्ट्रियाट डिजनरेशन और पीडी में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।

Introduction

जीन-पर्यावरण इंटरैक्शन मॉडल का उपयोग जोखिम कारकों की नकल करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है जो इडियोपैथिक पार्किंसंस रोग (पीडी) को प्रभावित करते हैं और मशीनी अंतर्दृष्टि को समझने का अवसर प्रदान करता है जो अकेले आनुवंशिक या विषाक्त प्रणाली के उपयोग से स्पष्ट होने की संभावना नहीं है1,2। यहां हम इस बिंदु को स्पष्ट करते हैं और न्यूरोइनफ्लैमेशन और विषाक्तता 4 पर लिपोक्सीजेनेज (LOX) की चयनशीलता को बेहतर ढंग से समझने के लिए निग्रेस्ट्रियाटल डीजनरेशन 3 के 1-मिथाइल-4-फिनाइल-1,2, 3, 6-टेट्राहाइड्रोहाइड्रीडीन (एमपीटीपी) माउस मॉडल के आवेदन का वर्णन करते हैं। जबकि LOX isozymes के लिए एक भूमिका व्यापक रूप से परिधीय विकारों5,6 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्ट्रोक 7 औरअल्जाइमर रोग8,9सहित सीएनएस रोग में मूल्यांकन किया गया है, nigrostriatal समारोह में isozymes के परिवार की भूमिका और पीडी से संबंधित पतन अच्छी तरह से समझ में नहीं आता है और वारंट अध्ययन। एमपीटीपी न्यूरोटॉक्सिन निग्रोस्ट्रिटल पाथवे के तरजीही पतन को दर्शाता है और स्ट्राइटल डोपामाइन की कमी और निट्रिकल डोपामिनेर्गिक सेल हानि को पुनः रीकैपिटल करता है जो पीडी रोगियों में मोटरिक हानि को रेखांकित करता है10। जबकि यह मॉडल नॉनमोटर और मोटर पीडी व्यवहार और फ्रैंक α-सिन्यूक्लिन-पॉजिटिव लेवी बॉडी पैथोलॉजी के पूर्ण संवर्ग को पुन: पेश नहीं करता है, यह उपन्यास मशीनिस्ट लक्ष्यों को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी रहा है जो निग्रोस्ट्रिटल क्षति में योगदान देते हैं और प्रारंभिक चरण के ट्रांसलेशनल टेस्टिंग के लिए क्योंकि यह सबसे अच्छी विशेषता वाले नॉनइनवेसिव मॉडल है जो मज़बूती से निट्रिकल सेल डेथ का उत्पादन करने के लिए उपलब्ध है, साथ ही स्ट्रेटल डोपामाइन लॉस11-15. एमपीटीपी माउस का व्यापक उपयोग, तीव्र, उपकते से लेकर पुरानी 16-18 तक के प्रतिमानों के साथ, उपचार आहार18,21,22के आधार पर विषाक्तता के विभिन्न तंत्रों की सक्रियता के साथ हल्के से गंभीर निग्रोस्ट्रिटल क्षति19,20 के परिणामस्वरूप खुराक के मानकीकरण की अनुमति दी गई है। नतीजतन, यह 'घाव की खिड़की' को लक्षित करने की अनुमति देता है जिसके परिणामस्वरूप चिकित्सीय एजेंट या ट्रांसजेनिक मॉडल के आधार पर23-25का उपयोग किया जाता है।

इसके अलावा अनुवाद और खोज जीव विज्ञान अध्ययन के लिए आवश्यक नुकसान का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया तकनीकों और सबूत इस तरह के तरीकों प्रदान कर रहे हैं । एमपीटीपी माउस मॉडल के लिए, घावों का मूल्यांकन करने के लिए स्थापित मैट्रिक्स स्ट्राइटल डोपामिनेर्गिक टोन के मार्कर के माप हैं, जिसमें एचपीएलसी द्वारा डोपामाइन और इसके मेटाबोलाइट्स शामिल हैं, और टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज (टीएच) के पश्चिमी दाग विश्लेषण, डोपामाइन संश्लेषण में दर-सीमा एंजाइम, और ग्लिएल एक्टिवेशन वेस्टर्न ब्लॉस्ट एनालिसिस और इम्यूनोिथोकेमिस्टरी4 काउपयोग करके अपक्षयी घटनाओं के संकेतक शामिल हैं। यद्यपि ये शास्त्रीय न्यूरोकेमिकल, जैव रासायनिक और हिस्टोलॉजिकल प्रक्रियाएं हैं, तकनीक निग्रोस्ट्रिटल डोपामिनेर्गिक मार्ग के भीतर नुकसान की सीमा पर महत्वपूर्ण और प्रजनन योग्य रीडआउट प्रदान करती है, विषाक्तता के तंत्र को इंगित करती है, और पीडी में अपक्षयी घटनाओं को समझने में मूल्यवान उपकरण साबित हुई हैं।

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Protocol

नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं और पशु देखभाल विधियों को संस्था की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए । यहां वर्णित अध्ययन श्री इंटरनेशनल के आईएसीयूसी द्वारा स्थापित दिशा-निर्देशों के अनुसार किया गया था ।

1. अधिग्रहण और LOX की कमी चूहों के रखरखाव

  1. खरीद 5-LOX-कमी या 12/15-LOX की कमी चूहों और संबंधित तनाव और सेक्स मिलान नियंत्रण 7-8 सप्ताह की उंर में और आगमन के बाद सुविधा के लिए अभिनंदन के लिए कई दिनों की अनुमति ।
  2. 12-h प्रकाश-अंधेरे चक्र पर समूह आवास में चूहों को बनाए रखें और भोजन और पीने के पानी विज्ञापन लिबिटमदें।

2. एमपीटीपी सावधानियां, भंडारण, तैयारी, विसंदूषण और निपटान

नोट: मनुष्यों में नसों में जोखिम से एमपीटीपी नशा पार्किंसंस10का कारण दिखाया गया है ; एमपीटीपी अत्यधिक लिपोफिलिक है और26रक्त-मस्तिष्क बाधा को आसानी से पार कर सकता है। सुरक्षित हैंडलिंग, विषहरण और निपटान सुनिश्चित करने के लिए एहतियाती उपाय किए जाने चाहिए । इसके चयापचय में एंजाइम मोनोमाइन ऑक्सीडेस बी (माओ-बी)27द्वारा 1-मिथाइल-4-फिनाइल-2, 3-डिडिड्रोपिरिडियम में रूपांतरण सहित कई कदम शामिल हैं । माओ-बी अवरोधकों का उपयोग आकस्मिक मानव नशा के मामले में किया जा सकता है।

  1. सुनिश्चित करें कि कामकों को संस्था की स्वास्थ्य और सुरक्षा समिति द्वारा तय एमपीटीपी का उपयोग करने से पहले उचित सुरक्षा और हैंडलिंग प्रशिक्षण हो । प्रत्येक संस्था17,22में व्यापक रूप से उल्लिखित सिफारिशों के आधार पर एमपीटीपी के उपयोग के लिए अपनी मानक परिचालन प्रक्रियाओं को स्थापित और लागू कर सकती है ।
  2. तैयारी से पहले, निम्नलिखित सहित उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) डॉन: डिस्पोजेबल लैब कोट या पूर्ण शरीर सूट, डबल नाइट्रिल दस्ताने, सर्जिकल मास्क, हेयर कवर, सुरक्षा चश्मे, और डिस्पोजेबल जूता कवर। उचित पीपीई एमपीटीपी की तैयारी के दौरान पहना जाना चाहिए, इंजेक्शन प्रतिमान और ७२ घंटे के बाद इंजेक्शन जब जानवरों और/या बिस्तर से निपटने ।
  3. तैयारी से पहले गणना करें। मात्रा को डोज करने के लिए संस्थागत दिशा-निर्देशों का पालन किया जाना चाहिए; 100-150 माइक्रोन की डिलीवरी आमतौर पर 25-30 ग्राम चूहों के लिए उपयोग की जाती है।
    1. खारा में 3 मिलीग्राम/एमएल एमपीटीपी समाधान तैयार करने के लिए, एक सुधार कारक (1.211 एमपीटीपी-एचसीएल: 1.0 एमपीटीपी फ्री बेस) लागू करें; नमकीन वाहन में एमपीटीपी-एचसीएल की सांद्रता 3.633 मिलीग्राम/मिलीलीटर है।
    2. न्यूरोटॉक्सिन को संभालने से पहले एमपीटीपी तैयारी और संभावित फैल विसंदूषण के लिए आवश्यक सभी उपकरण, आपूर्ति और अभिकर्मक तैयार करें।
  4. एमपीटीपी-एचसीएल स्रोत शीशी को उचित भंडारण स्थान से हटाएं।
    नोट: एमपीटीपी को एक माध्यमिक कंटेनर के भीतर एक बंद शीशी में आरटी में बनाए रखा जाना चाहिए, और एक बंद कैबिनेट के भीतर संग्रहीत किया जाना चाहिए, जिसका लेबल "एमपीटीपी" है।
    1. गिरा पाउडर से जोखिम को कम करने के लिए 10% ब्लीच समाधान के साथ घटा पैड या कागज तौलिए के साथ तराजू आसपास के क्षेत्र को कवर । एहतियात के तौर पर आसपास के टिश्यू और 10% ब्लीच सॉल्यूशन रखें।
    2. एक धूम हुड में स्थित एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग करना, 10% ब्लीच से लथपथ ऊतक युक्त माध्यमिक रोकथाम के साथ कांच की शीशी में एमपीटीपी-एचसीएल के 50 मिलीग्राम का वजन करें। एकाग्रता और तारीख के साथ कांच की शीशी "एमपीटीपी" लेबल करें।
    3. स्रोत शीशी बंद करें और 10% ब्लीच के साथ बाहर पोंछें।
  5. धीरे-धीरे शीशी में 13.763 मिलीलीटर बाँझ नमकीन जोड़ें और मिश्रण के लिए पूरी तरह से बंद करें। (समाधान 3.633mg/ml MPTP-HCl है.)
    1. हुड में, 10% ब्लीच-लथपथ ऊतक के साथ एक माध्यमिक कंटेनर के भीतर लेबल इंजेक्शन शीशी में 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करके एमपीटीपी समाधान को सावधानीपूर्वक निष्फल करें। ब्लीच से लथपथ ऊतक के साथ किसी भी फैल साफ।
    2. उचित लेबल वाले बायोहैजार्ड कंटेनर में शार्प्स और शीशी को सावधानी से निपटाएं। पशु प्रक्रिया कक्ष के लिए परिवहन के लिए ब्लीच से लथपथ ऊतक के साथ माध्यमिक कंटेनर में शीशी में एमपीटीपी समाधान बनाए रखें।
      नोट: नसबंदी के लिए एमपीटीपी समाधान को ऑटोक्लेव न करें क्योंकि इसका वाष्पीकरण एक साँस लेना खतरा है।
  6. एमपीटीपी स्रोत शीशी को अपने माध्यमिक कंटेनर में लौटाें और भंडारण स्थान में रखें। 10% ब्लीच का उपयोग करके 10 मिनट के लिए स्पैटुला, विश्लेषणात्मक पैमाने और हुड सतह को दूषित करें।

3. एमपीटीपी प्रशासन

  1. "एमपीटीपी" (माइनस वायर फूड ग्रिल), डिस्पोजेबल पिंजरे लाइनर, पूर्व-गीले खाद्य छर्रों और हाइड्रोजेल को जल स्रोत के रूप में चिह्नित करने वाले मानक माइक्रोइसोलाटर छिद्रित ढक्कन के साथ डिस्पोजेबल पिंजरों को तैयार करें। 15 मिलीग्राम/किलो इंजेक्शन के लिए आवश्यक नमकीन में सभी जानवरों और 3 मिलीग्राम/मिलीलीटर एमपीटीपी की रिकॉर्ड मात्रा का वजन करें ।
    नोट: एमपीटीपी मेटाबोलाइट्स इंजेक्शन28,29के बाद 3 दिनों के लिए मल में पता लगाने योग्य हैं । हालांकि, चूहों एमपीटीपी एन-ऑक्साइड, एक गैर विषैले व्युत्पन्न है कि क्योंकि इसकी हाइड्रोफिलिसिटी30झिल्ली पार नहीं करता है उगलते .
    1. ऊपर सूचीबद्ध सभी पीपीई पहने हुए और एक डिस्पोजेबल अवशोषण पैड पर चूहों पकड़े, इंट्रापेरिटोनियल गुहा (आईपी) में 15 मिलीग्राम/किलो खुराक के लिए खारा वाहन या एमपीटीपी समाधान इंजेक्ट करें, एक डिस्पोजेबल 26-गेज ट्यूबरक्यूलिन सिरिंज के साथ 4 दिनों के लिए दैनिक।
    2. उपयोग के बाद सिरिंज को रीकैप न करें; एक समर्पित और लेबल एमपीटीपी बायोहैजार्डस शार्प्स कंटेनर में निपटाएं। किसी भी आकस्मिक ड्रिप को साफ करने के लिए आस-पास 10% ब्लीच और ऊतकों को बनाए रखें।
  2. डिस्पोजेबल पिंजरों में एमपीटीपी के साथ इंजेक्शन जानवरों को रखें, पिंजरे के प्रति 5 चूहों तक, और खुले रैक पर घर। हवादार रैक का उपयोग न करें।
    1. जगह MPTP पिछले इंजेक्शन के बाद ७२ घंटे तक चूहों और आवास कमरे के दरवाजे युक्त धमकी देकर मांगने पर तख्तियों का उपयोग करें ।
      नोट: आवास कक्ष का तापमान सुनिश्चित करना 22.2 - 24.4ओसी के बीच है, क्योंकि चूहों एमपीटीपी नशे के बाद 12h तक क्षणिक हाइपोथर्मिया का अनुभव करते हैं। 31
    2. प्रत्येक उपयोग के बाद ब्लीच के साथ काम की सतह को दूषित करें (चरण 2.8 देखें), 10% ब्लीच के बराबर मात्रा के अलावा बचे हुए एमपीटीपी समाधान का निपटान करें, और जैव-जर्मी तरल अपशिष्ट के रूप में सामग्री को त्यागें।
    3. समर्पित निपटान बिन में सभी इस्तेमाल किया पीपीई त्यागें। यदि आवश्यक हो, तो निपटान से पहले 10% ब्लीच के साथ स्प्रे करें।
  3. नियमित रूप से जानवरों की जांच करें और इंजेक्शन प्रतिमान के दौरान दैनिक भोजन और पानी के स्रोत को ताज़ा करें और अंतिम इंजेक्शन के बाद 72 घंटे। नोट: हालांकि पिंजरे के बाहर के आसपास के क्षेत्र में कोई संदूषण प्रत्याशित नहीं है, इस क्षेत्र को एहतियात के रूप में ब्लीच समाधान के साथ इलाज किया जाता है (जैसा कि चरण 2.8 में वर्णित है)। इस अवधि के दौरान सभी चूहों और उपकरणों को संभालते समय देखभाल की जानी चाहिए।
    1. अंतिम इंजेक्शन के तीन दिन बाद, सभी पिंजरों और लाइनरों को उचित लेबल वाले बायोहैजार्ड बैग में निपटाएं। जानवरों के लिए नियमित पीपीई और सामान्य आवास का उपयोग फिर से शुरू करें; दरवाजा और शेल्फ तख्तियों को हटा दें।

4. ऊतक संचयन

  1. पिछले एमपीटीपी इंजेक्शन के बाद 7 दिनों में सर्वाइकल अपभ्रंश द्वारा जानवरों को इच्छामृत्यु दें। कोरोनल विमान में 1-मिमी स्लॉट के साथ पूर्व-ठंडा मस्तिष्क मोल्ड का उपयोग करके बर्फ पर मस्तिष्क को तुरंत काटना।
  2. पूर्वकाल संयोजिका के स्तर पर एक पूर्वाभास टुकड़ा 2-मिमी मोटी से स्ट्राटम विच्छेदन।
    1. स्केलपेल का उपयोग करके आसपास के कॉर्टिकल और उपकॉर्टिकल क्षेत्रों को हटा दें। न्यूरोकेमिकल या जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए एक अलग 1.5-मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में प्रत्येक गोलार्द्ध से स्नैप-फ्रीज स्ट्राइटल ऊतक।
  3. कोरोनल प्लेन में मिडब्रेन/हिंडब्रेन को पूर्वकाल हाइपोथैलेमस के स्तर पर ब्लॉक करें और 4% फॉर्मलडिहाइड जलीय समाधान में विसर्जन-फिक्स टिश्यू ।

5. ऊतक प्रसंस्करण

  1. बायोकेमिस्ट्री के लिए प्रक्रिया
    1. 200-μL Tris-EDTA lysis बफर (25mM Tris बेस, में एक अल्ट्रासोनिक सेल बाधित का उपयोग कर एक गोलार्द्ध से स्ट्राटाल ऊतक समरूप 1mM EDTA, 1:100 प्रोटीज और फॉस्फेटे अवरोधक कॉकटेल) 10-12 हर्ट्ज पर 10 दालों के लिए और 1000xgपर 4oC पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र ।
    2. ध्यान से सुपरनेट को एस्पिएरेट करें, और 150-μl lysis बफर में गोली का पुनर्गठन करें। एसडीएस-पेज और वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा बायोकेमिकल विश्लेषण के लिए अंशों का उपयोग किया जाता है।
      नोट: जलीय समाधानों में अस्थिरता के कारण तैयारी के 1 घंटे के भीतर प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधक युक्त बफर का उपयोग करें।
  2. न्यूरोकेमिस्ट्री के लिए प्रक्रिया
    1. एचपीएलसी के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत प्रत्येक नमूने से अन्य गोलार्द्ध से विच्छेदित स्ट्राटम का उपयोग करें। बर्फ पर माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में गल स्ट्रगल स्ट्रगल ऊतक, 500-μl 0.3N परक्लोरिक एसिड (पीसीए) जोड़ें और सोनिकेटर का उपयोग करके समरूप।
      नोट: 0.3N पीसीए के 100 मिलीलीटर बनाने के लिए, 90-मिलीलीटर डीडीएच2ओ को मापें, 100 मिलीलीटर स्नातक सिलेंडर में जोड़ें, 70% पीसीए के 2.58 मिलीलीटर जोड़ें, और 100-मिलीलीटर के निशान पर लाएं। इस नमूना बफर को एक महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. 500-μl बर्फ ठंड 0.3N पीसीए में स्ट्राटाल ऊतक, 10-12 हर्ट्ज पर 10 दालों के लिए और बर्फ पर जगह है । एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए, 10 सेकंड के लिए दूसरी बार नमूनों को शामिल करें, फिर 16,100 xg पर 4ओसी पर 12 मिनट के लिए अपकेंद्रित्रकरें।
    3. तुरंत 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों को सुपरनेट करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। हुड में पैलेट के अंश को हवा-सूखी करें।
    4. इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन के साथ एचपीएलसी द्वारा डोपामाइन और इसके मेटाबोलाइट्स, 3,4-डिहाइड्रोक्सीफेनिलेसिक एसिड (डीओपीएसी) और होमोवेनिलिक एसिड (एचवीए) के माप के लिए उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर सुपरनेटेंट बनाए रखें।
    5. एक बार सूखने के बाद, 0.5N नाओह (500 माइक्रोल) में पैलेट अंश का पुनर्गठन करें, और संक्षेप में सोनीकेट करें। लोरी विधि का उपयोग करके कुल प्रोटीन के निर्धारण के लिए उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर गोली के अंश का पुनर्गठन करें।
  3. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए प्रक्रिया
    1. विसर्जन-फिक्स मध्य और हिंद-मस्तिष्क 4% फॉर्मलडिहाइड जलीय समाधान में रातोंरात ब्लॉक और ग्रेडेड सुक्रोज समाधानों में क्रायोप्रोटेक्ट (फॉस्फेट-बफर खारा (0.01 एम पीबीएस) में 10%; 0.138 एम एनएसीएल, 0.0027 एम केसीएल, और डीडीएच2ओ, पीएच 7.4) 24 घंटे के लिए, फिर ऊतक डूबने तक पीबीएस में 30%) 4 डिग्री सेल्सियस पर। संक्षेप में अतिरिक्त सुक्रोज समाधान को हटाने के लिए क्रायोप्रोटेक्टेड ब्लॉकों को दाग दें, सूखी बर्फ पर फ्रीज करें और उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. क्रायोस्टेट में मध्य और हिंद-मस्तिष्क वाले मस्तिष्क ब्लॉकों की माइक्रोटॉम सेक्शनिंग।
      1. -80 डिग्री सेल्सियस से ऊतकों को हटा दें, क्रायोस्टेट में 1 घंटे के लिए -16 डिग्री सेल्सियस पर बराबर करें, और ऊतक एम्बेडिंग मीडिया में माउंट करें।
      2. क्रायोप्रोप्रोटेक्टेंट समाधान (0.01 M पीबीएस के साथ 30% सुक्रोज, 30% एथिलीन ग्लाइकोल, पीएच 7.4) में -16 डिग्री सेल्सियस पर 40-माइक्रोन मोटाई पर कोरोनल सेक्शन एकत्र करें। ऊतक को 240-उम अंतराल पर 6 1.5-मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में क्रमिक रूप से ले जाएं और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

6. इम्यूनोब्लोटिंग

  1. बीसीए परख द्वारा स्ट्राइटल सुपरनैक्टेंट अंश (धारा 5.1 में वर्णित के रूप में तैयार) में प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने की गणना करें ताकि 20 माइक्रोन मात्रा में अच्छी तरह से वितरित 10 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से पैदा हो सके।
  3. 1X लैम्ली बफर समाधान में 10 माइक्रोग्राम प्रोटीन उपज के लिए 4X लेम्मली बफर और समरूपता बफर के साथ पतला सुपरनाटेंट प्रोटीन। उदाहरण गणना:
    1. प्रोटीन और आवश्यक मात्रा की अंतिम एकाग्रता निर्धारित करें। इस मामले में, 20 माइक्रोन (0.5 मिलीग्राम प्रति मिलीग्राम) में 10 माइक्रोग्राम की आवश्यकता होती है।
    2. प्रोटीन समाधान की अंतिम मात्रा निर्धारित करें। हालांकि लोडिंग के लिए 20 माइक्रोन की आवश्यकता होती है, अतिरिक्त मात्रा (30 माइक्रोल) तैयार की जानी चाहिए।
    3. चूंकि अंतिम मात्रा और एकाग्रता ज्ञात है, और प्रोटीन सुपरनैंट अंश की एकाग्रता ज्ञात है (बीसीए परख द्वारा निर्धारित), समीकरण का उपयोग करके आवश्यक प्रोटीन सुपरनैंट की मात्रा की गणना करें:
      Vसुपरनैंट = (वीअंतिम एक्स सीफाइनल)/सी सुपरनॉट
      इस प्रकार, 1.5 मिलीग्राम प्रति मिलीग्राम की एक सुपरनैंट प्रोटीन एकाग्रता के लिए,
      Vसुपरनेटेंट = (30 माइक्रोन x 0.5 मिलीग्राम/मिलीलीटर) /1.5 मिलीग्राम/मिलीलीटर
      वीसुपरनैंट = 10 माइक्रोन
    4. 30 माइक्रोन वॉल्यूम (30 माइक्रोल / 4 = 7.5 माइक्रोन) में 1x एकाग्रता पैदा करने के लिए आवश्यक 4X लैमली बफर की मात्रा की गणना करें। नोट: 4X लैमली बफर को नमूना तैयार करने में 1X ताकत से पतला किया जाना चाहिए।
    5. 30 माइक्रोन में मात्रा लाने के लिए आवश्यक समरूपता बफर की मात्रा की गणना करें (और 0.5 मिलीग्राम/मिलीलीटर की वांछित अंतिम प्रोटीन एकाग्रता प्राप्त करें):
    6. भंवर से नमूना तैयार करें फिर 12.5 माइक्रोन होमोजेनाइजेशन बफर में प्रोटीन सुपरनेटेंट के 10 माइक्रोन को पाइपिंग करें। 30-माइक्रोन नमूना कार्य समाधान और 0.5 मिलीग्राम/मिलीलीटर एकाग्रता के लिए 4X लेम्मली बफर का 7.5 माइक्रोन जोड़ें।
  4. वर्णित प्रक्रिया, भंवर और 5 मिनट के लिए फोड़ा का उपयोग कर सभी नमूनों को तैयार करें।
    नोट: उबलते के दौरान दबाव के कारण रिसाव और खुलने से रोकने के लिए स्क्रू-टॉप माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब का उपयोग करें।
  5. 5 मिनट के बाद, तुरंत बर्फ पर रखें। लोड 20 μl प्रति जेल अच्छी तरह से नमूना काम समाधान (प्रोटीन के 10 माइक्रोन) । 12% ट्रिस-ग्लाइसिन जेल पर एसडीएस-पेज द्वारा अलग प्रोटीन नमूने।
    1. आणविक वजन की पुष्टि के लिए एक पूर्व दाग प्रोटीन सीढ़ी का प्रयोग करें। रनिंग बफर 25 एमएम ट्रिस-बेस, 192 एमएम ग्लाइसिन, 0.1% एसडीएस और डीडीएच2ओ, पीएच 8.3 है।
    2. इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग प्रोटीन: प्रोटीन को हल करने के लिए कुओं (10 मिनट) और 125 वी (लगभग 1 घंटे; जब तक प्रोटीन सीढ़ी पूरी तरह से अलग हो जाती है) को साफ करने के लिए 80 वी पर चलाएं।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात 40 वी के लिए ट्राइस-ग्लाइसिन ट्रांसफर बफर (25 एमएम ट्रिस, 192 एमएम ग्लाइसिन, 0.04% एसडी, 20% मेथनॉलॉल और डीडीएच2ओ, पीएच 8.3) में 0.2 माइक्रोन नाइट्रोसेल्यूलोस झिल्ली का उपयोग करके प्रोटीन-टू-नाइट्रोसेल्यूलोस ट्रांसफर करें।
  7. 1x Tris खारा में नाइट्रोसेल्यूलोज दाग धोएं (टीएस; 25mM Tris, ०.९% NaCl में ddH2O, पीएच ७.४) में आरटी में 10 मिनट के लिए । 5 मिनट के लिए Ponceau एस में lncubate तो ddH2O में कुल्ला समकक्ष प्रोटीन लोडिंग का एक मोटा सत्यापन प्रदान करने के लिए । PBS का उपयोग कर नोटबुक और destain के लिए रिकॉर्ड बनाए रखने के लिए छवि स्कैन करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, मिल्ली-क्यू या एचसीएल युक्त ddH2O में दाग धोएं (0.2%) लगभग 5 मिनट के लिए। रिकॉर्ड के लिए स्कैन करें। बाद के इनक्यूबेशन चरण (यानी अवरुद्ध बफर में जगह) द्वारा झिल्ली से Ponceau एस दाग निकालें।
  8. टी में 1 घंटे के लिए टीएस में 5% गैर वसा वाले दूध पाउडर में ब्लॉक दाग और खरगोश एंटी-टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज (1:1000),एंटी-β-ऐक्टिन(1:200) के साथ 4ºC पर 24h को इनक्यूबेट करें; 5% मिल्क-टीएस में एंटी-जीएफएपी (1:1000)।
  9. टीएस में 0.05% ट्वीन-20 और 1 x 5 मिनट के साथ टीएस में 3 x 5 मिनट धोएं, फिर एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (5% दूध युक्त टीएस में 1:5000) में इनक्यूबेट, प्राथमिक की प्रजातियों से मेल खाती है, आरटी में 2 घंटे के लिए।
  10. ल्यूमिनॉल और पेरोक्साइड समाधानों की समान मात्रा का उपयोग करके केमिल्यूमिनेसेंट सब्सट्रेट तैयार करें और 1-3 मिनट के लिए लागू करें। एक अंधेरे कमरे में, फिल्म एक्सपोजर के लिए एक प्लास्टिक की आस्तीन में दाग जगह है और फिल्म के लिए बेनकाब; फिल्म तो एक स्वचालित प्रोसेसर का उपयोग कर विकसित किया जाता है।
  11. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्ट्रिपिंग बफर के साथ स्ट्रिप ब्लॉट्स, टीएस में 0.05% ट्वीन-20 के साथ 3x 10 मिनट धोएं, और टीएस में 1x 10 मिनट और फिर नियंत्रण या ब्याज के अन्य प्रोटीन को लोड करने के लिए फिर से पैदा करें।
  12. ऑप्टिकल घनत्व माप के लिए छवि जे सॉफ्टवेयर द्वारा संकेतों की मात्रा निर्धारित करें और आंतरिक लोडिंग नियंत्रण β-ऐक्टिन को सामान्य करें।

7. न्यूरोकेमिस्ट्री

  1. विश्लेषण के लिए ऊतक धारा 5.2 में ऊपर वर्णित के रूप में तैयार किया जाता है। कृपया मोबाइल चरण नुस्खा के लिए तालिका 1 का उल्लेख करें।
    नोट: सभी अभिकर्णों ≥99.0% शुद्ध और एचपीएलसी ग्रेड का होना चाहिए। स्वच्छ, समर्पित ग्लासवेयर और हलचल सलाखों के साथ बफर अखंडता सुनिश्चित करें। मोबाइल चरण बफर तैयार करने के सात दिनों के भीतर उपयोग किया जाना चाहिए।
    1. डिहाइड्रोजन फॉस्फेट और साइट्रिक एसिड का वजन करें, डीडीएच 2 ओ के 1 एल जोड़ें और2-एलस्नातक सिलेंडर में मिलाएं। 0.22-μm जीएसटीएफ झिल्ली के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें।
      नोट: यह फॉस्फेट और साइट्रिक एसिड में संदूषकों की निकासी को अधिकतम करता है, जो पृष्ठभूमि धाराओं को कम करने में मदद करता है।
    2. एसिटोनिट्रिल और ईडीटीए समाधान के बाद ओएसए जोड़ें। पीएच को फॉस्फोरिक एसिड के साथ 3.0 में समायोजित करने से पहले एचपीएलसी ग्रेड डीएच2ओ को लगभग 1900 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. 2-एलनिशान के लिए एचपीएलसी ग्रेड ddH 2 O जोड़ें, और फिर एक 2-एल फ्लास्क में डालना । एक समर्पित हलचल बार जोड़ें, और > 10 मिनट के लिए वैक्यूम के तहत सरगर्मी से मोबाइल चरण degas ।
  2. डोपामाइन के लिए मानक तैयार करें, और मानक घटता के लिए DOPAC और HVA। मानकों के स्टॉक समाधान 03 एन पीसीए में 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर पर तैयार किए जाते हैं।
    1. डोपामाइन-एचसीएल का वजन 12.4 मिलीग्राम हो, और 1 मिलीग्राम/मिलीग्राम डोपामाइन बनाने के लिए 0.3 एन पीसीए का 10.0 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. डोपीएसी का 10.0 मिलीग्राम वजन करें, और 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर DOPAC बनाने के लिए 0.3 एन पीसीए के 10.0 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. वजन 10.0 मिलीग्राम एचवीए, और 1 मिलीग्राम/
  3. स्टॉक समाधानों से काम मानक समाधान तैयार करें। एकाग्रता वक्र उत्पन्न करने के लिए पांच सूत्री मानकों का उपयोग किया जाता है।
    1. स्ट्रीटल डोपामाइन की माप के लिए 12.5 एनजी/एमएल, 25 एनजी/एमएल, 50 एनजी/एमएल, 100 एनजी/एमएल और 200 एनजी/एमएल की स्टैंडर्ड सांद्रता तैयार करें।
    2. स्ट्रीटल डीओपीएसी के लिए 2.5 एनजी/एमएल, 5 एनजी/एमएल, 10 एनजी/एमएल, 20 एनजी/एमएल और 40 एनजी/एमएल की स्टैंडर्ड सांद्रता तैयार करें ।
    3. स्ट्रीटल एचवीए के लिए 5 एनजी/एमएल, 10 एनजी/एमएल, 20 एनजी/एमएल, ४० एनजी/एमएल और ८० एनजी/एमएल की स्टैंडर्ड सांद्रता तैयार करें ।
    4. पांच सूत्री मानकों को उत्पन्न करें: 0.3N पीसीए का उपयोग करके 5 माइक्रोन/एमएल के लिए 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर डोपामाइन स्टॉक समाधान को पतला करें। पतला 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर DOPAC स्टॉक समाधान 1 μg/ml 0.3N पीसीए का उपयोग कर, और पतला 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर HVA स्टॉक समाधान 0.3N पीसीए का उपयोग कर 2 μg/ml ।
    5. 5 माइक्रोग्राम/एमएल डोपामाइन के 1 मिलीलीटर, 1 μg/ml DOPAC के 1 मिलीलीटर, और 2 माइक्रोन/एमएल एचवीए के 1 मिलीलीटर को 25 मिलीलीटर वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में स्थानांतरित करें और वॉल्यूम को 0.3 एन पीसीए के साथ 25 मिलीलीटर के निशान तक लाएं।
      नोट: वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में मिश्रित मानकों में पांच सूत्री मानकों की उच्चतम सांद्रता होती है: २०० एनजी/एमएल डोपामाइन, ४० एनजी/एमएल DOPAC, और ८० एनजी/एमएल एचवीए ।
    6. मिश्रित मानकों के 1 मिलीलीटर को साफ 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। बाद के चार सूत्री मानकों को उत्पन्न करने के लिए चार बार 1:1 धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।
      1. उदाहरण के लिए, मिश्रित मानकों के 250 माइक्रोन के लिए, मूल सांद्रता के 50% पर मिश्रित मानकों का उत्पादन करने के लिए नमूना बफर और भंवर के 250 माइक्रोन को अच्छी तरह से जोड़ें; वांछित कमजोर पड़ने तक दोहराने की प्रक्रिया।
  4. एचपीएलसी सिस्टम (पंप, ऑटोसंप्लर, रिवर्स-फेज कॉलम (C18, 150×3.2 मिमी, 3 माइक्रोन)) तैयार करें। एचपीएलसी प्रणाली में पिछले सभी समाधानों को बदलने के लिए ताजा मोबाइल चरण के साथ पंप को शुद्ध करें और ताजा मोबाइल चरण के साथ हवा के बुलबुले फंस गए। ऑटोसम्पलर को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। कॉलम को 35 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें, जो कुल दबाव को कम करता है।
    1. इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्टर के पहले और दूसरे इलेक्ट्रोड के लिए क्रमशः -150 mV और 220 mV पर वोल्टेज सेट करें। 0.2 मिलीलीटर/मिनट की प्रवाह दर पर मोबाइल चरण के साथ कम से कम 2 घंटे के लिए प्रणाली को बराबर करें, और आदर्श रूप से रातोंरात।
      नोट: संतुलन के दौरान कोशिकाओं पर होना चाहिए, और बेसलाइन पढ़ने की निगरानी की । स्थिर पठन इंगित करता है कि सिस्टम उपयोग करने के लिए तैयार है। समतुल्यता चरण के दो घंटे के लिए, मोबाइल चरण को पुनः प्राप्त करने के बजाय एक अपशिष्ट कंटेनर में जाने दें। इस अवधि के बाद, मोबाइल चरण को संतुलन के लिए रातोंरात पुनर्नवीनीकरण किया जा सकता है।
    2. एक बार संतुलन पूरा हो जाने के बाद, मोबाइल चरण प्रवाह दर को 0.6 मिलीलीटर/मिनट तक समायोजित करें। पांच सूत्री मानकों में से प्रत्येक के 20 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
  5. बर्फ पर स्ट्रगल स्ट्रीटल नमूने, और एचपीएलसी सिस्टम में प्रत्येक नमूने के 2 x 20 माइक्रोन इंजेक्ट करें। शुरुआत में मानकों का उपयोग करें और स्ट्राटाल नमूनों के प्रत्येक सेट में बेतरतीब ढंग से।
  6. मानकों और नमूनों द्वारा उत्पादित डोपामाइन, DOPAC, और HVA चोटियों के तहत क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें । अपने इसी मानक के लिए 5 सूत्री वक्र के लिए चोटी के नीचे क्षेत्र की तुलना करके प्रतिधारण समय और उपाय द्वारा विश्लेषण समय और उपाय द्वारा विश्लेषण की पहचान करें ।
  7. धारा 5.2.3 में वर्णित गोली अंश तैयार करें। स्ट्राटाल पेलेट पर लोरी प्रोटीन परख करें। नोट: यह परख एमजी/मिलीलीटर में स्ट्राटाल नमूनों में मौजूद प्रोटीन की मात्रा को मापेगा; इस जानकारी का उपयोग विश्लेषण की एनजी/एमजी एकाग्रता निर्धारित करने के लिए किया जाता है ।

8. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. GFAP/TH दोहरी इम्यूनोफ्लोरेसेंस
    1. -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से खंडित मिडब्रेन युक्त ट्यूबों को हटा दें और आरटी में लाएं। PBS युक्त ट्रे में क्रायोप्रेरर्वरेटिव समाधान से सब्स्टाटिया निग्रा युक्त ऊतक अनुभागों को हटा दें।
    2. पॉलीस्टीरिन आवेषण में ऊतक अनुभागों को पॉलीएस्टर जाल नीचे से फ्री-फ्लोटिंग इम्यूनोकेमिस्ट्री के लिए रखें। पीबीएस में 3 x 5 मिनट धोएं।
    3. प्रत्येक कुएं में 180-μl ब्लॉक समाधान (5% सामान्य गधा सीरम, 1% पीवीपी, 1% बीएसए और 0.3% ट्राइटन एक्स-100) के साथ 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित अनुभाग। आरटी में ४० मिनट इनक्यूबेट ।
      नोट: सभी धोने और इनक्यूबेशन कदम शेखर पर प्रकाश आंदोलन के साथ किया जाता है ।
    4. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (180 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह) वाले कुओं में अनुभाग स्थानांतरित करें। प्राथमिक एंटीबॉडी कॉकटेल में इनक्यूबेट, खरगोश विरोधी GFAP (1:1000) और भेड़ विरोधी TH (1:400) 1% बीएसए और 0.3% TX-100 के साथ पीबीएस में पतला, 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए। प्राथमिक प्रजातियों से आईजीजी नकारात्मक इम्यूनोदाता नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।
    5. माध्यमिक एंटीबॉडी कॉकटेल में इनक्यूबेट (1:200 गधा विरोधी खरगोश 568 और 1:200 फिटसी गधा विरोधी पीबीएस में भेड़ 0.1% TX-100 के साथ) । तैयारी और इनक्यूबेशन के दौरान प्रकाश से समाधान की रक्षा के लिए पन्नी का उपयोग करें; 2 घंटे के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
      1. एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए, प्राथमिक प्रजातियों से आईजीजी में इनक्यूबेट वर्गों को प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए उपयोग की जाने वाली समान एकाग्रता तक पतला किया जाता है।
      2. आरटी में 5 मिनट के लिए 2 एक्स पीबीएस और 1 एक्स टीएस धोएं । माउंट टिश्यू सेक्शन पर प्लस स्लाइड्स पर Hoechst दाग और कवरस्लिप के साथ बढ़ते माध्यम में ।
    6. माध्यमिक एंटीबॉडी कॉकटेल में इनक्यूबेट (1:200 गधा विरोधी खरगोश 568 और 1:200 फिटसी गधा विरोधी पीबीएस में भेड़ 0.1% TX-100 के साथ) । तैयारी और इनक्यूबेशन के दौरान प्रकाश से समाधान की रक्षा के लिए पन्नी का उपयोग करें; 2 घंटे के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
    7. आरटी में 5 मिनट के लिए 2 एक्स पीबीएस और 1 एक्स टीएस धोएं । माउंट टिश्यू सेक्शन पर प्लस स्लाइड्स पर Hoechst दाग और कवरस्लिप के साथ बढ़ते माध्यम में ।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक स्लाइड बॉक्स में भंडारण द्वारा इमेजिंग तक प्रकाश और ऑक्सीकरण से स्लाइड की रक्षा करें।
    9. फ्लोरोसेंट के पृष्ठभूमि स्तर को निर्धारित करने के लिए पहले नकारात्मक नियंत्रण का विश्लेषण करें, फिर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सकारात्मक इम्यूनोरेएक्टिविटी के लिए मूल्यांकन करें।
  2. क्रोमेन वर्षा के साथ Iba1 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
    1. -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से खंडित मिडब्रेन युक्त ट्यूबों को हटा दें और आरटी में लाएं। PBS युक्त ट्रे में क्रायोप्रेरर्वरेटिव समाधान से सब्स्टाटिया निग्रा युक्त ऊतक अनुभागों को हटा दें।
    2. फ्री-फ्लोटिंग इम्यूनोकेमिस्ट्री के लिए पॉलीस्टीरिन आवेषण में ऊतक अनुभाग रखें। पीबीएस में सेक्शन 3 x 5 मिनट धोएं, और एपिटोप रिट्रीवल के लिए सेक्शन को सीधे 12-अच्छी तरह से प्लेट में रखें जिसमें प्री-गर्म 10 एमएम साइट्रिक एसिड मोनोहाइड्रेट, पीएच 9.0, 80 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए शामिल हैं।
    3. आरटी में कूल प्लेट 20 मिनट। PBS में आवेषण और धोने के लिए 3 x 5 मिनट वापसी वर्गों ।
    4. 96-अच्छी तरह से 180-μl अवरुद्ध समाधान (10% सामान्य बकरी सीरम, पीबीएस में 1% बीएसए) प्रति अच्छी तरह से, और आरटी में 40 मिनट इनक्यूबेट युक्त 96-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें।
    5. 180-μl पतला प्राथमिक एंटीबॉडी (1% बीएसए-पीबीएस में 1:1000) वाले कुओं में अनुभागों को स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
    6. आवेषण के लिए अनुभागों को स्थानांतरित करें। 3 x 5 मिनट पीबीएस धोएं और आरटी में 1 घंटे के लिए बायोटिनेलेटेड सेकेंडरी एंटीबॉडी (1.5% सामान्य सीरम-पीबीएस में 1:200) लागू करें।
    7. उपयोग से पहले एबीसी समाधान 30 मिनट तैयार करें। 3 x 5 मिनट PBS धोएं और आरटी में 1 घंटे के लिए एबीसी समाधान के लिए स्थानांतरण करें।
    8. हुड में डीएबी समाधान तैयार करें। पीबीएस में 2x 5 मिनट और टीएस में 1x 5 मिनट धोएं, और डीएबी में इनक्यूबेट सेक्शन।
      1. 3-4 मिनट के लिए विकसित करें। नकारात्मक नियंत्रण रंग में हल्का रहना चाहिए।
        नोट: इस कदम को धूम हुड में करें क्योंकि डीएबी एक ज्ञात कैंसरकारक है। विसंदूषण के लिए डीएच 2 ओ में0.2मीटर पोटेशियम परमेगनेट का समाधान आकस्मिक ड्रिप के मामले में निकटता में बनाए रखा जाना चाहिए।
    9. डीडीएच2ओ में संक्षेप में अनुभागों को कुल्ला करें, फिर टीएस 3 x 5 मिनट में। प्लस स्लाइड पर माउंट वर्गों और हवा-धुएं हुड में रात भर सूखी ।
    10. डीएच 2 ओ, भंवर में 0.2 M पोटेशियम परमगनेट की बराबर मात्रा के साथ डीएबी कचरे को दूषित करें, और धुएंहुडमें उचित लेबल वाले डीएबी अपशिष्ट बिन में भंडारण करने से पहले रात भर एक धुएं के हुड में इनक्यूबेट करें।
      नोट: ब्लीच समाधान डीएबी के म्यूटेजेनिक गुणों को खत्म नहीं करता है।
      1. डिटर्जेंट से धोने के लिए वस्तुओं को फिर से उपयोग किया जाना चाहिए (यानी पॉलीस्टीरिन आवेषण)।
    11. डिहाइड्रेट/काउंटरदाग क्रेसिल वायलेट (सीवी) के साथ हल्के से । सभी निर्जलीकरण/वॉश स्टेप्स 3 मिनट हैं: इथेनॉल 70%, 95%, 100%, 95%, डीडीएच2ओ, सीवी (30 सेकंड), डीडीएच20 x 2, 95% इथेनॉल + हिमनदों एसिटिक एसिड (0.1%) x 2, 100% इथेनॉल, और जाइलीन।
    12. डिस्टारीन-टोल्यून-जाइलीन बढ़ते मध्यम और धुएं हुड में शुष्क में कवरलिप।
    13. एक हल्के माइक्रोस्कोप द्वारा सकारात्मक इम्यूनोएक्टिविटी का निरीक्षण करें। प्राथमिक प्रजातियों से आईजीजी नकारात्मक इम्यूनोदाता नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।

9. सांख्यिकी

  1. जीनोटाइप और विषाक्त उपचार के बीच मतभेदों की तुलना करने के लिए जीनोटाइप और दो तरह के एनोवा के बीच मतभेदों की तुलना करने के लिए विचरण (ANOVA) के एक तरफा विश्लेषण द्वारा साधनों के बीच मतभेदों का आकलन करें। जब ANOVA परीक्षण(पी≤0.05) द्वारा मतभेद ों को देखा जाता है तो टुकी के एचएसडी पोस्ट हॉक विश्लेषण का उपयोग करें।
    नोट: प्रयोग (n = 6-9 चूहों/समूह के साथ) प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए कम से कम दो बार किया जाता है।

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Representative Results

यह विष जोखिम प्रतिमान एमपीटीपी बनाम खारा इंजेक्शन जानवरों में एक महत्वपूर्ण और पता लगाने योग्य 20% स्ट्राटाटल डोपामाइन की कमी का उत्पादन कर सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एमपीटीपी के विभिन्न बहुत सारे थोड़ा कम या ज्यादा घाव हो सकते हैं; इस प्रकार, बेहतर परिशुद्धता के लिए, जब न्यूरोटॉक्सिन का एक नया बहुत उपयोग किया जाता है तो ट्रांसजेनिक्स में उपयोग करने से पहले वाइल्डटाइप चूहों में एक प्रारंभिक प्रयोग की सिफारिश की जाती है। हल्के से मध्यम घाव का उपयोग ट्रांसजीन के प्रभाव के लिए देखा जा सकता है; एक गंभीर घाव चोट के साथ एक 'मंजिल प्रभाव' का उत्पादन कर सकता है जो क्षीण या इतना हानिकारक हो सकता है कि यह हानिकारक आनुवंशिक परिवर्तन के प्रभाव को ग्रहण करता है। स्ट्राटाल डोपामाइन पर एमपीटीपी का प्रभाव 5-LOX आइसोजिम-कमी वाले चूहों में काफी अलग था, लेकिन 12/15-LOX isozyme-कमी चूहों(चित्रा 1)में नहीं था। इसके अलावा, इन तरीकों के साथ, हम नमकीन इलाज चूहों(चित्रा 1)में 5-LOX की कमी के कारण डोपामाइन के स्तर में एक महत्वपूर्ण अंतर विचार करने में सक्षम थे ।

टीएच और जीएफएपी के लिए इम्यूनोब्लोटिंग को क्रमशः, वाइल्डटाइप चूहों में स्ट्राटम के स्तर पर, क्षति और न्यूरोइंफ्लैमेशन की पुष्टि के लिए अनुमति दी गई, एक प्रभाव जो 5-LOX isozyme-कमी वाले स्ट्राटम(आंकड़े 3 ए और 3B)में कम हो गया था। घाव भी सब्स्टेंटिया निग्रा(चित्रा 2A और 2B)के स्तर पर प्रत्यक्ष है । वही चूहों में, टीएच-पॉजिटिव न्यूरॉन्स की कमी और बढ़ी हुई जीएफएपी इम्यूनोरेएक्टिविटी ड्यूल-लेबल इम्यूनोफ्लोर्सेंट लेबलिंग(चित्रा 2 ए)का उपयोग करके नमूदार है। इसके अलावा, वाइल्डटाइप में स्पष्ट रूप से ऊंचा माइक्रोग्लियल एक्टिवेशन(यानी Iba1 इम्यूनोएक्टिविटी) है, लेकिन 5-LOX isozyme-कमी नहीं है, चूहों एमपीटीपी एक्सपोजर(चित्रा 2B)के बाद सबस्टेंटिया निग्रा में स्पष्ट है। इस प्रकार, एमपीटीपी मॉडल निग्रल अध: पतन और सूजन के लिए आनुवंशिक गड़बड़ी के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान कर सकता है।

Figure 1
चित्रा 1. एमपीटीपी चैलेंज के बाद स्ट्राटाल डोपामाइन पर LOX isozyme-चयनात्मक प्रभाव। (क) स्ट्राटाल समरूपों का उपयोग एचपीएलसी द्वारा डब्ल्यूटीई और 5-LOX-/-लिटरमेट्स को नमकीन या एमपीटीपी (एन = 6-8/समूह) से डोपामाइन (डीए) को मापने के लिए किया गया था । ‧, जीनोटाइप के कारण एक महत्वपूर्ण प्रभाव को चिह्नित करता है; पी<0.05। *, जीनोटाइप और उपचार के कारण एक महत्वपूर्ण प्रभाव को चिह्नित करता है; पी<0.05। उपचार के कारण कोई महत्वपूर्ण अंतर5-LOX-/-चूहों (n.s.) में उल्लेख किया गया था जो यह दर्शाता है कि एमपीटीपी ने इस ट्रांसजेनिक लाइन में स्ट्राटाल डीए की कमी का उत्पादन नहीं किया । (ख) स्ट्राइटल समरूपता का उपयोग डब्ल्यूटीई और 12/15-LOX-/-लिटरमेट्स में खारा या एमपीटीपी (n=6-9/समूह) में डीए को मापने के लिए किया गया था । जीनोटाइप के कारण डीए के स्तर में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया। एक महत्वपूर्ण, और इसी तरह, कम होने के कारण एमपीटीपी उपचार दोनों जीनोटाइप में नोट किया गया था। *, पी<0.01। डेटा को एसईएम के ± मतलब के रूप में दिखाया गया है।

Figure 2
चित्रा 2। 5-LOX isozyme एमपीटीपी चुनौती के बाद निग्रल टीएच और एस्ट्रोग्लिया पर प्रभाव। (क) टीएच (फिटसी, ग्रीन) और जीएफएपी (568; लाल) के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग डब्ल्यूटीई और 5-LOX--लिटरमेट्स से खारा या एमपीटीपी दिए गए निग्रल मस्तिष्क खंडों में किया गया था। डब्ल्यूटी-एमपीटीपी समूह में कम टीएच-पॉजिटिव सेल निकाय (*) और बढ़ी हुई जीएफएपी इम्यूनोरेएक्टिविटी स्पष्ट हैं। बार = 25 माइक्रोन्स (बी) माइक्रोग्लिया पर आईबीए-1 के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल हिस्टोलॉजी का पता डीएबी (ब्राउन क्रोमेत्जेन) का उपयोग करके लगाया गया था; वर्गों क्रेसिल वायलेट द्वारा जवाबी दाग थे। डब्ल्यूटीई और 5-LOX-/-लिटरमेट्स नमकीन या एमपीटीपी के साथ इलाज से निग्रल वर्गों का आकलन किया गया । रामीकृत कोशिका निकायों और लंबे समय के साथ माइक्रोग्लिया, खारा-इलाज चूहों (तीर सिर) से सबस्टेंटिया निग्रा में ब्रांचिंग प्रक्रियाएं देखी जाती हैं। एमपीटीपी-इलाज चूहों (तीर) से सबस्टेंटिया निग्रा में गोल कोशिका निकायों और छोटी, मोटी प्रक्रियाओं के साथ सक्रिय माइक्रोग्लिया देखा गया था। बार = 10 माइक्रोन।

Figure 3
चित्र 3। 5-LOX isozyme पर प्रभाव striatal TH और भड़काऊ विषाक्त अपमान के बाद । (क) स्ट्राटाल टीएच प्रोटीन का स्तर डब्ल्यूटीई और 5-एलओएक्स-/-लिटरमेट्स को खारा या एमपीटीपी (एन = 6-8/समूह) से समरूप के पश्चिमी दाग विश्लेषणों द्वारा अर्ध-मात्रात्मक रूप से मापा गया था । ऑप्टिकल घनत्व द्वारा मापा गया इम्यूनोरेएक्टिविटी, β-ऐक्टिन को सामान्यीकृत किया गया था। *, पी<0.05. (ख) इसी प्रकार, जीएफएपी को डब्ल्यूटीई और 5-एलओएक्स-/-लिटरमेट्स से स्ट्राइटल समरूप के पश्चिमी दाग विश्लेषणों द्वारा अर्ध-मात्रात्मक रूप से मापा गया था और खारा या एमपीटीपी (एन = 6-8/समूह) के साथ दिया गया था और β-ऐक्टिन को सामान्यीकृत किया गया था । *, पी<0.05. डेटा को मतलब ± एसईएम के रूप में नोट किया जाता है।

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Discussion

इस जीन-पर्यावरण इंटरैक्शन अध्ययन के डिजाइन ने हमें निग्रोस्ट्रियाटल पाथवे में 5-LOX आइसोजाइम की दोहरी प्रकृति के बारे में नई जानकारी हासिल करने की अनुमति दी। 5-LOX आइसोजिम और उनके वाइल्डटाइप लिटरमेट्स की कमी वाले ट्रांसजेनिक्स में खारा या एमपीटीपी उपचार के बाद स्ट्राइटल मोनोमाइन को मापने के लिए एचपीएलसी का प्रदर्शन करके, हम यह नोट करने में सक्षम थे कि इसकी कमी विषाक्त परिस्थितियों(चित्रा 1)के तहत सुरक्षात्मक प्रतीत होती है, लेकिन सामान्य परिस्थितियों में, एंजाइम की कमी स्ट्राइटल डोपामाइन के स्तर को कम कर देती है और हानिकारक हो सकती है। इस प्रकार, हम यह प्रदर्शित करने में सक्षम हैं कि 5-LOX आइसोजिम सामान्य परिस्थितियों में स्ट्राटाल डोपामिनेर्गिक टोन में योगदान देता है, लेकिन विषाक्त चुनौती4के बाद नुकसान में योगदान दे सकता है।

जबकि आगे मूल्यांकन nigrostriatal विषाक्तता में LOX isozymes की भूमिका में उपंयास यंत्रवादी अंतर्दृष्टि उधार देना चाहिए, पश्चिमी दाग विश्लेषण(चित्रा 3)के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अध्ययन(चित्रा 2)से पता चला है कि न्यूरोइंफ्लैमेशन मार्कर थे, कम से कम भाग में, 5 में तनु-LOX isozyme-कमी cohort MPTP को उजागर । ये निष्कर्ष, शास्त्रीय जैव रासायनिक और हिस्टोलॉजिकल तकनीकों का उपयोग करके, सूक्ष्म और खगोल-ग्लियल एक्टिवेशन4के शक्तिशालीकरण में 5-LOX उत्पादों की महत्वपूर्ण भूमिका का संकेत देते हैं।

जीन-पर्यावरण बातचीत की जांच के आधार पर, ग्लियल एक्टिवेशन के अलावा पैथोलॉजिकल रीडआउट का विश्लेषण किया जा सकता है। पीडी में विशेष महत्व के उपस्तंटिया निग्रा में डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स की हानि और संभावित रोग संचय और α-सिन्यूक्लिन के एकत्रीकरण है। इस लाइन के साथ, α-सिन्यूक्लिन ओवरएक्सप्रेशन के साथ ट्रांसजेनिक चूहों में विषाक्त जोखिम के प्रभाव की निगरानी निग्रल सेल डेथ(यानी निष्पक्ष स्टीरियोलॉजिकल सेल काउंटिंग का उपयोग करके) और अघुलनशील α-सिन्यूक्लिन डिपॉजिटेशन32-35के मूल्यांकन द्वारा की गई है।

यहां वर्णित प्रतिमान में उपयोग की जाने वाली एमपीटीपी खुराक मामूली, लेकिन महत्वपूर्ण, स्ट्राटाल चोट(चित्रा 1)और ग्लिल एक्टिवेशन दोनों स्ट्राटम और सबस्टेंटिया निग्रा(आंकड़े 2 और 3)में हल्के घाव पैदा करती है। आमतौर पर, विषाक्त पदार्थ की उच्च खुराक का उपयोग मजबूत निग्रल डोपामिनेर्गिक सेल हानि और स्ट्राटाल डोपामाइन की कमी23,24,32,36-38,39का उत्पादन करने के लिए किया जाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एमपीटीपी की विषाक्तता विक्रेताओं और बहुत सारे के बीच भिन्न हो सकती है; नतीजतन खुराक वांछित घाव का उत्पादन करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, अन्य कारकों जिन पर विचार किया जाना चाहिए, वे अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों के तनाव और लिंग हैं। न्यूरोटॉक्सिन के प्रति चयनात्मक संवेदनशीलता चूहों की अलग पृष्ठभूमि उपभेदों में प्रदर्शित की गई है, कम से कम भाग में, जेएनके और सी-जून36-39सहित अध: पतन को मध्यस्थता करने वाले उपकोशिक मार्गों की सक्रियता में अंतर के कारण एक घटना। एमपीटीपी विषाक्तता में सेक्स-निर्भर मतभेदों को भी40,41बताया गया है, और ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके अध्ययनों में परिवर्तनशीलता में योगदान दे सकता है जिसमें दोनों लिंगों का उपयोग खराब प्रजनन लाइनों के लिए किया जाता है। ऐसे उदाहरण में, सेक्स-मिलान वाइल्डटाइप नियंत्रण का उपयोग महत्वपूर्ण है4। इस तरह के सेक्स से संबंधित प्रभाव 5-और 12/15-LOX-कमी चूहों के प्रभाव का परीक्षण करने के बीच डब्ल्यूटीई चूहों में मनाए गए घावों में अंतर के लिए खाते हो सकते हैं, जिसमें एक लिंग का उपयोग एक पंक्ति के लिए किया जाता था और दूसरे के लिए दोनों लिंग(चित्र 1)। जीन-पर्यावरण संपर्क अध्ययनों के लिए, एक एमपीटीपी चुनौती जो गंभीर चोट पैदा करतीहै (उदाहरण के लिए >80% स्ट्राटाल डोपामाइन में कमी) की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि यह संभावित आनुवंशिक प्रभाव को मुखौटा कर सकता है।

जबकि एमपीटीपी एक्सपोजर निट्रिकल सेल डेथ3,42,स्ट्रीटल डोपामाइन की कमी3,जटिल आई अवरोध43-45,और ग्लियल एक्टिवेशन46,47 का उत्पादन करता है जो मानव पीडी में सूचित किया गया है, माउस में, एक धीरे-धीरे प्रगतिशील पतन जो स्थिर पार्किंसंस(यानी मोटर घाटे) और फ्रैंक α-सिन्यूक्लिन पैथोलॉजी(यानी लेवी बॉडीज और न्यूराइट्स) का उत्पादन करता है, पूरी तरह से बीमारी की हॉलमार्क सुविधाओं को मॉडल में नहीं होता है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एमपीटीपी माउस ने उपकोशिकीय रास्तों को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है जो पीडी से संबंधित न्यूरोडिजेनरेशन में योगदान देते हैं। जोखिम प्रतिमान में भिन्नता, उदाहरण के लिए, विषाक्तता के विशिष्ट तंत्र की सक्रियता का पता चला है: कम खुराक, सबक्यूट एक्सपोजर सीमित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया49 के साथ एपोप्टोटिक सेल डेथ48 को बढ़ावा देता है जबकि उच्च खुराक के साथ तीव्र उपचार चिह्नित माइक्रोग्लियाल सक्रियण50का उत्पादन करता है। दरअसल, इस तरह के कारकों पर विचार किया जाना चाहिए जब प्रभावकारिता अध्ययन के लिए मॉडल का उपयोग और, वर्तमान अध्ययन के लिए प्रासंगिक, एक संभावित आनुवंशिक जोखिम कारक के प्रभाव नकाब उतारना ।

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Disclosures

खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान एनआईजीएमएस 056062 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) Sigma-Aldrich M0896 for PD modeling
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) American MasterTech Scientific BUP0157 for immersion fixation
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) Sigma-Aldrich 244252 for HPLC acid extraction
Tris Base Sigma-Aldrich T1503 for tissue homogenization
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E1644 for tissue homogenization
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 for tissue homogenization
Phosphatase inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P5726 for tissue homogenization
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881 for Lowry protein assay
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC)  Sigma-Aldrich S0389 for cryoprotection
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) Sigma-Aldrich P3813 for IHC
BCA Protein Assay Kit Pierce/Thermo 23225 for protein determination
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well Invitrogen/Life Technologies EC60052BOX for SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Invitrogen/Life Technologies NP0007 for SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard  Invitrogen/Life Technologies LC5800 protein ladder
Glycine Sigma-Aldrich G7126 for SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) Sigma-Aldrich L3771 for SDS-PAGE
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent  American MasterTech Scientific SPM1057C methanol for transfer
Sodium chloride (NaCl), ACS reagent Sigma-Aldrich S9888 saline and buffers
Nonfat dry milk powder Carnation n/a for immunoblotting
Ponceau S solution in 5% acetic acid  Sigma-Aldrich P7170 for immunoblotting
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal Chemicon/Millipore AB1542 for immunofluorescence 
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal Pel-Freez Biologicals P40101-0 for immunoblotting
Anti-β Actin, rabbit Sigma-Aldrich A2066 for immunoblotting
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal Chemicon/Millipore AB5804 for immunofluorescence
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal Covance Inc. SMI-22R for immunoblotting
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 for immunoblotting
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated  Fisher Scientific 31462 for immunofluorescence
goat anti-sheep, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31480 for immunofluorescence
goat anti-mouse, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31430 for immunofluorescence
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Pierce/Thermo 34078 for immunoblotting
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in  Pierce/Thermo 34089 for immunoblotting
Restore Western Blot Stripping Buffer  Pierce/Thermo 21059 for immunoblotting
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0%  Sigma-Aldrich C1909 for IHC
Normal Donkey Serum Millipore S30-100ML for IHC
Polyvinylpyrrolidone (PVP) Sigma-Aldrich P5288 for IHC
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized Sigma-Aldrich A3294 for IHC
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-01 for IHC
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled  Invitrogen/Life Technologies A10042 for IHC
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC  Jackson ImmunoResearch 713-095-147 for IHC
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1500 for IHC
Normal Goat Serum Millipore S26-100ML for IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG )  Vector Laboratories PK-4001 for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions )
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine Vector Laboratories SK-4100 for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use)
Hydrogen peroxide, 30% Sigma-Aldrich 216763 for quench step in IHC
Rabbit anti-Iba1 Biocare Medicals CP290A for IHC
Cresyl Violet Solution, Regular Strength  FD Neurotechnologies PS102-01 counterstain for Iba1 IHC
95% Ethanol, reagent alcohol Sigma-Aldrich R8382 dehydration for IHC
100% Absolute ethanol Mallinckrodt 7019-10 dehydration for IHC
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283 destaining for IHC
Xylene Sigma-Aldrich 534056 clearing agent for IHC
DPX Mountant Sigma-Aldrich 06522 mounting medium for DAB IHC
O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium  American MasterTech Scientific EMOCTCS embeddium medium for cryostat cutting
Potassium permanganate Sigma-Aldrich 223468 to decontaminate DAB solution
Dopamine hydrochloride Sigma-Aldrich H8502 for HPLC
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) Sigma-Aldrich 850217 for HPLC
Homovanillic acid (HVA) Sigma-Aldrich H1252 for HPLC
Perchloric acid (PCA) - 70% Sigma-Aldrich 244252 for HPLC
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Sigma-Aldrich 71504 for HPLC
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich C1909 for HPLC
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) Sigma-Aldrich O8380 for HPLC
EDTA Sigma-Aldrich E1644 for HPLC
Acetonitrile EMD AX0145-1 for HPLC
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) Millipore for HPLC
0.22 µm GSTF membrane Millipore for filtration
Corning Netwells Sigma-Aldrich CLS3477 polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) MSE MSE.41371.274
Microcentrifuge Eppendorf 5414R
ESA MD-150 reverse-phase column  ESA
HPLC Pump (Ultimate 3000) Dionex ISO-3100BM
HPLC Autosampler (Ultimate 3000) Dionex WPS-3000TSL
Electrochemical detector ESA Coulochem III
Guard Cell ESA 5020
Analytical Cell ESA 5011A
Chromeleon software Dionex
Eclipse E400 Nikon E400 light/fluorescent microscope
Disposable mouse cage Ancare N10HT
Microfilter top Ancare N10MBT
5-LOX- deficient mice The Jackson Laboratory 004155
12/15-LOX-deficient mice The Jackson Laboratory 002778

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References

  1. Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
  2. Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment interactions in Parkinson's disease and other forms of parkinsonism. Neurotoxicology. 31, 598-602 (2010).
  3. Heikkila, R. E., Hess, A., Duvoisin, R. C. Dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine in mice. Science. 224, 1451-1453 (1984).
  4. Chou, V. P., Holman, T. R., Manning-Bog, A. B. Differential contribution of lipoxygenase isozymes to nigrostriatal vulnerability. Neuroscience. 228, 73-82 (2013).
  5. Deschamps, J. D., Kenyon, V. A., Holman, T. R. Baicalein is a potent in vitro inhibitor against both reticulocyte 15-human and platelet 12-human lipoxygenases. Bioorg. Med.Chem. 14, 4295-4301 (2006).
  6. Weaver, J. R., et al. Integration of pro-inflammatory cytokines, 12-lipoxygenase and NOX-1 in pancreatic islet beta cell dysfunction. Mol. Cell Endocrinol. 358, 88-95 (2012).
  7. Yigitkanli, K., et al. Inhibition of 12/15-lipoxygenase as therapeutic strategy to treat stroke. Ann. Neurol. 73, 129-135 (2013).
  8. van Leyen, K., et al. Novel lipoxygenase inhibitors as neuroprotective reagents. J Neurosci. Res. 86, 904-909 (2008).
  9. Chu, J., Pratico, D. 5-lipoxygenase as an endogenous modulator of amyloid beta formation in vivo. Ann. Neurol. 69, 34-46 (2011).
  10. Langston, J. W., Ballard, P., Tetrud, J. W., Irwin, I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219, 979-980 (1983).
  11. Bove, J., Perier, C. Neurotoxin-based models of Parkinson's disease. Neuroscience. 211, 51-76 (2012).
  12. Beal, M. F. Neuroprotective effects of creatine. Amino Acids. 40, 1305-1313 (2011).
  13. Jackson-Lewis, V., Blesa, J., Przedborski, S. Animal models of Parkinson's disease. Parkinsonism Relat. Disord. 18, 183-185 (2012).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Wang, H., Shimoji, M., Yu, S. W., Dawson, T. M., Dawson, V. L. Apoptosis inducing factor and PARP-mediated injury in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 991, 132-139 (2003).
  16. Petroske, E., Meredith, G. E., Callen, S., Totterdell, S., Lau, Y. S. Mouse model of Parkinsonism: a comparison between subacute MPTP and chronic MPTP/probenecid treatment. Neuroscience. 106, 589-601 (2001).
  17. Przedborski, S., et al. The parkinsonian toxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP): a technical review of its utility and safety. J. Neurochem. 76, 1265-1274 (2001).
  18. Thomas, B., et al. Mitochondrial permeability transition pore component cyclophilin D distinguishes nigrostriatal dopaminergic death paradigms in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Antioxid. Redox. Signal. 16, 855-868 (2012).
  19. Sonsalla, P. K., Heikkila, R. E. The influence of dose and dosing interval on MPTP-induced dopaminergic neurotoxicity in mice. Eur. J. Pharmacol. 129, 339-345 (1986).
  20. Di Monte, D. A., et al. Relationship among nigrostriatal denervation, parkinsonism, and dyskinesias in the MPTP primate model. Mov. Disord. 15, 459-466 (2000).
  21. Lee, K. W., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 mediates MPTP toxicity and regulates glial activation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat. Protoc. 2, 141-151 (2007).
  23. Bolin, L. M., Strycharska-Orczyk, I., Murray, R., Langston, J. W., Di Monte, D. Increased vulnerability of dopaminergic neurons in MPTP-lesioned interleukin-6 deficient mice. J. Neurochem. 83, 167-175 (2002).
  24. Manning-Bog, A. B., et al. Increased vulnerability of nigrostriatal terminals in DJ-1-deficient mice is mediated by the dopamine transporter. Neurobiol. Dis. 27, 141-150 (2007).
  25. Quik, M., Di Monte, D. A. Nicotine administration reduces striatal MPP+ levels in mice. Brain Res. 917, 219-224 (2001).
  26. Markey, S. P., Johannessen, J. N., Chiueh, C. C., Burns, R. S., Herkenham, M. A. Intraneuronal generation of a pyridinium metabolite may cause drug-induced parkinsonism. Nature. 311, 464-467 (1984).
  27. Heikkila, R. E., Manzino, L., Cabbat, F. S., Duvoisin, R. C. Protection against the dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine by monoamine oxidase inhibitors. Nature. 311, 467-469 (1984).
  28. Crampton, J. M., Runice, C. E., Doyle, T. J., Lau, Y. S., Wilson, J. A. MPTP in mice: treatment, distribution and possible source of contamination. Life Sci. 42, 73-78 (1988).
  29. Yang, S. C., Markey, S. P., Bankiewicz, K. S., London, W. T., Lunn, G. Recommended safe practices for using the neurotoxin MPTP in animal experiments. Lab. Anim. Sci. 38, 563-567 (1988).
  30. Lau, Y. S., Novikova, L., Roels, C. MPTP treatment in mice does not transmit and cause Parkinsonian neurotoxicity in non-treated cagemates through close contact. Neuroscience research. 52, 371-378 (2005).
  31. Satoh, N., et al. Central hypothermic effects of some analogues of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP). Neurosci. Lett. 80, 100-105 (1987).
  32. Fernagut, P. O., et al. Behavioral and histopathological consequences of paraquat intoxication in mice: effects of alpha-synuclein over-expression. Synapse. 61, 991-1001 (2007).
  33. Manning-Bog, A. B., McCormack, A. L., Purisai, M. G., Bolin, L. M., Di Monte, D. A. Alpha-synuclein overexpression protects against paraquat-induced neurodegeneration. J. Neurosci. 23, 3095-3099 (2003).
  34. Richfield, E. K., et al. Behavioral and neurochemical effects of wild-type and mutated human alpha-synuclein in transgenic mice. Exp. Neurol. 175, 35-48 (2002).
  35. Thomas, B., et al. Resistance to MPTP-neurotoxicity in alpha-synuclein knockout mice is complemented by human alpha-synuclein and associated with increased beta-synuclein and Akt activation. PloS one. 6, (2011).
  36. Smeyne, M., Goloubeva, O., Smeyne, R. J. Strain-dependent susceptibility to MPTP and MPP(+)-induced parkinsonism is determined by glia. Glia. 34, 73-80 (2001).
  37. Hamre, K., Tharp, R., Poon, K., Xiong, X., Smeyne, R. J. Differential strain susceptibility following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) administration acts in an autosomal dominant fashion: quantitative analysis in seven strains of Mus musculus. Brain Res. 828, 91-103 (1999).
  38. Sedelis, M., et al. MPTP susceptibility in the mouse: behavioral, neurochemical, and histological analysis of gender and strain differences. Behav. Genet. 30, 171-182 (2000).
  39. Boyd, J. D., et al. Response to 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) differs in mouse strains and reveals a divergence in JNK signaling and COX-2 induction prior to loss of neurons in the substantia nigra pars compacta. Brain Res. 1175, 107-116 (2007).
  40. Ookubo, M., Yokoyama, H., Kato, H., Araki, T. Gender differences on MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) neurotoxicity in C57BL/6 mice. Molecular and cellular endocrinology. 311, 62-68 (2009).
  41. Kenchappa, R. S., Diwakar, L., Annepu, J., Ravindranath, V. Estrogen and neuroprotection: higher constitutive expression of glutaredoxin in female mice offers protection against MPTP-mediated neurodegeneration. FASEB J. 18, 1102-1104 (2004).
  42. Jackson-Lewis, V., Jakowec, M., Burke, R. E., Przedborski, S. Time course and morphology of dopaminergic neuronal death caused by the neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Neurodegeneration. 4, 257-269 (1995).
  43. Mizuno, Y., Sone, N., Saitoh, T. Effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion on activities of the enzymes in the electron transport system in mouse brain. J. Neurochem. 48, 1787-1793 (1987).
  44. Nicklas, W. J., Youngster, S. K., Kindt, M. V., Heikkila, R. E. M. P. T. P. MPP+ and mitochondrial function. Life Sci. 40, 721-729 (1987).
  45. Nicklas, W. J., Vyas, I., Heikkila, R. E. Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine. Life Sci. 36, 2503-2508 (1985).
  46. Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J. Neurosci. 22, 1763-1771 (2002).
  47. Kurkowska-Jastrzebska, I., Wronska, A., Kohutnicka, M., Czlonkowski, A., Czlonkowska, A. The inflammatory reaction following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine intoxication in mouse. Exp. Neurol. 156, 50-61 (1999).
  48. Tatton, N. A., Kish, S. J. In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia nigra compacta of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labelling and acridine orange staining. Neuroscience. 77, 1037-1048 (1997).
  49. Furuya, T., et al. Caspase-11 mediates inflammatory dopaminergic cell death in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease. J Neurosci. 24, 1865-1872 (2004).
  50. Anderson, D. W., Bradbury, K. A., Schneider, J. S. Neuroprotection in Parkinson models varies with toxin administration protocol. Eur. J. Neurosci. 24, 3174-3182 (2006).

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Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R., Manning-Boğ, A. B. Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (83), e50960, doi:10.3791/50960 (2014).

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