Summary
リポキシゲナーゼ (LOX) イソザイムは、神経炎症や神経変性を増減する可能性のある製品を生成できます。.遺伝子環境相互作用研究は、LOXアイソザイム特異的な効果を同定することができる。1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)モデルを2つのLOXアイソザイム欠損トランスジェニックラインでニグロストリアチン系の損傷を用い、ドーパミン作動性および炎症に対するLOXイソザイムの寄与を比較することができる。
Abstract
リポキシゲナーゼ(LOX)活性は、アルツハイマー病などの神経変性疾患に関与しているが、パーキンソン病(PD)の病因におけるその効果はあまり理解されていない。遺伝子環境相互作用モデルは、単独で遺伝的または毒性のある疾患モデルだけでは観察されない毒性における特定の細胞経路の影響をマスク解除する有用性を有する。異なるLOXアイソザイムが選択的にPD関連神経変性に寄与しているかどうかを評価するために、トランスジェニック(すなわち 5-LOXおよび12/15-LOX欠損)マウスは、障害における細胞損傷および死を模倣する毒素で挑戦することができる。ここでは、PDに関連する神経変性に対するLOXイソザイムの明確な寄与を解明するためにニグロストリアザル病変を産生する神経毒1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)の使用について説明する。マウスにおけるMPTPの使用、および非ヒト霊長類は、PDにおけるニグロストリアティカル損傷を再現するために十分に確立されている。MPTP誘導病変の程度は、ドーパミンとその代謝産物のHPLC分析と、ドーパミンの合成に対する速度制限酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)に対する線条体の半定量的なウェスタンブロット分析によって測定される。炎症性マーカーを評価するために、LOXイソザイム選択的感受性を実証し得る、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)およびIba-1免疫ヒスロトケミストリーは、立体ニグラを含む脳切片に対して行われ、GFAPウェスタンブロット分析は線条皮ホモジネートに対して行われる。この実験的アプローチは、ニグロストリアトリアティアルジェネレーションとPDの基礎となる遺伝子環境相互作用に関する新しい洞察を提供することができる。
Introduction
遺伝子環境相互作用モデルの使用は、特発性パーキンソン病(PD)に影響を及ぼす可能性のある危険因子を模倣するアプローチを提供し、遺伝的または毒性のあるシステムの単独使用によって解明される可能性が低い機械学的洞察を識別する機会を与える1,2。ここでは、この点を説明し、神経炎症および毒性に対するリポキシゲナーゼ(LOX)イソザイム活性をよりよく理解するために、ニグストリアティール変性3の1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)マウスモデルの応用を説明する。LOXアイソザイムの役割は、脳卒中7およびアルツハイマー病8,9を含む末梢疾患5,6とCNS疾患において広く評価されているが、PDに関連するニグロストリエータル機能および変性におけるアイソザイムの家族の役割はよく理解されておらず、研究を保証する。MPTP神経毒は、ニグロストリアティカル経路の優遇変性を示し、PD患者10における運動障害の根本である線条体ドーパミン枯渇およびニグラードパミン作動性細胞喪失を再現する。このモデルは、非運動および運動PDの挙動および率直なαシヌクレイン陽性Lewy身体病理学の完全なカドレを再現していないが、それは確実に三元性ドーパミン損失を伴うニガラル細胞死を生み出すために利用可能な最良の特徴非侵襲モデルであるため、ニグロストリアトリ物質損傷に寄与する新しい機械学的標的を解明し、初期段階の翻訳試験に有用であった。MPTPマウスの広い使用は、急性、亜急性から慢性16-18までのパラダイムを用いて、治療レジメン18,21,22に応じて毒性の異なるメカニズムの活性化を伴う軽度から重度のニグロストリアタル損傷を生じさせる投薬の標準化を可能にした。その結果、23-25を利用した治療薬またはトランスジェニックモデルに応じて、ニグロストリアザルタル傷害の増強または減少を引き起こし得る「病変の窓」を標的とすることを可能にする。
また、トランスレーショナルおよびディスカバリー生物学研究には、損傷を評価するために使用される技術と、そのような方法が提供する証拠も不可欠です。MPTPマウスモデルについては、病変を評価するための確立された指標は、ドーパミンおよびその代謝産物を含む線条体ドーパミン作動性トーンのマーカーの測定であり、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)のウェスタンブロット分析、ドーパミン合成における速度制限酵素、および西洋ブロットおよび免疫化学を用いたグリア活性化などの変性事象の指標である。これらは古典的な神経化学的、生化学的、および組織学的手順であるが、この技術は、ニグロストリアザルトパミン作動経路内の損傷の程度に関する重要かつ再現性のある読み出しを提供し、毒性のメカニズムを示し、PDにおける変性事象を理解する上で貴重なツールであることが証明されている。
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Protocol
注:すべての動物の手順と動物のケア方法は、機関の施設動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されるべきです。ここで説明する研究は、SRIインターナショナルのIACUCによって確立されたガイドラインに従って行われました。
1. LOX欠損マウスの取得と維持
- 5-LOX欠損または12/15-LOX欠損マウスおよびそれぞれの株および性一致対照を7〜8週齢で購入し、到着後に施設に順応するために数日を許可する。
- 12時間の明暗サイクルでグループハウジング内のマウスを維持し、食べ物や飲料水 のアドリビタムを与える.
2. MPTPの予防措置、保管、準備、除染、廃棄
注: ヒトの静脈内暴露からのMPTP中毒はパーキンソニズム10を引き起こすことが示されている;MPTPは高脂溶性であり、血液脳関門26を容易に横断できる。安全な取り扱い、解毒、廃棄を確実に行うために、予防策を講じる必要があります。その代謝は、酵素モノアミンオキシダーゼB(MAO-B)27による1-メチル-4-フェニル-2、3-ジヒドロピリジニウムへの転換を含む複数のステップを含む。MAO-B阻害剤は、偶発的なヒト中毒の場合に利用され得る。
- 機関の安全衛生委員会の指示に応じてMPTPを利用する前に、職員が適切な安全と取り扱い訓練を受けていることを確認してください。各機関は、文献17、22に包括的に概説されている勧告に基づいて、MPTPの使用のための独自の標準的な操作手順を確立し、実施することができます。
- 準備の前に、以下を含む適切な個人用保護具(PPE)を着用してください:使い捨てラボコートまたは全身スーツ、二重ニトリル手袋、外科マスク、ヘアカバー、安全ゴーグル、および使い捨て靴カバー。適切なPPEは、MPTP、注射パラダイムおよび72時間のポストインジェクションの調製中に、動物および/または寝具を扱う際に着用する必要があります。
- 準備前に計算を実行します。量をドージングするための制度ガイドラインに従う必要があります。100-150 μlの送達は、通常25-30 gマウスに使用される。
- 生理塩水で3 mg /ml MPTP溶液を調製するには、補正係数(1.211 MPTP-HCl:1.0 MPTPフリーベース)を適用します。生理学車におけるMPTP-HClの濃度は3.633mg/mlである。
- 神経毒を取り扱う前に、MPTP調製および潜在的な流出除去に必要なすべての装置、供給および試薬を準備しなさい。
- 適切な保管場所から MPTP-HCl ソースバイアルを取り外します。
注: MPTP は、二次コンテナ内の閉じたバイアルで RT に保持し、「MPTP」というラベルが付いたロックされたキャビネット内に保管する必要があります。- パッドやペーパータオルでスケールを囲む領域を10%漂白剤溶液で湿らせたので、こぼれた粉からのリスクを減らします。予防策として、組織と10%漂白剤溶液を近くに保管してください。
- ヒュームフードに位置する分析バランスを使用して、10%漂白剤浸漬組織を含む二次封入物を有するガラスバイアルにMPTP-HClの50mgの重量を量る。ガラスバイアル「MPTP」に濃度と日付のラベルを付けます。
- ソースバイアルを閉じ、10%漂白剤で外側を拭きます。
- 13.763 mlの滅菌生理液をバイアルにゆっくりと加え、完全に閉じて混合します。(溶液は3.633mg/ml MPTP-HClです。
- フード内で、10%漂白剤浸し組織を有する二次容器内の標識注入バイアルに0.22 μmフィルターを使用して濾過することにより、MPTP溶液を慎重に殺菌する。漂白剤を浸した組織でこぼれをきれいにしてください。
- 適切に標識されたバイオハザード容器にシャープとバイアルを慎重に処分する。動物処置室への輸送のための漂白剤浸漬ティッシュと二次容器の中でMPTP溶液を維持する。
注:その気化は吸入の危険であるため、滅菌のためのオートクレーブMPTP溶液をしないでください。
- MPTP ソースバイアルをセカンダリ コンテナに戻し、ストレージの場所に配置します。10%漂白剤を使用して10分間、ヘラ、分析スケール、フード表面を除染します。
3. MPTP 管理
- 「MPTP」(マイナスワイヤーフードグリル)と記されたポリエステル濾過ライナー、使い捨てケージライナー、水源として湿布前の食品ペレットとヒドロゲルを含む標準的なマイクロアイソレーター穿刺蓋付きの使い捨てケージを準備します。15 mg/kg 注射に必要な生理液量で 3 mg/ml MPTP のすべての動物と記録量を量ります。
注: MPTP代謝産物は、注射28、29後の3日間、排泄物で検出可能です。しかし、マウスは、親水性30のために膜を横切らない非毒性誘導体であるMPTPn-オキシドを排泄する。- 上記のすべてのPPEを着用し、使い捨て可能な吸収パッドの上にマウスを保持し、腹腔内腔(i.p.)に15mg / kg用量の生理食音車またはMPTP溶液を注入し、使い捨て26ゲージの結核注射器で毎日4日間注入する。
- 使用後に注射器を要約しないでください。専用のラベル付き MPTP バイオ危険シャープコンテナに廃棄します。偶発的な点滴をきれいにするために、近くの10%の漂白剤と組織を維持してください。
- MPTPを注射した動物を使い捨てケージに、ケージあたり最大5匹のマウス、オープンラックに収納します。換気ラックは使用しないでください。
- 最後の注入の後72時間まで、マウスとハウジングルームのドアを含むラックにMPTPを使用してプラカードを置きます。
注:マウスはMPTP中毒に続いて12hまでの一過性低体温を経験するので、ハウジングルームの温度は22.2〜24.4oCの間にあることを確認してください。31 - 各使用後に作業面を漂白剤で除染し(ステップ2.8を参照)、残ったMPTP溶液を10%漂白剤相当量を添加して処分し、内容物を生物危険物液体廃棄物として廃棄します。
- 使用済み PPE をすべて専用の処分ビンに廃棄します。必要に応じて、廃棄前に10%の漂白剤をスプレーしてください。
- 最後の注入の後72時間まで、マウスとハウジングルームのドアを含むラックにMPTPを使用してプラカードを置きます。
- 定期的に動物をチェックし、注射パラダイム中に毎日食料や水源をリフレッシュし、最後の注射の後72時間。注: ケージの外側を直ちに取り囲む領域では汚染は予測されませんが、この領域は予防措置として漂白剤溶液で処理されます(ステップ2.8で説明)。この期間中、すべてのマウスと機器を取り扱う際には注意が必要です。
- 最後の注射の3日後、適切にラベル付けされたバイオハザードバッグにすべてのケージとライナーを処分します。動物のための定期的なPPEと通常の住宅の使用を再開;ドアと棚のプラカードを取り外します。
4. 組織の収穫
- 最後のMPTP注射の7日後に子宮頸部脱臼によって動物を安楽死させる。すぐにコロナ平面に1mmスロットを備えた冷やされた脳型を使用して氷上の脳を解剖する。
- 前脳のスライスから線条体を分離します 2-mm 前脳のレベルで厚く、
- メスを使用して周囲の皮質および皮質下領域を除去する。神経化学的または生化学的分析のために、各半球からのスナップ凍結線条体組織を別々の1.5mlマイクロ遠心分離チューブで行います。
- 4%ホルムアルデヒド水溶液中の前視床下部および浸漬固定組織のレベルでコロナ面の中脳/後脳をブロックする。
5. 組織処理
- 生化学のプロセス
- 100-12 Hzで10-12 Hzの10パルスの超音波細胞破壊剤を使用して1つの半球から線条体組織を均質化し、200μL Tris-EDTAリシスバッファー(25mM Trisベース、1mM EDTA、1:100プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル)を使用して10分の10mで遠心分離します。
- 上清を慎重に吸引し、150μlのリシスバッファー内でペレットを再構成する。分数は、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングによる生化学的分析に使用されます。
注:水溶液中の不安定性のために調製の1時間以内にプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤含有バッファーを使用してください。
- 神経化学のプロセス
- HPLCのために-80°Cで保存された各サンプルから他の半球から解剖された線条体を利用する。氷上のマイクロフュージチューブ内の線条体組織を解凍し、500-μl 0.3N過塩素酸(PCA)を加え、超音波処理器を使用して均質化します。
注:0.3N PCAの100 mlを作るには、90 ml ddH2Oを測定し、100 mlの段階的なシリンダーに加え、70%PCAの2.58 mlを加え、100 mlマークに持って来ます。このサンプルバッファーは、最大 1 か月間 4°C で保管できます。 - 500 μl 氷冷 0.3N PCA の超音波ストリアテの組織、10~12 Hz で 10 パルス、氷の上に置きます。均質性を確保するために、サンプルを10秒間2回目に超音波処理し、16,100 xgで4oCで12分間遠心分離機を行う。
- 直ちに上清を1.5mlマイクロ遠心分離チューブにデカントし、-80°Cで保管してください。 フード内のペレット分率を空気乾燥させます。
- HPLCによるドーパミンおよびその代謝産物、3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸(DOPAC)およびホモバニル酸(HVA)を電気化学的検出で測定するために使用するまで-80°Cで上清を維持します。
- 乾燥したら、ペレット分率を0.5N NaOH(500 μL)で再構成し、短時間超音波処理します。Lowry法を用いた全タンパク質の測定に使用するまで、4°Cで再構成されたペレット分率を保存します。
- HPLCのために-80°Cで保存された各サンプルから他の半球から解剖された線条体を利用する。氷上のマイクロフュージチューブ内の線条体組織を解凍し、500-μl 0.3N過塩素酸(PCA)を加え、超音波処理器を使用して均質化します。
- 免疫検査のためのプロセス
- 浸漬固定中脳ブロックは、4%ホルムアルデヒド水溶液で一晩ブロックし、グレード付きショ糖溶液中の凍結保護(リン酸緩衝生理食塩水(0.01 M PBS;0.138 M NaCl、0.0027 M KCl、ddH2O、pH 7.4)で24時間、30%までC°Cで沈むまで 凍結保護されたブロックを少しブロットして余分なスクロース溶液を取り除き、ドライアイスで凍結し、使用するまで-80°Cで保存します。
- クライオスタットに中脳と後脳を含む脳ブロックのミクロトーム断面化。
- 組織を-80°Cから取り出し、クライオスタットで-16°Cで1時間平衡化し、組織埋め込み培地に取り付ける。
- 40μmの厚さのコロナセクションを-16°Cで凍結保護溶液(30%スクロース、30%エチレングリコール、pH 7.4)に集めます。 240-um間隔で6つの1.5mlマイクロ遠心分離管に組織を連続して収集し、-20°Cで保管してください。
6. 免疫ブロッティング
- BCAアッセイにより、線条上清分(5.1項に記載されたとおりに調製)のタンパク質濃度を決定する。
- 各サンプルに必要な希釈液を計算し、20 μlの体積で送達されるウェルあたり10 μgを得る。
- 4Xレムリバッファーと均質化バッファーを使用して上清タンパク質を希釈し、1X レムリバッファー溶液で 10 μg のタンパク質を生成します。計算例:
- 必要なタンパク質と体積の最終的な濃度を決定します。この場合、20 μl (0.5 mg/ml) で 10 μg が必要です。
- 必要なタンパク質溶液の最終容積を決定します。ローディングには20 μlが必要ですが、追加のボリュームを用意する必要があります(30 μl)。
- 最終的な体積と濃度が知られているため、タンパク質上清画分の濃度が知られている(BCAアッセイによって決定される)、式を使用して必要なタンパク質上清の体積を計算します。
V上清 = (Vファイナル x Cファイナル)/C 上清
したがって、1.5 mg/mlの上清タンパク質濃度に対して、
V上清 = (30 μl x 0.5 mg/ml)/1.5 mg/ml
V上清 = 10 μl - 30 μlの体積(30 μl / 4 = 7.5 μl)で1x濃度を得るために必要な4Xレムリバッファの量を計算します。注:4Xレムリバッファーは、サンプル調製中に1倍の強度に希釈する必要があります。
- 30 μlにボリュームをもたらすために必要な均質化バッファーの量を計算します (そして、0.5 mg/ml の所望の最終タンパク質濃度を得る):
- 10 μlのタンパク質上清を12.5 μlの均質化バッファーにピペット処理してサンプルを調製します。30-μlサンプルの作業溶液と0.5mg/ml濃度の4Xレムリバッファーを7.5 μl加えます。
- 記載の手順を使用してすべてのサンプルを準備し、渦と5分間沸騰させます。
注:ボイリング時の圧力による漏れや開通を防ぐため、スクリュートップマイクロ遠心チューブを使用してください。 - 5分後、すぐに氷の上に置きます。ゲル当たりのサンプル作業用溶液(タンパク質10μg)を20 μlロードします。SDS-PAGEによるタンパク質サンプルを12%トリスグリシンゲルに分けます。
- 分子量の確認には、染色前のタンパク質ラダーを使用してください。ランニングバッファは、25 mMトリスベース、192 mMグリシン、0.1%SDS、およびdDH2O、pH 8.3です。
- 電気泳動によって別々のタンパク質:80Vで、ウェル(10分)と125V(約1時間、タンパク質ラダーが完全に分離するまで)をクリアしてタンパク質を解決します。
- トリスグリシン移動バッファー(25 mMトリス、192 mMグリシン、0.04%SDS、20%メタノールおよびdH2O、pH 8.3)で0.2 μmニトロセルロース膜を使用してタンパク質からニトロセルロースへの転写を一晩4°Cで40 Vで行います。
- ニトロセルロースブロットを1x Tris生理食合(TS;25mMトリス、0.9%NaCl in ddH2O、pH 7.4)で10分間、ポンソーSのRT.lncubateで5分間洗浄し、ddH2Oで洗浄し、同等タンパク質ローディングの大まかな検証を提供します。PBSを使用して、ノートとデステインのレコードを保持するために画像をスキャンします。
注:または、HClを含むミリ-QまたはddH2Oでブロットを洗う(0.2%)約5分間。レコードをスキャンします。後続のインキュベーションステップ(すなわちブロッキングバッファー内の場所)によって膜からポンソーS染色を除去する。 - TSの5%非脂肪粉乳粉のブロックブロットはRTで1時間、ウサギの抗チロシンヒドロキシラーゼ(1:1000)、抗β-アクチン(1:200)で4ºCで24hをインキュベートします。抗GFAP(1:1000)5%乳TS。
- TSで0.05%Tween-20と1 x 5分でTSで3 x 5分を洗浄し、HRP共役二次抗体(5%ミルクを含むTSで1:5000)でインキュベートし、一次の種に一致し、RTで2時間洗浄する。
- 同量のルミノールおよび過酸化物溶液を用いて化学発光基質を調製し、1〜3分間塗布します。暗室では、フィルム露出のためのプラスチックスリーブにブロットを置き、フィルムにさらします。フィルムは、自動プロセッサを使用して開発されます。
- 37°Cの37°Cで30分間ストリップブロットを取り、TSで3x 10分を0.05%Tween-20で洗浄し、TSで1x 10分を洗浄し、その後、ローディングコントロールまたは他の目的タンパク質を再プローブします。
- 光密度測定用のイメージJソフトウェアによる信号を定量化し、内部ローディング制御 β–actinに正規化します。
7. 神経化学
- 分析のための組織は、セクション5.2で上述したように調製される。モバイルフェーズのレシピについては、表1を参照してください。
注:すべての試薬は、純粋≥99.0%の純度およびHPLCグレードでなければなりません。清潔で専用のガラス製品と攪拌棒でバッファの完全性を確保します。移動相バッファーは、準備の 7 日以内に利用する必要があります。- リン酸二水素とクエン酸の重量を量り、ddH2Oの1 Lを加え、2-Lの段階的なシリンダーで混合する。0.22μmのGSTF膜を通して溶液をフィルター処理します。
注: これは、リン酸塩およびクエン酸の汚染物質の抽出を最大化し、背景電流を最小限に抑えるのに役立ちます。 - OSAの後にアセトニトリルとEDTA溶液を加えます。PHをリン酸で3.0に調整する前に、HPLCグレードのddH2Oを約1900mlに加えます。
- HPLCグレードddH2Oを2-Lマークに加え、2-Lフラスコに注ぎます。専用のスターバーを追加し、10分間真空下で攪拌して移動相>脱気します。
- リン酸二水素とクエン酸の重量を量り、ddH2Oの1 Lを加え、2-Lの段階的なシリンダーで混合する。0.22μmのGSTF膜を通して溶液をフィルター処理します。
- ドーパミンの標準を準備します, 標準曲線の DOPAC と HVA.標準の在庫ソリューションは、0.3 N PCAで1mg / mlで調製されます。
- ドーパミン-HClの12.4mgを量り、1mg /mlドーパミンを作るために0.3 N PCAの10.0 mlを加えます。
- 10.0 mgのDOPACを量り、1mg/mlのDOPACを作るために0.3 N PCAの10.0 mlを加えます。
- 10.0 mg HVAの重量を量り、1mg /ml HVAを作るために0.3 N PCAの10.0 mlを加えます。
- ストックソリューションから作業標準ソリューションを準備します。5点標準は、集中曲線を生成するために使用されます。
- 線条体ドーパミンの測定のために、12.5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、および200 ng /mlの標準濃度を調製してください。
- 線条体DOPACの場合、標準濃度の2.5 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、および40 ng/mlを調製します。
- 線条性HVAの場合は、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml、および80 ng/mlの標準濃度を調製します。
- 5点標準を生成:0.3N PCAを使用して5 μg /mlに1mg /mlドーパミンストック溶液を希釈します。0.3N PCAを使用して1 mg/mlのDOPACストック溶液を1 μg/mlに希釈し、0.3N PCAを使用して1mg/ml HVAストック溶液を2 μg/mlに希釈します。
- 5 μg/ml ドーパミン 1 ml、1 μg/ml DOPAC 1 ml、2 μg/ml HVA 1 ml を 25 ml の体積フラスコに移し、容積を 0.3 N PCA で 25 ml のマークにします。
注:体積フラスコの混合基準は、5点標準の最高濃度を含んでいる:ドーパミンの200 ng /ml、DOPACの40 ng / ml、およびHVAの80 ng / ml。 - 混合規格1mlをクリーンな1.5mlマイクロ遠心チューブに移します。1:1シリアル希釈を4回実行し、その後の4点規格を生成します。
- 例えば、混合規格の250 μlに、サンプルバッファーと渦の250 μlを徹底的に加え、元の濃度の50%で混合標準を生成します。望ましい希釈が達成されるまで繰り返しプロセス.
- HPLCシステム(ポンプ、オートサンプラー、逆相カラム(C18、150×3.2mm、3 μm)を準備します。新鮮な移動相でポンプをパージして、HPLCシステム内の以前の溶液をすべて交換し、気泡を新鮮な移動相に閉じ込めます。オートサンプラーを4°Cに冷やします。 カラムを35°Cに温め、全圧を下げます。
- 電気化学検出器の第1電極と第2電極の電圧を-150 mVと220 mVにそれぞれ設定します。システムを少なくとも2時間平衡化し、理想的には一晩で、移動相を0.2 ml/minの流速で平衡化します。
注: 平衡化の間、セルはオンにし、ベースライン読み取り値は監視されます。安定した読み取り値は、システムが使用できる状態であることを示します。平衡段階の2時間、移動相を再循環させる代わりに廃容器に入れるようにする。この期間の後、移動相は平衡のために一晩リサイクルすることができる。 - 平衡が完了したら、移動相流量を0.6 ml/minに調整します。5点の標準のそれぞれ20 μlを注入して下さいます。
- 電気化学検出器の第1電極と第2電極の電圧を-150 mVと220 mVにそれぞれ設定します。システムを少なくとも2時間平衡化し、理想的には一晩で、移動相を0.2 ml/minの流速で平衡化します。
- 氷上の線条体サンプルを解凍し、各サンプルの2 x 20 μlをHPLCシステムに注入します。各線条体サンプルのセット全体で、最初とランダムに標準を利用します。
- ソフトウェアを使用して、標準およびサンプルによって生成されたドーパミン、DOPAC、およびHVAピークの下の領域を分析します。ピーク下の面積を対応する標準の5点曲線の面積と比較して、保持時間と測定によって検測を識別します。
- セクション5.2.3で説明したようにペレット分率を準備します。線条体ペレットに対して低タンパク質アッセイを行う。注: このアッセイは、線条体サンプルに存在するタンパク質の量をmg/mlで測定します。この情報は、検体のng/mg濃度を決定するために使用されます。
8. 免疫検査
- GFAP/THデュアル免疫蛍光
- -20°C冷凍庫から切片付き中脳を含むチューブを取り除き、RT.PBSを含むトレイの凍結保存液から実質的なニグラを含む組織切片を取り除きます。
- 自由浮遊免疫化学のためのポリエステルメッシュ底を用いるポリスチレンの挿入物のティッシュセクションを置く。PBSで3×5分洗います。
- 各ウェルで180-μlブロック溶液(5%正常ロバ血清、1%PVP、1%BSA、0.3%トリトンX-100)を用いて96ウェルプレートに切片を移します。RTで40分インキュベート。
注:すべての洗浄およびインキュベーションのステップは、シェーカー上の軽い攪拌で行われます。 - 一次抗体溶液(ウェルあたり180 μl)を含むウェルに切片を移す。一次抗体カクテル、ウサギの抗GFAP(1:1000)および羊抗TH(1:400)を1%BSAと0.3%TX-100でPBSで希釈し、4°Cで24時間インキュベートする。 一次種からのIgGは、陰性免疫染色制御として機能する。
- 二次抗体カクテル(1:200ロバ抗ウサギ568と1:200 FITCロバ抗羊をPBSで0.1%TX-100)でインキュベートします。準備および孵化の間に光から解決を保護するためにホイルを使用する;RTで2時間インキュベートする。
- 陰性対照の場合、一次種からIgGの切片を一次抗体に使用したのと同じ濃度に希釈してインキュベートする。
- 2 x PBSと1 x TSをRTでそれぞれ5分間洗浄し、Hoechst染色とカバースリップを備えた取り付け媒体の上に組織セクションを取り付け、スライドを取り付けます。
- 二次抗体カクテル(1:200ロバ抗ウサギ568と1:200 FITCロバ抗羊をPBSで0.1%TX-100)でインキュベートします。準備および孵化の間に光から解決を保護するためにホイルを使用する;RTで2時間インキュベートする。
- 2 x PBSと1 x TSをRTでそれぞれ5分間洗浄し、Hoechst染色とカバースリップを備えた取り付け媒体の上に組織セクションを取り付け、スライドを取り付けます。
- 4°Cのスライドボックスに保存することで、イメージングまでスライドを光や酸化から保護します。
- まず陰性コントロールを分析して蛍光のバックグラウンドレベルを決定し、次に蛍光顕微鏡を用いて陽性免疫反応性を評価する。
- Iba1クロマーゲン沈殿を用いた免疫染色法
- -20°C冷凍庫から切片付き中脳を含むチューブを取り除き、RT.PBSを含むトレイの凍結保存液から実質的なニグラを含む組織切片を取り除きます。
- 自由浮遊免疫化学のためのポリスチレン挿入物にティッシュセクションを置く。PBSで3 x 5分のセクションを洗浄し、エピトープ検索のために、前加熱10 mmクエン酸一水和物、pH 9.0、80°Cを含む12ウェルプレートに直接セクションを配置します。
- RTでプレート20分を冷却し、セクションを挿入に戻し、PBSで3 x 5分洗浄します。
- 180 μlブロッキング溶液(通常のヤギ血清10%、PBS中1%BSA)を含む96ウェルプレートに切片を移し、RTで40分間インキュベートします。
- 180-μl希釈された一次抗体を含むウェルに切片を移す(1%BSA-PBSで1:1000)。4°Cで一晩インキュベート。
- セクションを挿入に転送します。3 x 5分間PBSを洗浄し、1時間RTでビオチン化二次抗体(1:200の正常血清-PBS1.5%の正常な血清-PBS)を適用します。
- ABC溶液を30分前に準備します。3 x 5分PBSを洗浄し、RTで1時間ABC溶液に移します。
- フードにDAB溶液を準備します。PBSで2x 5分、TSで1x 5分を洗浄し、DABでセクションをインキュベートします。
- 3-4分間開発します。負のコントロールは、色が明るいままにする必要があります。
注:DABは既知の発がん性物質であるため、ヒュームフードでこのステップを実行してください。ddH 2 Oの0.2M過マンガン酸カリウムの溶液は、偶発的な点滴の場合には近接して維持されるべきである。
- 3-4分間開発します。負のコントロールは、色が明るいままにする必要があります。
- ddH2Oで簡単にセクションをすすい、TS 3 x 5分で簡単にすすい。プラススライドにセクションをマウントし、ヒュームフードで一晩空気乾燥。
- DAB廃棄物をddH2Oで0.2M過マンガン酸カリウム等量で除染し、ヒュームフードに適当にラベル付けされたDABゴミ箱に保存する前に、一晩ヒュームフードでインキュベートします。
注: 漂白剤溶液は、DABの変異特性を排除しません。- 再利用するアイテム(ポリスチレンインサート)を除染し、洗剤で洗浄します。
- クレシルバイオレット(CV)で軽く脱水/カウンターステイン。脱水/洗浄ステップは全て3分:エタノール70%、95%、100%、95%、ddH2O、CV(30秒)、ddH20 x 2、95%エタノール+氷酢酸(0.1%)x2、100%エタノール、キシレン。
- 遠位トルエンキシレン実装媒体のカバースリップとフュームフードで乾燥。
- 光顕微鏡で陽性免疫反応性を観察する。一次種からのIgGは、陰性免疫染色制御として機能する。
9. 統計
- 一方向分散分析(ANOVA)による平均差を評価し、遺伝子型と二方向ANOVAの違いを比較して、遺伝子型と毒性物質の処理の違いを比較します。ANOVAテスト(p≤0.05)で差異が観察された場合は、TukeyのHSDポストホック分析を利用します。
注:実験(n = 6-9マウス/グループ)は、再現性を確保するために最低2回実施されます。
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Representative Results
この毒素暴露パラダイムは、MPTP-対生理食動物の中で、有意かつ検出可能な20%の線条体ドーパミン枯渇を生じさせることができる。MPTP の異なるロットは、わずかに多かれ少なかれ病変をもたらす可能性があることに注意することが重要です。したがって、より良い精度のために、新しい多くのニューロトキシンが利用される場合、トランスジェニックで使用する前に野生型マウスの予備実験が推奨される。軽度から中等度の病変の使用は、トランスジーンの影響を観察することを可能にする;重度の病変は、損傷が強すぎて減衰したり、有害な損傷を与えたりして「床効果」を生み出し、有害な遺伝的変化の影響を食い止める可能性があります。5-LOXイソザイム欠損マウスではMPTPの効果は大きく異なっていたが、12/15-LOXアイソザイム欠損マウスは異なっていた(図1)。さらに、これらの方法により、生理学後のマウスにおける5−LOX欠乏症によるドーパミンレベルの有意差を見分けることができた(図1)。
THおよびGFAPに対する免疫ブロット法は、それぞれ、野生型マウスにおける線条体のレベルにおいて、5-LOXアイソザイム欠損線条体において減少した効果を認めた(図3A および 3B)。病変は、実質的なニグラのレベルでも識別可能である(図2A および 2B)。同一マウスにおいて、TH陽性ニューロンの枯渇とGFAP免疫反応性の増加は、二重標識免疫蛍光標識を用いて観察可能である(図2A)。さらに、野生型における微小グリア活性化(すなわち Iba1免疫反応性)が著しく上昇したが、5-LOXイソザイム欠損ではないが、MPTP曝露後の立体ニグラにマウスが明らかである(図2B)。したがって、MPTPモデルは、ニグラル変性および炎症に対する遺伝的素因の影響を評価するための有用なツールを提供することができる。
図 1.MPTP チャレンジ後の線条体ドーパミンに対する LOX アイソザイム選択的効果.(A)線条体均質物は、WTからHPLCによってドーパミン(DA)を測定するために使用され、5-LOX -/-生理食音またはMPTP(n=6-8/群)を与えられたゴミを含む。‡, 遺伝子型による重要な効果をマーク;p<0.05.*, 遺伝子型と治療に起因する重要な効果をマーク;p<0.05.5-LOX-/-マウス(n.s.)では、このトランスジェニックラインにおいて、MPTPが線条体DA枯渇を生じなかったことを示す治療に有意な差はなかった。(B)線条体均質物は、WTおよび12/15-LOX-/- 生理食音またはMPTP(n=6-9/群)を与えられたゴミを測定するために使用された。遺伝子型によるDAレベルに有意差は認められなかった。両方の遺伝子型において、MPTP治療による有意かつ同様の減少が注目された。*, p<0.01.データは SEM ±平均値として表示されます。
図 2.MPTP チャレンジに続くニグラル TH およびアストログリアに対する 5-LOX アイソザイム効果。(A) TH(FITC;緑)およびGFAP(568;赤色)の免疫活性の免疫蛍光染色は、生理食動物またはMPTPを与えられたWTおよび5-LOX-/-ごみ類のニクラル脳切片で行われた。WT-MPTP群では、TH陽性細胞体(*)が少なく、GFAP免疫反応性が高まることが明らかである。Bar = 25 μm. (B)ミクログリア上のIba-1の免疫体系の神学はDAB(褐色クロマチン)を用いて検出された。セクションはクレシルバイオレットによって対抗された。WTおよび5-LOX-/-サモリ類のニトラルセクションが、生理的またはMPTPで処理されたリターメイトを評価した。増殖した細胞体と長い分岐過程を有するミクログリアは、生理食突処理マウス(矢印頭部)から実質的なニグラで観察される。丸みを帯びた細胞体と短く肥厚したプロセスを有する活性化されたミクログリアは、MPTP処理マウス(矢印)から立体ニグラで観察された。バー = 10 μm。
図 3.5-LOXアイソザイムは、毒性侮辱に続く線条体THおよび炎症性に及ぼす影響を示す。(A)線条体THタンパク質レベルを、生理食音またはMPTP(n=6-8/群)を与えられたWTおよび5-LOX--リッターメイトからのホモジネートのウェスタンブロット分析によって半定量的に測定した。光学濃度で測定した免疫反応性を、βアクチンに正規化した。*、p<0.05.(B)同様に、GFAPは、WTおよび5-LOX---セタリン酸エステル類(n=6-8/群)で与えられた線条体ホモゲネートのウェスタンブロット分析によって半定量的に測定され、βアクチンに正規化された。*、p<0.05.データは SEM ±平均として示されます。
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Discussion
この遺伝子環境相互作用研究の設計により、ニグロストリアタル経路における5-LOXアイソザイムの二重性に関する新しい情報を得ることを可能にしました。5-LOXイソザイムとその野生型のゴミを欠いたトランスジェニックでの生理食素またはMPTP治療後にHPLCを測定することで、その欠乏は毒性条件下で保護されているように見えるが、通常の条件下では酵素の欠乏は線条体ドーパミンレベルを低下させ、有害である可能性があることに注意することができた。したがって、5-LOXアイソザイムが正常な条件下で線条性ドーパミン作動性トーンに寄与することを実証することができるが、毒性の挑戦4に続く損傷に寄与することができる。
さらなる評価は、ニグロストリエータ毒性におけるLOXアイソザイムの役割に関する新たな機械学的洞察を与えるべきであるが、西洋のブロット分析(図3)と免疫構造学的研究(図2)は、神経炎症マーカーが少なくとも部分的にはMPTPにさらされた5-LOXイソザイム欠損コホートで減衰していることを明らかにした。これらの知見は、古典的な生化学的および組織学的技術を用いて、マイクロおよびアストログリア活性化4の増強における5−LOX製品の重要な役割を示す。
調査した遺伝子環境相互作用に応じて、グリア活性化に加えて病理学的読み出しが解析され得る。PDにおいて特に重要なのは、サブスタニグラにおけるドーパミン作動性ニューロンの喪失および潜在的に病理学的蓄積およびα-シヌクレインの凝集である。この線に沿って、α-シヌクレイン過剰発現を有するトランスジェニックマウスにおける毒性物質暴露の影響は、ニガラル細胞死(すなわち 、非偏型の立体細胞数を用いる)および不溶性αシヌクレイン沈着32〜35の評価によって監視されてきた。
ここで説明するパラダイムで用いられるMPTP用量は、控えめで、有意な線条体損傷(図1)および線条体および実質的なニグラの両方でのグリア活性化を伴う軽度の病変を生じる(図2 および3)。典型的には、毒性剤の高用量は、23,24,32,36-38,39の強いニグラードパミン作動性細胞喪失および線条体ドーパミン枯渇を生成するために使用される。MPTP の毒性はベンダーとロットによって異なる可能性があることに注意してください。したがって、用量は、所望の病変を生成するために調整する必要があります.さらに、考慮しなければならない他の要因は、研究のために利用される動物の緊張および性別である。神経毒に対する選択的感受性は、マウスの特徴的なバックグラウンド株において実証されているが、少なくとも部分的には、JNKおよびc-Jun36-39を含む変性を媒介する細胞内経路の活性化の相違による現象である。MPTP毒性の性依存性差も40,41と報告されており、両性が悪い繁殖ラインに使用されるトランスジェニックマウスを用いた研究のばらつきに寄与する可能性がある。このような場合、セックスマッチのワイルドタイプコントロールの使用は重要です4.このような性関連の効果は、一方の性別が一方のラインに使用され、男女とも他方に対して5-12/15-LOX欠損マウスの影響をテストする実験の間でWTマウスで観察される病変の違いを説明するかもしれない(図1)。遺伝子環境相互作用研究では、重篤な傷害(例えば>80%の線条性ドーパミンの減少)を生じるMPTPの課題は、可能な遺伝的効果を隠す可能性があるため、推奨されません。
MPTP曝露はニマル細胞死3,42、線条体ドーパミン枯渇3、複雑なI阻害43-45、およびヒトPDで報告されているグリア活性化46,47 を産生するが、 マウスでは、安定したパーキンソニズム(すなわち 運動障害)および率直なα-シヌクレイン病理(すなわち 、レビー体および神経突起)を完全に再現する徐々に進行性の変性は、モデルでは起こらない。しかし、MPTPマウスはPD関連神経変性に寄与する細胞内経路を理解する上で重要な役割を果たしていることに注意することが重要です。例えば、暴露パラダイムの変動は、毒性の明確なメカニズムの活性化を明らかにしている:低用量、亜急性暴露は限られた免疫応答を 有するアポトーシス細胞死48 を促進するが、より高用量で急性治療は顕著な微小活性化50を産生する。実際、このような要因は、有効性研究のためにモデルを利用する際に考慮されるべきであり、現在の研究に関連して、潜在的な遺伝的危険因子の影響を隠すために。
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Disclosures
開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所NIGMS 056062によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) | Sigma-Aldrich | M0896 | for PD modeling |
| 4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) | American MasterTech Scientific | BUP0157 | for immersion fixation |
| Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) | Sigma-Aldrich | 244252 | for HPLC acid extraction |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | for tissue homogenization |
| Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E1644 | for tissue homogenization |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | for tissue homogenization |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P5726 | for tissue homogenization |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | for Lowry protein assay |
| Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389 | for cryoprotection |
| Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | for IHC |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce/Thermo | 23225 | for protein determination |
| Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well | Invitrogen/Life Technologies | EC60052BOX | for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 | for SDS-PAGE |
| Novex Sharp Prestained Protein Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5800 | protein ladder |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for SDS-PAGE |
| Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | for SDS-PAGE |
| Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent | American MasterTech Scientific | SPM1057C | methanol for transfer |
| Sodium chloride (NaCl), ACS reagent | Sigma-Aldrich | S9888 | saline and buffers |
| Nonfat dry milk powder | Carnation | n/a | for immunoblotting |
| Ponceau S solution in 5% acetic acid | Sigma-Aldrich | P7170 | for immunoblotting |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal | Chemicon/Millipore | AB1542 | for immunofluorescence |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | for immunoblotting |
| Anti-β Actin, rabbit | Sigma-Aldrich | A2066 | for immunoblotting |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal | Chemicon/Millipore | AB5804 | for immunofluorescence |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal | Covance Inc. | SMI-22R | for immunoblotting |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunoblotting |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated | Fisher Scientific | 31462 | for immunofluorescence |
| goat anti-sheep, peroxidase conjugated | Pierce/Thermo | 31480 | for immunofluorescence |
| goat anti-mouse, peroxidase conjugated | Pierce/Thermo | 31430 | for immunofluorescence |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce/Thermo | 34078 | for immunoblotting |
| CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in | Pierce/Thermo | 34089 | for immunoblotting |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Pierce/Thermo | 21059 | for immunoblotting |
| Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | C1909 | for IHC |
| Normal Donkey Serum | Millipore | S30-100ML | for IHC |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Sigma-Aldrich | P5288 | for IHC |
| Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized | Sigma-Aldrich | A3294 | for IHC |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-01 | for IHC |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled | Invitrogen/Life Technologies | A10042 | for IHC |
| Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC | Jackson ImmunoResearch | 713-095-147 | for IHC |
| VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | for IHC |
| Normal Goat Serum | Millipore | S26-100ML | for IHC |
| VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG ) | Vector Laboratories | PK-4001 | for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions ) |
| DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine | Vector Laboratories | SK-4100 | for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use) |
| Hydrogen peroxide, 30% | Sigma-Aldrich | 216763 | for quench step in IHC |
| Rabbit anti-Iba1 | Biocare Medicals | CP290A | for IHC |
| Cresyl Violet Solution, Regular Strength | FD Neurotechnologies | PS102-01 | counterstain for Iba1 IHC |
| 95% Ethanol, reagent alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | dehydration for IHC |
| 100% Absolute ethanol | Mallinckrodt | 7019-10 | dehydration for IHC |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | destaining for IHC |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | clearing agent for IHC |
| DPX Mountant | Sigma-Aldrich | 06522 | mounting medium for DAB IHC |
| O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium | American MasterTech Scientific | EMOCTCS | embeddium medium for cryostat cutting |
| Potassium permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | to decontaminate DAB solution |
| Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | for HPLC |
| 3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) | Sigma-Aldrich | 850217 | for HPLC |
| Homovanillic acid (HVA) | Sigma-Aldrich | H1252 | for HPLC |
| Perchloric acid (PCA) - 70% | Sigma-Aldrich | 244252 | for HPLC |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Sigma-Aldrich | 71504 | for HPLC |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | for HPLC |
| 1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) | Sigma-Aldrich | O8380 | for HPLC |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | for HPLC |
| Acetonitrile | EMD | AX0145-1 | for HPLC |
| HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) | Millipore | for HPLC | |
| 0.22 µm GSTF membrane | Millipore | for filtration | |
| Corning Netwells | Sigma-Aldrich | CLS3477 | polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC |
| Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) | MSE | MSE.41371.274 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414R | |
| ESA MD-150 reverse-phase column | ESA | ||
| HPLC Pump (Ultimate 3000) | Dionex | ISO-3100BM | |
| HPLC Autosampler (Ultimate 3000) | Dionex | WPS-3000TSL | |
| Electrochemical detector | ESA | Coulochem III | |
| Guard Cell | ESA | 5020 | |
| Analytical Cell | ESA | 5011A | |
| Chromeleon software | Dionex | ||
| Eclipse E400 | Nikon | E400 | light/fluorescent microscope |
| Disposable mouse cage | Ancare | N10HT | |
| Microfilter top | Ancare | N10MBT | |
| 5-LOX- deficient mice | The Jackson Laboratory | 004155 | |
| 12/15-LOX-deficient mice | The Jackson Laboratory | 002778 |
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