Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Parkinson Hastalığında Maskeyi Düşürme Duyarlılık Mekanizmalarına Gen-Çevre Etkileşim Modelleri

Published: January 7, 2014 doi: 10.3791/50960
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Center for Health Sciences, SRI International, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California-Santa Cruz

Summary

Lipoksijenaz (LOX) izozimler nöroinflamatuarasyonu ve nörodejenerasyonu artırabilecek veya azaltabilecek ürünler üretebilir. Gen-çevre etkileşimi çalışması LOX izozime özgü etkileri tanımlayabilir. İki LOX izozim eksikliği olan transgenik çizgilerde nigrostriatal hasarın 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidromiridin (MPTP) modelinin kullanılması, LOX izozimlerinin dopaminerjik bütünlük ve inflamasyona katkısının karşılaştırılmasını sağlar.

Abstract

Lipoksijenaz (LOX) aktivitesi Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif bozukluklara karışmıştır, ancak Parkinson hastalığı (PD) patogenezinde etkileri daha az anlaşılmaktadır. Gen-çevre etkileşim modelleri, sadece genetik veya toksik bir hastalık modeli kullanılarak gözlemlenemeyen toksisitedeki belirli hücresel yolların etkisinin maskesini düşürmede yardımcı olur. Farklı LOX izozimlerinin PD ile ilgili nörodejenerasyona seçici olarak katkıda bulunup bulunmadığını değerlendirmek için, transgenik(yani 5-LOX ve 12/15-LOX eksikliği) farelere hücre yaralanmasını ve bozukluktaki ölümü taklit eden bir toksinle meydan okunabilir. Burada, LOX izozimlerinin PD ile ilgili nörodejenerasyona belirgin katkılarını ortaya çıkarmak için nigrostriatal bir lezyon üreten nörotoksin, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidromiridin (MPTP) kullanımını açıklıyoruz. Farede MPTP kullanımı ve insan dışı primat, PD'deki nigrostriatal hasarı yeniden oluşturmak için iyi kurulmuştur. MPTP kaynaklı lezyonun kapsamı, dopamin ve metabolitlerinin HPLC analizi ve dopamin sentezi için hız sınırlayıcı enzim olan tirozin hidroksilaz (TH) için striatumun yarı nicel Batı blot analizi ile ölçülür. LOX iozim seçici duyarlılığı gösterebilen inflamatuar belirteçleri değerlendirmek için substantia nigra içeren beyin bölümlerinde glial fibril asidik protein (GFAP) ve Iba-1 immünofizokimyası, striatal homojenatlar üzerinde ise GFAP Batı blot analizi yapılır. Bu deneysel yaklaşım, nigrostriatal dejenerasyon ve PD'nin altında kalan gen-çevre etkileşimleri hakkında yeni içgörüler sağlayabilir.

Introduction

Gen-çevre etkileşim modellerinin kullanımı, idiyopatik Parkinson hastalığını (PD) etkilemesi muhtemel risk faktörlerini taklit etmek için bir yaklaşım sağlar ve sadece genetik veya toksik bir sistemin kullanılmasıyla aydınlatılması muhtemel olmayan mekanistik içgörüleri ayırt etme fırsatı sunar1,2. Burada bu noktayı göstermektedir ve lipoksijenaz (LOX) izozim aktivitesinin nöroinflamasyon ve toksisite üzerindeki seçiciliğini daha iyi anlamak için nigrostriatal dejenerasyon3'ün 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidromiridin (MPTP) fare modelinin uygulanmasını açıklıyoruz4. LOX izozimler için bir rol periferik bozukluklarda5,6 ve inme 7 ve Alzheimer hastalığı8,9 dahil olmak üzere CNS hastalığında yaygın olarak değerlendirilmiş olsa da, izozim ailesinin PD ile ilgili nigrostriatal fonksiyon ve dejenerasyondaki rolü iyi anlaşılmamıştır ve çalışmayı garanti eder. MPTP nörotoksin, nigrostriatal yolun tercihli dejenerasyonunu gösterir ve PD hastalarında motorik bozuklukların altında yatan striatal dopamin tükenmesi ve nigral dopaminerjik hücre kaybını rekapitulate eder10. Bu model, nonmotor ve motor PD davranışlarının tam kadrosunu ve frank α-sinüklein pozitif Lewy vücut patolojisini yeniden üretmese de, nigrostriatal hasara katkıda bulunan yeni mekanistik hedeflerin aydınlatılmış olması ve erken aşama çevirisel testler için yararlı olmuştur, çünkü striatal dopamin kaybı11-15eşliğinde nigral hücre ölümünü güvenilir bir şekilde üretmek için mevcut en iyi karakterize noninvaziv modeldir. MPTP farenin geniş kullanımı, akut, subakuttan kronik16-18'ekadar değişen paradigmalarla, tedavi rejimine bağlı olarak farklı toksisite mekanizmalarının aktivasyonu ilehafif ila şiddetli nigrostriatal hasara neden olacak şekilde standartlaştırmaya izin verdi18,21,22. Sonuç olarak, bu,23-25kullanılan terapötik ajana veya transgenik modele bağlı olarak gelişmiş veya azaltılmış nigrostriatal yaralanmaya neden olabilecek bir 'lezyon penceresinin' hedef alınmasına izin veriyor.

Çeviri ve keşif biyolojisi çalışmaları için de gerekli olan, hasarı değerlendirmek için kullanılan teknikler ve bu tür yöntemlerin sağladığı kanıtlardır. MPTP fare modeli için, Lezyonu değerlendirmek için belirlenen metrikler, HPLC tarafından dopamin ve metabolitleri de dahil olmak üzere striatal dopaminerjik ton belirteçlerinin ölçümü ve tirozin hidroksilazının (TH) Batı blot analizi, dopamin sentezinde hız sınırlayıcı enzim ve Batı blot analizi ve immünostokimya kullanılarak glial aktivasyon gibi dejeneratif olaylarıngöstergeleridir 4. Bunlar klasik nörokimyasal, biyokimyasal ve histolojik prosedürler olmasına rağmen, teknikler nigrostriatal dopaminerjik yol içindeki hasarın boyutu hakkında kritik ve tekrarlanabilir okumalar sağlar, toksisite mekanizmalarını gösterir ve PD'deki dejeneratif olayları anlamada değerli araçlar olduğu kanıtlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Tüm hayvan prosedürleri ve hayvan bakım yöntemleri kurumun Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmalıdır. Burada açıklanan çalışma, SRI International'ın IACUC tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak gerçek gerçekleştirildi.

1. LOX eksikliği olan farelerin edinimi ve bakımı

  1. 7-8 haftalıkken 5-LOX eksikliği veya 12/15-LOX eksikliği olan fareler ve ilgili suş ve cinsiyetle eşleşen kontrolleri satın alın ve varıştan sonra tesise alışmak için birkaç gün izin verin.
  2. Fareleri 12-h açık-karanlık bir döngüde grup konutunda koruyun ve yiyecek ve içme suyu ad libitumverin.

2. MPTP önlemleri, depolama, hazırlama, arındırma ve bertaraf

Not: İnsanlarda intravenöz maruziyetten kaynaklanan MPTP zehirlenmesinin parkinsonizme neden olduğu gösterilmiştir10; MPTP son derece lipofiliktir ve kan-beyin bariyerini kolayca geçebilir26. Güvenli kullanım, detoksifikasyon ve bertarafı sağlamak için ihtiyati önlemler alınmalıdır. Metabolizması, monoamin oksidaz B (MAO-B)27enzimi tarafından 1-metil-4-fenil-2,3-dihydropyridinium'a dönüştürme dahil olmak üzere birden fazla adım içerir. Mao-B inhibitörleri kazara insan zehirlenmesi durumunda kullanılabilir.

  1. Kurumun Sağlık ve Güvenlik Komitesi tarafından dikte edilen MPTP'yi kullanmadan önce personelin uygun güvenlik ve elleçleme eğitimlerine sahip olduğundan emin olun. Her kurum, literatür17,22'dekapsamlı bir şekilde özetlenen önerilere dayanarak MPTP kullanımı için kendi standart çalışma prosedürlerini kurabilir ve uygulayabilir.
  2. Hazırlık öncesinde, aşağıdakiler de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyin: tek kullanımlık laboratuvar önlüğü veya tam vücut kıyafeti, çift nitril eldiven, cerrahi maske, saç örtüsü, güvenlik gözlükleri ve tek kullanımlık ayakkabı kapakları. Hayvanlar ve/ veya yatak takımları ele alırken MPTP, enjeksiyon paradigması ve enjeksiyon sonrası 72 saat hazırlanması sırasında uygun KKD giyilmelidir.
  3. Hazırlık öncesinde hesaplamalar gerçekleştirin. Hacimlerin dolması için kurumsal yönergelere uyulmalıdır; 100-150 μl'nin teslimi tipik olarak 25-30 g fareler için kullanılır.
    1. Salinde 3 mg/ml MPTP çözeltisi hazırlamak için bir düzeltme faktörü uygulayın (1.211 MPTP-HCl: 1.0 MPTP serbest taban); salin aracında MPTP-HCl konsantrasyonu 3.633 mg/ml'dir.
    2. Nörotoksini kullanmadan önce MPTP hazırlama ve potansiyel dökülme dekontaminasyonu için gerekli tüm ekipman, malzeme ve reaktifleri hazırlayın.
  4. MPTP-HCl kaynak şişeyi uygun depolama konumundan çıkarın.
    Not: MPTP RT'de ikincil bir kap içindeki kapalı bir şişede muhafaza edilmeli ve "MPTP" etiketli kilitli bir dolapta saklanmalıdır.
    1. Dökülen toz riskini azaltmak için pulları çevreleyen alanı % 10 çamaşır suyu çözeltisi ile nemlendirilmiş pedler veya kağıt havlularla örtün. Önlem olarak dokuları ve %10 çamaşır suyu çözeltisi yakınında tutun.
    2. Duman kaputunda bulunan analitik bir denge kullanarak, %10 çamaşır suyuna batırılmış doku içeren ikincil muhafaza ile cam şişeye 50 mg MPTP-HCl ağırlığındadır. Cam şişeyi "MPTP" konsantrasyonu ve tarihi ile etiketle.
    3. Kaynak şişeyi kapatın ve dışını% 10 çamaşır suyu ile silin.
  5. Yavaşça şişeye 13.763 ml steril salin ekleyin ve karıştırmak için tamamen kapatın. (Çözüm 3.633mg/ml MPTP-HCl'dir.)
    1. Kaputta, MPTP çözeltisini% 10 ağartıcı batırılmış dokuya sahip ikincil bir kap içindeki etiketli enjeksiyon şişesine 0,22 μm filtre kullanarak filtrasyonla dikkatlice sterilize edin. Herhangi bir dökülmeyi ağartıcıya batırılmış doku ile temizleyin.
    2. Keskinleri ve şişeleri uygun şekilde etiketlenmiş biyolojik tehlike kabına dikkatlice atın. Hayvan prosedür odasına taşınmak için ağartıcıya batırılmış doku ile ikincil kaptaki şişede MPTP çözeltisini koruyun.
      Not: Buharlaşması bir soluma tehlikesi olduğundan sterilizasyon için MPTP çözeltisini otoklavlamayın.
  6. MPTP kaynak şişesini ikincil kabına döndürün ve depolama konumuna yerleştirin. %10 çamaşır suyu kullanarak 10 dakika boyunca spatula, analitik ölçek ve davlumbaz yüzeyi dekontamine edin.

3. MPTP yönetimi

  1. Su kaynağı olarak "MPTP" (eksi tel gıda ızgarası), tek kullanımlık kafes astarları, önceden ıslanmış gıda peletleri ve hidrojel işaretli polyester filtreli astarlar içeren standart mikroisolatör delikli kapaklarla tek kullanımlık kafesler hazırlayın. Tüm hayvanları tartın ve 15 mg / kg enjeksiyon için gerekli olan salinde 3 mg / ml MPTP'lik rekor hacim.
    Not: MPTP metabolitleri enjeksiyon28,29'dansonra 3 gün boyunca dışkıda tespit edilebilir; bununla birlikte, fareler, hidrofilitesi nedeniyle zarları geçmeyen toksik olmayan bir türev olan MPTP n-oksit salgılar30.
    1. Yukarıda listelenen tüm KKD'yi giymek ve fareleri tek kullanımlık bir emilim pedi üzerinde tutmak, tek kullanımlık 26-gauge tüberkülin şırınga ile günlük 4 gün boyunca intraperitoneal boşluğa (i.p.) 15 mg / kg doz için salin aracı veya MPTP çözeltisi enjekte edin.
    2. Kullanımdan sonra şırınnayı yeniden kapsülleyin; özel ve etiketli bir MPTP biyolojik tehlike keskinlik kabına atın. Kazara damlamaları temizlemek için% 10 çamaşır suyu ve dokuları yakınıda tut.
  2. MPTP enjekte edilen hayvanları tek kullanımlık kafeslere, kafes başına 5 fareye kadar yerleştirin ve açık raflara yerleştirin. Havalandırmalı raflar kullanmayın.
    1. MPTP'yi fareler ve muhafaza odası kapısı içeren rafa son enjeksiyondan sonra 72 saate kadar levhalar yerleştirin.
      Not: Fareler MPTP zehirlenmesinden sonra 12 saate kadar geçici hipotermi yaşadığından, konut odasısıcaklığının22.2 - 24.4 o C arasında olduğundan emin olun. 31
    2. Her kullanımdan sonra çalışma yüzeyini çamaşır suyu ile arındırın (bkz. adım 2.8), kalan MPTP çözeltisinin %10 çamaşır suyuna eşdeğer bir hacim ilavesiyle bertaraf edilmesi ve içeriğin biyolojik tehlike sıvı atık olarak atılması.
    3. Kullanılan tüm KKD'yi özel bertaraf kutusuna atın. Gerekirse, imhadan önce% 10 çamaşır suyu ile püskürtün.
  3. Hayvanları düzenli olarak kontrol edin ve enjeksiyon paradigması sırasında günlük olarak yiyecek ve su kaynağını yenileyin ve son enjeksiyondan sonra 72 saat. Not: Kafesin dışını çevreleyen alanda herhangi bir kirlenme beklenmemekle birlikte, bu bölge önlem olarak çamaşır suyu çözeltisi ile muamele edilir (Adım 2.8'de açıklandığı gibi). Bu dönemde tüm fareleri ve ekipmanları kullanırken dikkatli olunmalıdır.
    1. Son enjeksiyondan üç gün sonra, tüm kafesleri ve astarları uygun şekilde etiketlenmiş biyolojik tehlike torbasına atın. Hayvanlar için düzenli KKD ve normal konut kullanımına devam edin; kapı ve raf levhalarını çıkarın.

4. Doku hasadı

  1. Son MPTP enjeksiyonundan 7 gün sonra hayvanları servikal çıkık ile ötenazi yapın. Koronal düzlemde 1 mm'lik yuvalarla önceden soğutulmuş beyin kalıbını kullanarak beyni hemen buz üzerinde parçalara ayrıştırın.
  2. Striatu ön kommisyon seviyesinde 2 mm kalınlığında bir ön beyin diliminden ayırın.
    1. Neşter kullanarak çevredeki kortikal ve subkortikal bölgeleri çıkarın. Nörokimyasal veya biyokimyasal analiz için her yarımküreden striatal dokuyu ayrı bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüpünde çıtlatın.
  3. Koronal düzlemde orta beyin/hindbrain'i ön hipotalamus ve daldırma-düzeltme dokusu seviyesinde %4 formaldehit sulu çözeltide bloke edin.

5. Doku işleme

  1. Biyokimya süreci
    1. 200-μL Tris-EDTA lizis tamponunda ultrasonik hücre bozucu kullanarak bir yarımküreden striatal dokuyu homojenize edin (25mM Tris tabanı, 1mM EDTA, 1:100 proteaz ve fosfataz inhibitör kokteylleri) 10-12 Hz'de 10 bakliyat için ve 1000xg'de4oC'de 10 dakika santrifüjlü.
    2. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve peleti 150-μl lizis tamponunda yeniden inşa edin. Fraksiyonlar SDS-PAGE ve Western blotting tarafından biyokimyasal analiz için kullanılır.
      Not: Sulu çözeltilerdeki dengesizlik nedeniyle hazırlık aşamasında 1 saat içinde proteaz ve fosfataz inhibitörü içeren tampon kullanın.
  2. Nörokimya süreci
    1. HPLC için -80°C'de depolanan her numuneden diğer yarımküreden parçalanmış striatum kullan. Striatal dokuları buz üzerindeki mikrofuge tüplerinde çözün, 500-μl 0.3N perklorik asit (PCA) ekleyin ve sonicator kullanarak homojenize edin.
      Not: 100 ml 0,3N PCA yapmak için 90 ml ddH2O ölçün, 100 ml'lik dereceli bir silindire ekleyin, 2,58 ml%70 PCA ekleyin ve 100 ml işaretine getirin. Bu numune tamponu 4°C'de bir aya kadar saklanabilir.
    2. Sonicate striatal doku 500-μl buz-soğuk 0.3N PCA, 10-12 Hz'de 10 darbe için ve buz üzerine yerleştirin. Homojenliği sağlamak için, sonicate örnekleri 10 saniye boyunca ikinci kez, daha sonra 16.100xg'de 4oC'de 12 dakika santrifüj.
    3. Hemen 1,5 ml mikrosantrifüj tüplere süpernatantı depolayın ve -80 ° C'de saklayın. Pelet fraksiyonunu kaputta havayla kurulayın.
    4. Elektrokimyasal algılama ile HPLC tarafından dopamin ve metabolitleri, 3,4-dihidroksifeniletik asit (DOPAC) ve homovanillik asit (HVA) ölçümü için kullanılana kadar süpernatantı -80 °C'de saklayın.
    5. Kurutulur, pelet fraksiyonunu 0,5N NaOH (500 μL) olarak yeniden oluşturan ve kısaca sonicate. Lowry yöntemini kullanarak toplam proteinin belirlenmesi için kullanılana kadar yeniden inşa edilmiş pelet fraksiyonunu 4 °C'de saklayın.
  3. İmmünohistokinoloji süreci
    1. Dereceli sakkaroz çözeltilerinde %4 formaldehit sulu çözelti ve kriyoprotekte bir gecede daldırma-düzeltme orta ve arka beyin blokları (fosfat tamponlu salinde %10 (0,01 M PBS; 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl ve ddH2O, pH 7.4) 24 saat boyunca, daha sonra doku batana kadar PBS'de% 30) 4 °C'de. Fazla sakkaroz çözeltisini çıkarmak için kriyoproteks blokları kısaca lekelendirin, kuru buzda dondurun ve kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.
    2. Kriyostatta orta ve arka beyin içeren beyin bloklarının mikrotom kesiti.
      1. Dokuları -80°C'den çıkarın, kriyostatta 1 saat boyunca -16°C'de dengeyi sağla ve doku gömme ortamına monte edin.
      2. Koronal bölümleri 40-μm kalınlığında kriyoprotektör çözeltiye (%30 sakkarozlu 0,01M PBS, %30 etilen glikol, pH 7,4) -16°C'de toplayın. Dokuyu 240 um aralıklarla 6 1,5 ml mikrosantrifüj tüpüne seri olarak toplayın ve -20 °C'de saklayın.

6. İmmünblotting

  1. BCA tahlili ile striatal süpernatant fraksiyonunda (Bölüm 5.1'de açıklandığı gibi hazırlanmış) protein konsantrasyonunu belirleyin.
  2. 20 μl hacimde teslim edilen kuyu başına 10 μg verim elde etmek için her numune için gereken seyreltmeyi hesaplayın.
  3. 1X Laemmli tampon çözeltisinde 10 μg protein elde etmek için süpernatant proteini 4X Laemmli tampon ve homojenizasyon tamponu ile seyreltin. Örnek hesaplama:
    1. Gerekli protein ve hacmin nihai konsantrasyonunun belirlenmesi. Bu durumda, 20 μl'de (0,5 mg / ml) 10 μg gereklidir.
    2. Gerekli protein çözeltisinin son hacmini belirleyin. Yükleme için 20 μl gerekli olmasına rağmen, ekstra hacim (30 μl) hazırlanmalıdır.
    3. Son hacim ve konsantrasyon bilindiğinden ve protein süpernatant fraksiyonunun konsantrasyonu bilindiğinden (BCA tahlili ile belirlenir), denklemi kullanarak gerekli protein süpernatantının hacmini hesaplayın:
      Vsupernatant = (Vfinali x Cfinali)/C süpernatant
      Böylece, 1,5 mg/ml'lik bir süpernatant protein konsantrasyonu için,
      Vsüpernatant = (30 μl x 0,5 mg/ml)/1,5 mg/ml
      Vsüpernatant = 10 μl
    4. 30 μl hacimde (30 μl / 4 = 7,5 μl) 1 kat konsantrasyon sağlamak için gereken 4X Laemmli tampon miktarını hesaplayın. Not: 4X Laemmli tampon, numune hazırlamada 1 kat mukavemete seyreltilmelidir.
    5. Hacmi 30 μl'ye getirmek için gereken homojenizasyon tampon miktarını hesaplayın (ve istenen 0,5 mg / ml nihai protein konsantrasyonunu elde edin):
    6. Vorteks yaparak numune hazırlayın, ardından 10 μl protein süpernatantını 12,5 μl homojenizasyon tamponuna pipetleme. 30-μl numune çalışma çözeltisi ve 0,5 mg/ml konsantrasyon için 7,5 μl 4X Laemmli tampon ekleyin.
  4. Açıklanan prosedürü, girdabı kullanarak tüm örnekleri hazırlayın ve 5 dakika kaynatın.
    Not: Kaynama sırasında basınç nedeniyle sızıntıyı ve açılmayı önlemek için vidalı mikrosantrifüj tüpleri kullanın.
  5. 5 dakika sonra, hemen buza yerleştirin. Jel kuyusu başına 20 μl numune çalışma çözeltisi yükleyin (10 μg protein). Protein örneklerini %12 Tris glisinin jelinde SDS-PAGE ile ayırın.
    1. Moleküler ağırlıkların teyidi için önceden boyanmış bir protein merdiveni kullanın. Çalışan tampon 25 mM Tris tabanlı, 192 mM glisine, %0,1 SDS ve ddH2O, pH 8,3'tür.
    2. Proteinleri elektroforez ile ayırın: proteinleri çözmek için kuyuları temizlemek için 80 V'ta (10 dk) ve 125 V'ta (yaklaşık 1 saat; protein merdiveni tamamen ayrılana kadar) çalıştırın.
  6. Tris-glisin transfer tamponunda (25 mM Tris, 192 mM glisin, %0,04 SDS, %20 metanol ve ddH 2 O, pH 8,3) 4°C'de 40 V için bir gecede 0,2 μm nitroselüloz membran kullanarak proteinden nitroselüloz transferini gerçekleştirin.
  7. Nitroselüloz lekelerini 1x Tris salin (TS; 25mM Tris, 0.9% NaCl in ddH2O, pH 7.4) ile 10 dakika boyunca PONCEAU S'deki RT. lncubate'de 5 dakika yıkayın, ardından eşdeğer protein yüklemesinin kaba bir doğrulamasını sağlamak için ddH2O'da durulayın. Not defteri kaydını korumak ve PBS kullanarak kimliksiz yapmak için görüntüyü tarayın.
    Not: Alternatif olarak, HCl (%0,2) içeren Milli-Q veya ddH2O'da lekeleri yıkayın yaklaşık 5 dakika boyunca. Kayıt taraması yapın. Ponceau S lekesini sonraki kuluçka adımıyla membrandan çıkarın (yani engelleme tamponu içine yerleştirin).
  8. RT'de 1 saat boyunca TS'de% 5 yağsız süt tozunda lekeleri engelleyin ve tavşan anti-tirozin hidroksilaz (1:1000),anti-β-aktisin (1:200); %5 süt-TS'de anti-GFAP (1:1000).
  9. TS'de 3 x 5 dk, TS'de %0,05 Ara-20 ve 1 x 5 dakika TS ile yıkayın, ardından RT'de 2 saat boyunca birincil türlerle eşleşen HRP konjuge ikincil antikorda (%5 süt içeren TS'de 1:5000) kuluçkaya yatırın.
  10. Eşit hacimlerde luminol ve peroksit çözeltileri kullanarak kemimuminesan substrat hazırlayın ve 1-3 dakika uygulayın. Karanlık bir odada, filme maruz kalmak ve filme maruz kalmak için plastik bir kılıf içine leke yerleştirin; film daha sonra otomatik bir işlemci kullanılarak geliştirilmiştir.
  11. 30 dakika boyunca 37 °C'de ticari olarak mevcut sıyırma tamponu ile lekeleri soyun, %0,05 Ara-20 ile TS'de 3x 10 dk ve TS'de 1x 10 dk yıkayın ve ardından yükleme kontrolü veya diğer ilgi proteinleri için yenidenprobe edin.
  12. Optik yoğunluk ölçümleri için Sinyalleri Image J yazılımı ile ölçün ve dahili yükleme kontrol β–actin normalleştirin.

7. Nörokimya

  1. Analiz için doku yukarıda Açıklandığı gibi Bölüm 5.2'de hazırlanmıştır. Mobil faz tarifi için lütfen Tablo 1'e bakın.
    Not: Tüm reaktifler %99,0 saf ve HPLC dereceli ≥ olmalıdır. Temiz, özel cam eşyalar ve karıştırma çubukları ile tampon bütünlüğünü sağlayın. Mobil faz tamponu hazırlık aşamasından sonraki yedi gün içinde kullanılmalıdır.
    1. Dihidrojen fosfat ve sitrik asidi tartın, 1 L ddH 2 O ekleyin ve2-Ldereceli bir silindirde karıştırın. Çözeltiyi 0,22-μm GSTF membrandan filtreleyin.
      Not: Bu, fosfat ve sitrik asitteki kirleticilerin ekstraksiyonunu en üst düzeye çıkarır ve bu da arka plan akımlarını en aza indirmeye yardımcı olur.
    2. OSA'yı ve ardından asetonitril ve EDTA çözümünü ekleyin. pH'ı fosforik asitle 3,0'a ayarlamadan önce yaklaşık 1900 ml'ye HPLC sınıfı ddH2O ekleyin.
    3. 2-Lişaretine HPLC sınıfı ddH 2 O ekleyin ve ardından 2-L şişeye dökün. Özel bir karıştırma çubuğu ekleyin ve mobil fazı vakum altında 10 dakika > karıştırarak gazdan arındırın.
  2. Dopamin için standartları, standart eğriler için DOPAC ve HVA'yı hazırlayın. Standartların stok çözeltileri 0.3 N PCA'da 1 mg/ml'de hazırlanır.
    1. 12,4 mg dopamin-HCl tartın ve 1 mg / ml dopamin yapmak için 10,0 ml 0,3 N PCA ekleyin.
    2. 10,0 mg DOPAC tartın ve 1 mg/ml DOPAC yapmak için 10,0 ml 0,3 N PCA ekleyin.
    3. 10.0 mg HVA tartın ve 1 mg / ml HVA yapmak için 10.0 ml 0.3 N PCA ekleyin.
  3. Stok çözümlerinden çalışma standardı çözümler hazırlayın. Konsantrasyon eğrisi oluşturmak için beş noktalı standartlar kullanılır.
    1. Striatal dopamin ölçümü için 12,5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml ve 200 ng/ml standart konsantrasyonları hazırlayın.
    2. Striatal DOPAC için 2,5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml ve 40 ng/ml standart konsantrasyonları hazırlayın.
    3. Striatal HVA için 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml ve 80 ng/ml standart konsantrasyonları hazırlayın.
    4. Beş noktalı standartlar oluşturun: 0,3N PCA kullanarak 1 mg/ml dopamin stok çözeltisini 5 μg/ml'ye seyreltin. 1 mg/ml DOPAC stok çözeltisini 0,3N PCA kullanarak 1 μg/ml'ye seyreltin ve 1 mg/ml HVA stok çözeltisini 0,3N PCA kullanarak 2 μg/ml'ye seyreltin.
    5. 1 ml 5 μg/ml dopamin, 1 ml 1 μg/ml DOPAC ve 1 ml 2 μg/ml HVA'yı 25 ml hacimsel bir şişeye aktarın ve hacmi 0,3 N PCA ile 25 ml işaretine getirin.
      Not: Hacimsel şişedeki karışık standartlar beş noktalı standartların en yüksek konsantrasyonuna sahip: 200 ng/ml dopamin, 40 ng/ml DOPAC ve 80 ng/ml HVA.
    6. Karışık standartların 1 ml'lik kısmını temiz 1,5 ml mikrosantrifüj tüplere aktarın. Sonraki dört nokta standartlarını oluşturmak için dört kez 1:1 seri seyreltme gerçekleştirin.
      1. Örneğin, karışık standartların 250 μl'sine, orijinal konsantrasyonların% 50'sinde karışık standartlar üretmek için 250 μl numune tamponu ve girdabı iyice ekleyin; istenen seyreltmeler elde edilene kadar işlemi tekrarlayın.
  4. HPLC sistemini hazırlayın (pompa, otomatik örnekleyici, ters fazlı kolon (C18, 150×3,2 mm, 3 μm)). HPLC sistemindeki önceki tüm çözeltileri ve sıkışmış hava kabarcıklarını taze mobil fazla değiştirmek için pompayı taze mobil fazla temizle. Otomatik örnekleyiciyi 4°C'ye soğutun. Sütunu 35°C'ye ısıtın, bu da toplam basıncı azaltır.
    1. Elektrokimyasal dedektörün birinci ve ikinci elektrotları için gerilimi sırasıyla -150 mV ve 220 mV olarak ayarlayın. Mobil faz 0,2 ml/dk akış hızındayken sistemi en az 2 saat ve ideal bir gecede dengeler.
      Not: Denge sırasında hücreler açık olmalı ve taban çizgisi okuması izlenmelidir. Kararlı okuma, sistemin kullanıma hazır olduğunu gösterir. Denge aşamasının iki saati boyunca, mobil fazın devridaim yapmak yerine bir atık konteynerine girmesine izin verin. Bu süreden sonra, mobil faz denge için bir gecede geri dönüştürülebilir.
    2. Denge tamamlandıktan sonra, mobil faz akış hızını 0,6 ml / dk'ya ayarlayın. Beş noktalı standartların her birine 20 μl enjekte edin.
  5. Striatal örnekleri buz üzerinde çözün ve her numunenin 2 x 20 μl'lik kısmını HPLC sistemine enjekte edin. Her striatal numune seti boyunca başlangıçta ve rastgele standartları kullanın.
  6. Standartlar ve numuneler tarafından üretilen dopamin, DOPAC ve HVA tepeleri altındaki alanı analiz etmek için yazılımı kullanın. En yüksekteki alanı karşılık gelen standardı için 5 noktalı eğriyle karşılaştırarak, tutma süresine ve ölçüme göre analizleri tanımlayın.
  7. Bölüm 5.2.3'te açıklandığı gibi pelet fraksiyonunu hazırlayın. Striatal pelet üzerinde bir Lowry protein tahlilini gerçekleştirin. Not: Bu tahlil, striatal örneklerde bulunan protein miktarını mg/ml olarak ölçecektir; bu bilgiler analit ng/mg konsantrasyonu belirlemek için kullanılır.

8. İmmünohistokinoloji

  1. GFAP/TH çift immünofluoresans
    1. Bölümlenmiş orta beyin içeren tüpleri -20°C dondurucudan çıkarın ve RT'ye getirin.
    2. Serbest yüzen immünokimya için polyester örgü tabanlı polistiren kesici uçlara doku bölümleri yerleştirin. PBS'de 3 x 5 dk yıkayın.
    3. Bölümleri her kuyuda 180-μl blok çözeltisi (%5 normal eşek serumu, %1 PVP, %1 BSA ve %0,3 Triton X-100) ile 96 kuyu plakasına aktarın. RT'de 40 dakika kuluçkaya yatır.
      Not: Tüm yıkama ve kuluçka adımları çalkalayıcı üzerinde hafif ajitasyon ile gerçekleştirilir.
    4. Bölümleri birincil antikor çözeltisini içeren kuyulara aktarın (kuyu başına 180 μl). Primer antikor kokteylinde kuluçkaya yaslanın, tavşan anti-GFAP (1:1000) ve koyun anti-TH (1:400) PBS'de% 1 BSA ve% 0.3 TX-100 ile seyreltilir, 4 ° C'de 24 saat boyunca. Birincil türlerden IgG, negatif immünostaining kontrolü görevi görür.
    5. İkincil antikor kokteylinde kuluçkaya yaslanın (PBS'de %0,1 TX-100 ile 1:200 eşek anti-tavşan 568 ve 1:200 FITC eşek anti-koyun). Hazırlık ve kuluçka sırasında çözeltiyi ışıktan korumak için folyo kullanın; RT'de 2 saat kuluçkaya yatır.
      1. Negatif bir kontrol için, IgG'deki bölümleri birincil antikorlar için kullanılan konsantrasyona seyreltilmiş birincil türlerden kuluçkaya yatırın.
      2. RT'de her biri 5 dakika boyunca 2 x PBS ve 1 x TS yıkayın.
    6. İkincil antikor kokteylinde kuluçkaya yaslanın (PBS'de %0,1 TX-100 ile 1:200 eşek anti-tavşan 568 ve 1:200 FITC eşek anti-koyun). Hazırlık ve kuluçka sırasında çözeltiyi ışıktan korumak için folyo kullanın; RT'de 2 saat kuluçkaya yatır.
    7. RT'de her biri 5 dakika boyunca 2 x PBS ve 1 x TS yıkayın.
    8. 4°C'de bir slayt kutusunda saklayarak slaytları ışıktan ve oksidasyondan görüntülemeye kadar koruyun.
    9. Floresan arka plan seviyesini belirlemek için önce negatif kontrolü analiz edin, ardından floresan mikroskopi kullanarak pozitif immünoreaktivite için değerlendirin.
  2. Krom çökeltici Iba1 immünhistokimya
    1. Bölümlenmiş orta beyin içeren tüpleri -20°C dondurucudan çıkarın ve RT'ye getirin.
    2. Serbest yüzen immün entrikalar için doku bölümlerini polistiren kesici uçlara yerleştirin. PBS'de 3 x 5 dk'luk bölümleri yıkayın ve bölümleri epitop alımı için önceden ısıtılmış 10 mM sitrik asit monohidrat, pH 9.0, 80 °C içeren 12 kuyu plakasına yerleştirin.
    3. RT'de 20 dk soğuk plaka.
    4. Bölümleri kuyu başına 180-μl blokaj çözeltisi (%10 normal keçi serumu, PBS'de %1 BSA) içeren 96 kuyu plakasına aktarın ve RT'de 40 dakika kuluçkaya yatır.
    5. Bölümleri 180-μl seyreltilmiş primer antikor içeren kuyulara aktarın (%1 BSA-PBS'de 1:1000). 4°C'de gece boyunca kuluçkaya yaslanın.
    6. Bölümleri eklemelere aktarın. 3 x 5 dk PBS yıkayın ve RT'de 1 saat boyunca biyotinillenmiş ikincil antikor (%1,5 normal serum-PBS'de 1:200) uygulayın.
    7. Kullanmadan önce ABC çözümünü 30 dakika hazırlayın. 3 x 5 dk PBS yıkayın ve RT'de 1 saat boyunca ABC çözümüne aktarın.
    8. DAB çözümünü davlumbazda hazırlayın. PBS'de 2x 5 dakika ve TS'de 1x 5 dakika yıkayın ve DAB'da bölümleri kuluçkaya yatır.
      1. 3-4 dakika geliştirin. Negatif kontrol açık renkli kalmalıdır.
        Not: DAB bilinen bir kanserojen olduğu için bu adımı duman kaputunda gerçekleştirin. Dekontaminasyon için ddH 2 O'da0,2Mpotasyum permanganat çözeltisi, kazara damlama durumunda yakın tutulmalıdır.
    9. Bölümleri kısaca ddH2O'da, ardından TS 3 x 5 dk'da durulayın. Bölümleri artı kaydıraklara monte edin ve duman davlumbazında gece boyunca hava kurutun.
    10. DDH2 O, girdapta eşit hacimde 0,2M potasyum permanganat ile DAB atıklarını dekontamine edin ve uygun şekilde etiketlenmiş DAB atık kutusunda duman davlumbazında saklamadan önce bir gecede duman kaputunda kuluçkaya yatırın.
      Not: Çamaşır suyu çözeltisi DAB'ın mutajenik özelliklerini ortadan kaldırmaz.
      1. Yeniden kullanılacak eşyaları (yani polistiren kesici uçları) arındırın ve deterjanla yıkayın.
    11. Cresyl menekşe (CV) ile hafifçe susuz kalın/tezgahlar. Tüm dehidrasyon/yıkama adımları 3 dakikadır: etanol %70, %95, %100, %95, ddH2O, CV (30 saniye), ddH20 x 2, %95 etanol + buzul asetik asit (%0,1) x 2, %100 etanol ve ksilen.
    12. Distiren-toluen-ksilen montaj ortamında kapaklı ve duman kaputunda kuru.
    13. Pozitif immünoreaktiviteyi hafif bir mikroskopla gözlemleyin. Birincil türlerden IgG, negatif immünostaining kontrolü görevi görür.

9. İstatistikler

  1. Genotip ve toksikan tedavi arasındaki farklılıkları karşılaştırmak için genotip ve iki yönlü ANOVA arasındaki farklılıkları karşılaştırmak için varyans analizi (ANOVA) ile araçlar arasındaki farklılıkları değerlendirin. ANOVA testi ile farklılıklar gözlendiğinde Tukey'in HSD post hoc analizini kullanın(p≤0.05).
    Not: Tekrarlanabilirliği sağlamak için deneyler (n = 6-9 fare/grup ile) en az iki kez gerçekleştirilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu toksin maruziyet paradigması, MPTP ve salin enjekte edilen hayvanlarda önemli ve tespit edilebilir% 20 striatal dopamin tükenmesi üretebilir. Farklı mptp çok az veya çok lezyon verebilir dikkat önemlidir; bu nedenle, daha iyi hassasiyet için, yeni bir nörotoksin çok fazla alındığında transgeniklerde kullanılmadan önce wildtype farelerde bir ön deney önerilir. Hafif-orta dereceli lezyon kullanımı transjenin etkisinin gözlenmesini sağlar; şiddetli bir lezyon, zayıflamak için çok sağlam veya zararlı bir yaralanma ile zararlı bir 'zemin etkisi' üretebilir ve zararlı bir genetik değişikliğin etkisini gölgede bırakabilir. MPTP'nin striatal dopamin üzerindeki etkileri 5-LOX izozim eksikliği olan farelerde önemli ölçüde farklıydı, ancak 12/15-LOX izozim eksikliği olan farelerde farklı değildi (Şekil 1). Ayrıca, bu yöntemlerle, salinle tedavi edilen farelerde 5-LOX eksikliği nedeniyle dopamin seviyelerinde önemli bir fark tespit edebildik (Şekil 1).

TH ve GFAP için immünblotting, sırasıyla, wildtype farelerde striatum düzeyinde hasar ve nöroinflamasyonun onaylanmasına izin verdi, 5-LOX iozim eksikliği striatumunda azalan bir etki (Şekil 3A ve 3B). Lezyon ayrıca substantia nigra(Şekil 2A ve 2B)düzeyinde de ayırt edilebilir. Aynı farelerde, TH pozitif nöronların tükenmesi ve GFAP immünoreaktivitesinin artması çift etiketli immünofluoresan etiketleme kullanılarak gözlemlenebilir (Şekil 2A). Ayrıca, wildtype'ta belirgin bir şekilde yüksek mikroglial aktivasyon(yani Iba1 immünoreaktivitesi), ancak 5-LOX izozim eksikliği değil, fareler MPTP maruziyetini takiben substantia nigrada belirgindir (Şekil 2B). Böylece, MPTP modeli nigral dejenerasyon ve inflamasyona genetik yatkınlığın etkisini değerlendirmek için yararlı bir araç sağlayabilir.

Figure 1
Şekil 1. MPTP mücadelesinden sonra LOX izozim seçici striatal dopamin üzerinde etkiler. (A) Striatal homojenatlar, WT'den HPLC ve salin veya MPTP (n=6-8/grup) verilen 5-LOX-/- çöp eşleri tarafından dopamin (DA) ölçmek için kullanıldı. ⭐, genotip nedeniyle önemli bir etkiye işaret ediyor; s<0.05. *, genotip ve tedavi nedeniyle önemli bir etkiye işaret ediyor; s<0.05. MPTP'nin bu transgenik çizgide striatal DA tükenmesi üretmediğini gösteren 5-LOX-/- farelerde (n.s.) tedaviye bağlı önemli bir fark belirtilmemiştir. (B) WT'de DA ve salin veya MPTP (n=6-9/grup) verilen 12/15-LOX-/- çöp arkadaşlarını ölçmek için striatal homojenatlar kullanıldı. Genotipe bağlı da düzeylerinde anlamlı bir fark gözlenmedi. Her iki genotipte de MPTP tedavisine bağlı anlamlı ve benzer bir azalma kaydedildi. *, s<0.01. Veriler SEM ± ortalama olarak gösterilir.

Figure 2
Şekil 2. MPTP mücadelesinin ardından nigral TH ve astroglia üzerinde 5-LOX izozim etkileri. (A) WT'den nigral beyin bölümlerinde ve salin veya MPTP verilen 5-LOX-/- çöp arkadaşlarında TH (FITC; yeşil) ve GFAP (568; kırmızı) immünoreaktiviteleri için immünoresans lekeleme yapıldı. WT-MPTP grubunda daha az TH pozitif hücre gövdesi (*) ve gelişmiş GFAP immünoreaktivitesi belirgindir. Bar = 25 μm. (B) Mikroglia üzerinde Iba-1 için immünohistokimyasal histoloji DAB (kahverengi kromatjen) kullanılarak tespit edildi; bölümleri Cresyl violet tarafından karşı konuldu. WT ve 5-LOX-/- çöp arkadaşlarından gelen nigral kesitler salin veya MPTP ile tedavi edildi. Ramified hücre gövdeli ve uzun, dallanma süreçlerine sahip mikroglia, salinle tedavi edilen farelerden (ok kafaları) substantia nigra'da gözlenir. Yuvarlak hücre gövdeleri ve kısa, kalınlaşmış süreçlere sahip aktif mikroglia, MPTP ile tedavi edilen farelerden (oklar) substantia nigra'da gözlendi. Çubuk = 10 μm.

Figure 3
Şekil 3. 5-LOX izozim striatal TH ve toksik hakaret sonrasında enflamatuar etkileri. (A) Striatal TH protein düzeyleri, WT'den homojenatın Batı blot analizleri ve salin veya MPTP (n=6-8/grup) verilen 5-LOX-/- çöp arkadaşları ile yarı nicel olarak ölçüldü. Optik yoğunlukla ölçülen immünoreaktivite β-aktoloji olarak normalleştirildi. *, s<0.05. (B) Benzer şekilde, GFAP, WT ve 5-LOX-/- çöp arkadaşlarından striatal homojenatın Batı blot analizleri ile yarı nicel olarak ölçüldü ve salin veya MPTP (n=6-8/grup) ile verildi ve β-aktin olarak normalleştirildi. *, s<0.05. Veriler SEM ± ortalama olarak not edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu gen-çevre etkileşimi çalışmasının tasarımı, nigrostriatal yoldaki 5-LOX izoziminin çift doğası hakkında yeni bilgiler edinmemizi sağladı. 5-LOX izozim ve wildtype çöp arkadaşlarından yoksun transgeniklerde salin veya MPTP tedavisinden sonra striatal monoaminleri ölçmek için HPLC yaparak, eksikliğinin toksik koşullar altında koruyucu göründüğünü not edebildik (Şekil 1), ancak normal koşullarda enzim eksikliği striatal dopamin seviyelerini azaltır ve zararlı olabilir. Böylece, 5-LOX izozim normal koşullarda striatal dopaminerjik tona katkıda bulunduğunu, ancak toksikan sınamasını takiben hasara katkıda bulunabileceğini gösterebiliriz4.

Daha fazla değerlendirmenin LOX izozimlerinin nigrostriatal toksisitedeki rolü hakkında yeni mekanistik içgörüler vermesi gerekirken, Batı blot analizleri (Şekil 3) ve immünohistokimyasal çalışmalar (Şekil 2) nöroinflamatimasyon belirteçlerinin en azından kısmen MPTP'ye maruz kalan 5-LOX izozim eksikliği kohortunda zayıfladığını ortaya koydu. Klasik biyokimyasal ve histolojik teknikler kullanılarak elde edilen bu bulgular, 5-LOX ürünlerinin mikro ve astro-glial aktivasyonun güçlenmesinde kritik bir rolü olduğunu göstermektedir4.

Araştırılan gen-çevre etkileşimine bağlı olarak glial aktivasyona ek olarak patolojik okumalar da analiz edilebilir. PD'de özel olarak önemli olan, substantia nigradaki dopaminerjik nöronların kaybı ve potansiyel olarak patolojik birikim ve α-sinükleinin toplanmasıdır. Bu hat boyunca, α-sinüklein aşırı ifade ile transgenik farelerde toksik maruziyetin etkisi, nigral hücre ölümünün(yani tarafsız stereolojik hücre sayımı kullanılarak) ve çözünmeyen α-sinüklein birikiminin değerlendirilmesi ile izlenmiştir32-35.

Burada açıklanan paradigmada kullanılan MPTP dozu, hem striatum hem de substantia nigrada mütevazı, ancak önemli, striatal yaralanma (Şekil 1) ve glial aktivasyon ile hafif bir lezyon üretir (Şekil 2 ve 3). Tipik olarak, toksik edicinin daha yüksek dozları sağlam nigral dopaminerjik hücre kaybı ve striatal dopamin tükenmesi23,24,32,36-38,39üretmek için kullanılır. MPTP'nin toksisitesinin satıcılar ve çoklar arasında değişebileceğini belirtmek önemlidir; sonuç olarak, istenen lezyonu üretmek için dozların ayarlanması gerekebilir. Ayrıca, dikkate alınması gereken diğer faktörler, çalışmalar için kullanılan hayvanların gerginliği ve cinsiyetidir. Nörotoksine seçici duyarlılık, farelerin farklı arka plan suşlarında gösterilmiştir, en azından kısmen, JNK ve c-Jun36-39dahil olmak üzere dejenerasyona aracılık eden hücre altı yolların aktivasyonundaki farklılıklara bağlı bir fenomendir. MPTP toksisitesinde cinsiyete bağlı farklılıklar dabildirilmiştir 40,41ve her iki cinsiyetin de zayıf üreme çizgileri için kullanıldığı transgenik farelerin kullanıldığı çalışmalarda değişkenliğe katkıda bulunabilir. Böyle bir durumda, cinsiyetle eşleşen wildtype denetimlerinin kullanımıkritiktir 4. Bu tür cinsiyetle ilgili etkiler, WT farelerinde, bir cinsiyetin bir satır için, her iki cinsiyetin de diğeri için kullanıldığı 5 ve 12/15-LOX eksikliği olan farelerin etkisini test eden deneyler arasındaki lezyon farkını hesaba katabilir (Şekil 1). Gen-çevre etkileşim çalışmaları için, olası bir genetik etkiyi maskeleyebileceği için ciddi yaralanma(örneğin striatal dopaminde% 80 azalma>) üreten bir MPTP zorluğu önerilmez.

MPTP maruziyeti nigral hücre ölümüüretirken 3,42, striatal dopamin tükenmesi3, karmaşık I inhibisyonu43-45ve glial aktivasyon46,47 insan PD'sinde bildirilmiştir, farede, stabil parkinsonizm(yani motor açıkları) ve frank α-sinüklein patolojisi(yani Lewy cisimleri ve neurites) üreten yavaş ilerleyen bir dejenerasyon, modelde hastalığın tamamen rekapitülasyon ayırt edici özellikleri oluşmaz. Bununla birlikte, MPTP faresinin PD ile ilgili nörodejenerasyona katkıda bulunan hücre altı yolları anlamada kritik bir rol oynadığını belirtmek önemlidir. Örneğin, maruz kalma paradigmalarındaki varyasyon, farklı toksisite mekanizmalarının aktivasyonunu ortaya çıkarmıştır: düşük doz, subakut maruziyet, sınırlı bir immün yanıtla apoptotik hücre ölümünü48'i teşvik eder49, daha yüksek dozlarda akut tedavi ise belirgin mikroglial aktivasyonüretir 50. Gerçekten de, bu tür faktörler, modeli etkinlik çalışmaları için kullanırken ve mevcut çalışmayla ilgili olarak, potansiyel bir genetik risk faktörünün etkisini düşürmek için göz önünde bulundurulmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Açıklayacak bir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri NIGMS 056062 tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) Sigma-Aldrich M0896 for PD modeling
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) American MasterTech Scientific BUP0157 for immersion fixation
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) Sigma-Aldrich 244252 for HPLC acid extraction
Tris Base Sigma-Aldrich T1503 for tissue homogenization
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E1644 for tissue homogenization
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 for tissue homogenization
Phosphatase inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P5726 for tissue homogenization
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881 for Lowry protein assay
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC)  Sigma-Aldrich S0389 for cryoprotection
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) Sigma-Aldrich P3813 for IHC
BCA Protein Assay Kit Pierce/Thermo 23225 for protein determination
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well Invitrogen/Life Technologies EC60052BOX for SDS-PAGE
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Invitrogen/Life Technologies NP0007 for SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard  Invitrogen/Life Technologies LC5800 protein ladder
Glycine Sigma-Aldrich G7126 for SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) Sigma-Aldrich L3771 for SDS-PAGE
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent  American MasterTech Scientific SPM1057C methanol for transfer
Sodium chloride (NaCl), ACS reagent Sigma-Aldrich S9888 saline and buffers
Nonfat dry milk powder Carnation n/a for immunoblotting
Ponceau S solution in 5% acetic acid  Sigma-Aldrich P7170 for immunoblotting
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal Chemicon/Millipore AB1542 for immunofluorescence 
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal Pel-Freez Biologicals P40101-0 for immunoblotting
Anti-β Actin, rabbit Sigma-Aldrich A2066 for immunoblotting
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal Chemicon/Millipore AB5804 for immunofluorescence
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal Covance Inc. SMI-22R for immunoblotting
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 for immunoblotting
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated  Fisher Scientific 31462 for immunofluorescence
goat anti-sheep, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31480 for immunofluorescence
goat anti-mouse, peroxidase conjugated Pierce/Thermo 31430 for immunofluorescence
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Pierce/Thermo 34078 for immunoblotting
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in  Pierce/Thermo 34089 for immunoblotting
Restore Western Blot Stripping Buffer  Pierce/Thermo 21059 for immunoblotting
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0%  Sigma-Aldrich C1909 for IHC
Normal Donkey Serum Millipore S30-100ML for IHC
Polyvinylpyrrolidone (PVP) Sigma-Aldrich P5288 for IHC
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized Sigma-Aldrich A3294 for IHC
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-01 for IHC
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled  Invitrogen/Life Technologies A10042 for IHC
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC  Jackson ImmunoResearch 713-095-147 for IHC
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1500 for IHC
Normal Goat Serum Millipore S26-100ML for IHC
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG )  Vector Laboratories PK-4001 for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions )
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine Vector Laboratories SK-4100 for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use)
Hydrogen peroxide, 30% Sigma-Aldrich 216763 for quench step in IHC
Rabbit anti-Iba1 Biocare Medicals CP290A for IHC
Cresyl Violet Solution, Regular Strength  FD Neurotechnologies PS102-01 counterstain for Iba1 IHC
95% Ethanol, reagent alcohol Sigma-Aldrich R8382 dehydration for IHC
100% Absolute ethanol Mallinckrodt 7019-10 dehydration for IHC
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283 destaining for IHC
Xylene Sigma-Aldrich 534056 clearing agent for IHC
DPX Mountant Sigma-Aldrich 06522 mounting medium for DAB IHC
O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium  American MasterTech Scientific EMOCTCS embeddium medium for cryostat cutting
Potassium permanganate Sigma-Aldrich 223468 to decontaminate DAB solution
Dopamine hydrochloride Sigma-Aldrich H8502 for HPLC
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) Sigma-Aldrich 850217 for HPLC
Homovanillic acid (HVA) Sigma-Aldrich H1252 for HPLC
Perchloric acid (PCA) - 70% Sigma-Aldrich 244252 for HPLC
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Sigma-Aldrich 71504 for HPLC
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich C1909 for HPLC
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) Sigma-Aldrich O8380 for HPLC
EDTA Sigma-Aldrich E1644 for HPLC
Acetonitrile EMD AX0145-1 for HPLC
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) Millipore for HPLC
0.22 µm GSTF membrane Millipore for filtration
Corning Netwells Sigma-Aldrich CLS3477 polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) MSE MSE.41371.274
Microcentrifuge Eppendorf 5414R
ESA MD-150 reverse-phase column  ESA
HPLC Pump (Ultimate 3000) Dionex ISO-3100BM
HPLC Autosampler (Ultimate 3000) Dionex WPS-3000TSL
Electrochemical detector ESA Coulochem III
Guard Cell ESA 5020
Analytical Cell ESA 5011A
Chromeleon software Dionex
Eclipse E400 Nikon E400 light/fluorescent microscope
Disposable mouse cage Ancare N10HT
Microfilter top Ancare N10MBT
5-LOX- deficient mice The Jackson Laboratory 004155
12/15-LOX-deficient mice The Jackson Laboratory 002778

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
  2. Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment interactions in Parkinson's disease and other forms of parkinsonism. Neurotoxicology. 31, 598-602 (2010).
  3. Heikkila, R. E., Hess, A., Duvoisin, R. C. Dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine in mice. Science. 224, 1451-1453 (1984).
  4. Chou, V. P., Holman, T. R., Manning-Bog, A. B. Differential contribution of lipoxygenase isozymes to nigrostriatal vulnerability. Neuroscience. 228, 73-82 (2013).
  5. Deschamps, J. D., Kenyon, V. A., Holman, T. R. Baicalein is a potent in vitro inhibitor against both reticulocyte 15-human and platelet 12-human lipoxygenases. Bioorg. Med.Chem. 14, 4295-4301 (2006).
  6. Weaver, J. R., et al. Integration of pro-inflammatory cytokines, 12-lipoxygenase and NOX-1 in pancreatic islet beta cell dysfunction. Mol. Cell Endocrinol. 358, 88-95 (2012).
  7. Yigitkanli, K., et al. Inhibition of 12/15-lipoxygenase as therapeutic strategy to treat stroke. Ann. Neurol. 73, 129-135 (2013).
  8. van Leyen, K., et al. Novel lipoxygenase inhibitors as neuroprotective reagents. J Neurosci. Res. 86, 904-909 (2008).
  9. Chu, J., Pratico, D. 5-lipoxygenase as an endogenous modulator of amyloid beta formation in vivo. Ann. Neurol. 69, 34-46 (2011).
  10. Langston, J. W., Ballard, P., Tetrud, J. W., Irwin, I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219, 979-980 (1983).
  11. Bove, J., Perier, C. Neurotoxin-based models of Parkinson's disease. Neuroscience. 211, 51-76 (2012).
  12. Beal, M. F. Neuroprotective effects of creatine. Amino Acids. 40, 1305-1313 (2011).
  13. Jackson-Lewis, V., Blesa, J., Przedborski, S. Animal models of Parkinson's disease. Parkinsonism Relat. Disord. 18, 183-185 (2012).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Wang, H., Shimoji, M., Yu, S. W., Dawson, T. M., Dawson, V. L. Apoptosis inducing factor and PARP-mediated injury in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 991, 132-139 (2003).
  16. Petroske, E., Meredith, G. E., Callen, S., Totterdell, S., Lau, Y. S. Mouse model of Parkinsonism: a comparison between subacute MPTP and chronic MPTP/probenecid treatment. Neuroscience. 106, 589-601 (2001).
  17. Przedborski, S., et al. The parkinsonian toxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP): a technical review of its utility and safety. J. Neurochem. 76, 1265-1274 (2001).
  18. Thomas, B., et al. Mitochondrial permeability transition pore component cyclophilin D distinguishes nigrostriatal dopaminergic death paradigms in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Antioxid. Redox. Signal. 16, 855-868 (2012).
  19. Sonsalla, P. K., Heikkila, R. E. The influence of dose and dosing interval on MPTP-induced dopaminergic neurotoxicity in mice. Eur. J. Pharmacol. 129, 339-345 (1986).
  20. Di Monte, D. A., et al. Relationship among nigrostriatal denervation, parkinsonism, and dyskinesias in the MPTP primate model. Mov. Disord. 15, 459-466 (2000).
  21. Lee, K. W., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 mediates MPTP toxicity and regulates glial activation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat. Protoc. 2, 141-151 (2007).
  23. Bolin, L. M., Strycharska-Orczyk, I., Murray, R., Langston, J. W., Di Monte, D. Increased vulnerability of dopaminergic neurons in MPTP-lesioned interleukin-6 deficient mice. J. Neurochem. 83, 167-175 (2002).
  24. Manning-Bog, A. B., et al. Increased vulnerability of nigrostriatal terminals in DJ-1-deficient mice is mediated by the dopamine transporter. Neurobiol. Dis. 27, 141-150 (2007).
  25. Quik, M., Di Monte, D. A. Nicotine administration reduces striatal MPP+ levels in mice. Brain Res. 917, 219-224 (2001).
  26. Markey, S. P., Johannessen, J. N., Chiueh, C. C., Burns, R. S., Herkenham, M. A. Intraneuronal generation of a pyridinium metabolite may cause drug-induced parkinsonism. Nature. 311, 464-467 (1984).
  27. Heikkila, R. E., Manzino, L., Cabbat, F. S., Duvoisin, R. C. Protection against the dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine by monoamine oxidase inhibitors. Nature. 311, 467-469 (1984).
  28. Crampton, J. M., Runice, C. E., Doyle, T. J., Lau, Y. S., Wilson, J. A. MPTP in mice: treatment, distribution and possible source of contamination. Life Sci. 42, 73-78 (1988).
  29. Yang, S. C., Markey, S. P., Bankiewicz, K. S., London, W. T., Lunn, G. Recommended safe practices for using the neurotoxin MPTP in animal experiments. Lab. Anim. Sci. 38, 563-567 (1988).
  30. Lau, Y. S., Novikova, L., Roels, C. MPTP treatment in mice does not transmit and cause Parkinsonian neurotoxicity in non-treated cagemates through close contact. Neuroscience research. 52, 371-378 (2005).
  31. Satoh, N., et al. Central hypothermic effects of some analogues of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP). Neurosci. Lett. 80, 100-105 (1987).
  32. Fernagut, P. O., et al. Behavioral and histopathological consequences of paraquat intoxication in mice: effects of alpha-synuclein over-expression. Synapse. 61, 991-1001 (2007).
  33. Manning-Bog, A. B., McCormack, A. L., Purisai, M. G., Bolin, L. M., Di Monte, D. A. Alpha-synuclein overexpression protects against paraquat-induced neurodegeneration. J. Neurosci. 23, 3095-3099 (2003).
  34. Richfield, E. K., et al. Behavioral and neurochemical effects of wild-type and mutated human alpha-synuclein in transgenic mice. Exp. Neurol. 175, 35-48 (2002).
  35. Thomas, B., et al. Resistance to MPTP-neurotoxicity in alpha-synuclein knockout mice is complemented by human alpha-synuclein and associated with increased beta-synuclein and Akt activation. PloS one. 6, (2011).
  36. Smeyne, M., Goloubeva, O., Smeyne, R. J. Strain-dependent susceptibility to MPTP and MPP(+)-induced parkinsonism is determined by glia. Glia. 34, 73-80 (2001).
  37. Hamre, K., Tharp, R., Poon, K., Xiong, X., Smeyne, R. J. Differential strain susceptibility following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) administration acts in an autosomal dominant fashion: quantitative analysis in seven strains of Mus musculus. Brain Res. 828, 91-103 (1999).
  38. Sedelis, M., et al. MPTP susceptibility in the mouse: behavioral, neurochemical, and histological analysis of gender and strain differences. Behav. Genet. 30, 171-182 (2000).
  39. Boyd, J. D., et al. Response to 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) differs in mouse strains and reveals a divergence in JNK signaling and COX-2 induction prior to loss of neurons in the substantia nigra pars compacta. Brain Res. 1175, 107-116 (2007).
  40. Ookubo, M., Yokoyama, H., Kato, H., Araki, T. Gender differences on MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) neurotoxicity in C57BL/6 mice. Molecular and cellular endocrinology. 311, 62-68 (2009).
  41. Kenchappa, R. S., Diwakar, L., Annepu, J., Ravindranath, V. Estrogen and neuroprotection: higher constitutive expression of glutaredoxin in female mice offers protection against MPTP-mediated neurodegeneration. FASEB J. 18, 1102-1104 (2004).
  42. Jackson-Lewis, V., Jakowec, M., Burke, R. E., Przedborski, S. Time course and morphology of dopaminergic neuronal death caused by the neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Neurodegeneration. 4, 257-269 (1995).
  43. Mizuno, Y., Sone, N., Saitoh, T. Effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion on activities of the enzymes in the electron transport system in mouse brain. J. Neurochem. 48, 1787-1793 (1987).
  44. Nicklas, W. J., Youngster, S. K., Kindt, M. V., Heikkila, R. E. M. P. T. P. MPP+ and mitochondrial function. Life Sci. 40, 721-729 (1987).
  45. Nicklas, W. J., Vyas, I., Heikkila, R. E. Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine. Life Sci. 36, 2503-2508 (1985).
  46. Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J. Neurosci. 22, 1763-1771 (2002).
  47. Kurkowska-Jastrzebska, I., Wronska, A., Kohutnicka, M., Czlonkowski, A., Czlonkowska, A. The inflammatory reaction following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine intoxication in mouse. Exp. Neurol. 156, 50-61 (1999).
  48. Tatton, N. A., Kish, S. J. In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia nigra compacta of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labelling and acridine orange staining. Neuroscience. 77, 1037-1048 (1997).
  49. Furuya, T., et al. Caspase-11 mediates inflammatory dopaminergic cell death in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease. J Neurosci. 24, 1865-1872 (2004).
  50. Anderson, D. W., Bradbury, K. A., Schneider, J. S. Neuroprotection in Parkinson models varies with toxin administration protocol. Eur. J. Neurosci. 24, 3174-3182 (2006).

Tags

Tıp Sayı 83 MPTP dopamin Iba1 TH GFAP lipoksijenaz transgenik gen-çevre etkileşimleri fare Parkinson hastalığı nörodejenerasyon nöroinflamasyon
Parkinson Hastalığında Maskeyi Düşürme Duyarlılık Mekanizmalarına Gen-Çevre Etkileşim Modelleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R.,… More

Chou, V. P., Ko, N., Holman, T. R., Manning-Boğ, A. B. Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (83), e50960, doi:10.3791/50960 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter