Zellzusammendrücken als Robust, Mikrofluidik Intrazelluläre Delivery Platform

Summary

Schnelle mechanische Verformung von Zellen als vielversprechender, Vektor-freie Methode für intrazellulären Transport von Makromolekülen und Nanomaterialien entstanden. Dieses Protokoll bietet detaillierte Schritte auf, wie das System für eine breite Palette von Anwendungen.

Abstract

Schnelle mechanische Verformung von Zellen als vielversprechender, Vektor-freie Methode für intrazellulären Transport von Makromolekülen und Nanomaterialien entstanden. Diese Technologie hat bei der Bewältigung zuvor anspruchsvolle Anwendungen Potenzial gezeigt, einschließlich der Lieferung in primären Immunzellen, Zell Umprogrammierung, Kohlenstoff-Nanoröhrchen und Quantenpunkt-Lieferung. Dieser vektorfreien mikrofluidischen Plattform stützt sich auf mechanische Zerstörung der Zellmembran zu cytosolische Abgabe des Zielmaterials zu erleichtern. Hier beschreiben wir die detaillierte Verfahren für die Verwendung dieser Mikrofluidvorrichtungen einschließlich Vorrichtungsanordnung, Zellpräparation und den Systembetrieb. Dieser Liefer Ansatz erfordert eine kurze Optimierung von Gerätetyp und Betriebsbedingungen für die zuvor gemeldet Anwendungen. Die Anweisungen gelten verallgemeinerbar zu den meisten Zelltypen und Liefer Materialien wie dieses System nicht spezialisierten Puffer oder chemische Modifikation / Konjugation Schritte erfordern. Diese Arbeiten stellen auchs Empfehlungen, wie die Geräteleistung zu verbessern und störungs schießen mögliche Probleme zu Verstopfung, geringe Liefer Effizienz und die Lebensfähigkeit der Zellen zusammen.

Introduction

Freisetzung von Makromolekülen in die Zelle Zytoplasma ist ein kritischer Schritt in der therapeutischen und Forschungsanwendungen. Nanopartikel-vermittelte Abgabe, zum Beispiel, hat Potenzial in der Gentherapie ^1,2 gezeigt, während Protein-Lieferung ist ein vielversprechendes Mittel beeinflussen die Zellfunktion sowohl in klinischen und Labor ^{3 4} Einstellungen. Andere Materialien, wie zum Beispiel Medikamente aus kleinen Molekülen, Quantenpunkte oder Gold-Nanopartikel, sind von Interesse in Anwendungen von Krebstherapeutika ^5,6 bis ^7,8 intrazelluläre Markierung und ^{Einzelmolekül-Tracking-9.}

Protocol

1. Lagerung

1. Lagern Sie die Behälter, Halter, O-Ringe und mikrofluidischen Systemen in 70% Ethanol. Verwenden Sie einen Behälter (zB Glas oder Becher), die einen Deckel, um Verdunstung und Kontamination durch Staub oder Partikel zu verhindern außen hat. Zeigen die Geräte in einem Behälter (1), Vorratsbehälter und O-Ringe in einem zweiten Behälter (2), in dem dritten Halter (3).

Anmerkung: Die Verwendung von 70% Ethanol für die Lagerung ist, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Wenn die einzigen Komponenten der Lösung sind Ethanol und Wasser (dh keine Denaturierung Agenten), sollten alle System-Komponente....

Results

Fig. 1 enthält eine schematische beschreibende des mikrofluidischen Zufuhrsystem. Figuren 2a-b veranschaulichen typische Ergebnisse der Behandlung von HeLa-Zellen mit unterschiedlichen Geräteausführungen in Gegenwart von fluoreszenz konjugierten 3 ^{kDa-Dextran-20.} Wenn das Verfahren korrekt befolgt, wird die Systemleistung empfindlich auf Gerätetyp und Betriebsgeschwindigkeit. Daher sollte man diese Bedingungen für eine bestimmte Anwendung, bevor zu anspruchsvollen Versuchen z.......

Discussion

Bestimmte Aspekte der beschriebenen experimentellen Verfahren (dh andere als Chip-Design-und Betriebsgeschwindigkeit Faktoren) müssen je nach Zellentyp und Freisetzungsmaterial das System angewendet wird, um optimiert werden. Die Adressen, die folgt einige der häufigsten Faktoren, die bei der Gestaltung Experimente Diskussion.

Um die Liefersignal für fluoreszenzmarkierten Verbindungen zu verbessern, muss man zu den Quellen der Hintergrundfluoreszenz zu adressieren. Oberflächenbindun.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gerätehalterung & Kunststoff-Reservoir	SQZ Biotechnologies	Holder
LSRFortessa Analyzer	Becton Dickinson	N/A	Durchflusszytometrie-Gerät, das am Koch-Institut verwendet wird Core Facilities
Mikrofluidisches Gerät	SQZ Biotechnologies	Cell Squeeze
O-Ringe	McMaster	9452K311
Drucksystem zum Betrieb des Geräts	SQZ Biotechnologies	Drucksystem
Pinzette
Ultraschallbad