Ein Verfahren für die Implantation von Mikrodrähte Organisierte Arrays für Einzel-Einheit Recordings in Awake, Behaving Tiere

Zusammenfassung

Die Implantation organisiert Arrays von Mikrodrähten für den Einsatz in Single-Unit-elektrophysiologischen Ableitungen präsentiert eine Reihe von technischen Herausforderungen. Verfahren zum Durchführen dieses Verfahrens und die notwendige Ausrüstung beschrieben. Auch ist der wirtschaftliche Einsatz der organisierten Mikroarrays aus unterschiedlichen neuronalen Teilbereiche mit hoher räumlicher Selektivität aufzeichnen diskutiert.

Zusammenfassung

In vivo elektrophysiologischen Ableitungen im Wach, verhalten Tier bieten eine leistungsfähige Methode für das Verständnis der neuronalen Signal auf Einzelzellebene. Die Technik ermöglicht Experimentatoren zeitlich und regional, um aufgezeichnete Aktionspotentiale mit laufenden Verhalten korrelieren Prüfung spezifischer Feuermuster. Darüber hinaus können Single-Unit-Aufnahmen mit einer Vielzahl von anderen Techniken, um eine umfassende Erläuterung der neuronalen Funktion produzieren kombiniert werden. In diesem Artikel beschreiben wir die Anästhesie und die Vorbereitung für Mikro Implantation. Anschließend aufzuzählen wir die notwendige Ausrüstung und OP-Schritte, um eine Mikroarray in eine Zielstruktur genau einfügen. Schließlich beschreiben wir kurz die verwendet werden, um aus jeder einzelnen Elektrode im Array aufnehmen Ausrüstung. Die beschriebenen festen Mikroarrays für chronische Implantation gut geeignet und ermöglichen eine Längs Aufnahmen von neuronalen Daten in fast allen Verhaltens preparatiauf. Wir diskutieren Tracing Elektrodenbahnen auf Mikropositionen sowie Möglichkeiten, um Mikroimplantation mit immunhistochemischen Techniken, um die anatomischen Besonderheiten der aufgezeichneten Ergebnisse erhöhen kombinieren Triangulierung.

Einleitung

Elektrophysiologische Aufzeichnungen können Wissenschaftler die elektrischen Eigenschaften von biologischen Zellen zu untersuchen. Im zentralen Nervensystem, in dem elektrische Impulse dienen als Signalmechanismus, sind diese Aufnahmen für das Verständnis der neuronalen Funktion ^1-2 besonderer Bedeutung. Während Single-Unit-Aufnahmen verhalten Tiere, ist ein Mikroelektroden, die in das Gehirn eingeführt worden ist in der Lage, Veränderungen in der Erzeugung von Aktionspotentialen eines Neurons im Laufe der Zeit zu erfassen.

Während viele Techniken erlauben es, Hirnaktivität aufzeichnen, ist Single-Unit-Elektrophysiologie eine der genauesten Methoden, indem Beschluss der einzelnen Neurons Ebene. Wenn eine hohe räumliche Spezifität gewünscht wird, kann verwendet werden, um diskrete Mikrodrähte Teilkerne oder Ensembles von Zellen innerhalb des brain3 Ziel. Single-Unit-Aufnahmen profitieren auch von hohen zeitlichen Auflösung, wie Aufnahmen sind präzise im Mikrosekundenbereich. Und in vivo eineWake-Aufnahmen ermöglichen intakt Schaltung Wechselwirkungen mit der natürlichen Milieu der zu-und abführenden Projektionen, systemische chemische und hormonelle Einflüsse und physiologische Parameter. Neuronale Signale werden von sensorischen Input, Motor-Verhalten, kognitive Verarbeitung, Neurochemie / Pharmakologie, oder eine Kombination abgeleitet. Dementsprechend ist die Trennung von sensorischen, motorischen, kognitiven und chemische Einflüsse erfordert durchdachte Experimente mit effektiven Eventualitäten und Steuerungen, die für die Beurteilung der jede der oben genannten Einflüsse lassen kann. Alles in allem Aufnahmen im lebenden Tier ermöglichen Experimentatoren, die Integration von mehreren Quellen von Informationen innerhalb einer funktionierenden Kreislauf zu beobachten und ein umfassenderes Modell der Schaltungsfunktion abzuleiten.

Single-Unit-Aufnahmen auch aus einer Reihe von Nachteilen, von denen jeder Experimentator sollte bewusst sein, zu leiden. In erster Linie können Aufnahmen schwierig durchzuführen sein. Tatsächlich Eigenschaften the heads Verstärker und die implantierten Mikrodrähten, die für die räumliche und zeitliche Spezifität in diesen Aufnahmen zu ermöglichen Aufnahmen macht auch anfällig für den Einfluss von Fremd elektrische Signale (dh elektrisches "Rauschen"). Dementsprechend ist die Fähigkeit, Probleme in einer elektrophysiologischen System beheben erfordert eine gut entwickelte technische Verständnis der elektrophysiologischen Prinzipien und Geräte. Es ist auch wichtig zu beachten, dass unter bestimmten Umständen, erfasst elektrische Signale in der extrazellulären Aufzeichnungen kann die Summierung mehrerer Nervensignale darstellen. Darüber hinaus ist die Verallgemeinerung der Single-Unit-Aktivität Population Aktivität innerhalb einer Zielregion kann oft durch den Grad der zellulären Heterogenität innerhalb der Zielregion begrenzen (siehe aber Cardin ^4). Zum Beispiel könnte Elektroden gegen Aufzeichnung hoher Amplitude Ausgangsneuronen anstelle von anderen Zellen vorgespannt werden. Die Interpretierbarkeit der Single-Unit-Aufnahmen wird erhöhtindem Aufnahmen mit anderen Techniken, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, elektrische (orthodrome oder antidromen), chemische (z. B. iontophoretische oder Designer-Rezeptor) oder optogenetische Stimulation ^4, temporäre neuronalen Inaktivierungen, sensomotorischen Untersuchungen ^5, Trennung Verfahren oder Immunhistochemie ^3.

In der, dass wir die Materialien und die notwendigen Schritte auflisten, um eine organisierte Mikroarrays in der Ratte implantiert werden (obwohl das Protokoll für den Einsatz in anderen Tierarten angepasst werden) folgt Protokoll. Die Vorgehensweise und die Art der festen Arrays in unserem Labor verwendet haben zuverlässig für Längsaufnahmen bewährt und kann Aufnahmen des gleichen Neuron für über einen Monat Zeit ^6-8 aufrecht zu erhalten. Damit ist dieses Verfahren ideal für die Prüfung phasischen Reaktionen auf experimentelle Reize, Kunststoff Änderungen in neuronalen Reaktionen oder Mechanismen von Lernen und Motivation.

Protokoll

Muss mit größter Sorgfalt getroffen werden, um aseptischen Bedingungen zu halten, während der Vorbereitung und der Durchführung der folgenden Verfahren (wie im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren ⁹ beschrieben). Das folgende Protokoll ist in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee, Rutgers University zugelassen. Es wird geschätzt, dass die nachfolgenden Verfahren erfordert 3-6 Stunden in Anspruch.

Implantation des Micro Array:

1. Platz Tieren unter Narkose mit 50 mg / kg Natrium-Pentobarbital (ip) und verwalten 10 mg / kg Atropin Methylnitrat (IP; Glycopyrrolate ersetzt werden) und 0,25 mg Penicillin (300.000 U / ml im), um die Atemfunktion zu erhalten und eine Infektion zu verhindern sind.
   Anmerkung: Bei der 3-6 h Länge dieses Implantationschirurgie wird Natriumpentobarbital verwendet, da es kostengünstig ist und begrenzt die menschliche Exposition gegenAnästhetika (wie es bei längerem Gebrauch von Gas Anästhetika auftreten), während immer noch lang anhaltende Anästhesie. Substitution von anderen Anästhetika ist akzeptabel.
2. Stellen Sie sicher, dass die Betäubung Effekt mit dem Schwanz Prise Test, bevor Sie fortfahren übernommen.
3. Erforderlichenfalls geben abwechselnd Injektionen von Ketamin-Hydrochlorid (60 mg / kg IP) und Natriumpentobarbital (5-10 mg / kg IP) nach Anästhesie während der Operation aufrecht zu erhalten.
4. Rasieren Sie die Kopfhaut mit einem # 22 Skalpellklinge.
5. Desinfizieren Sie die rasierte Kopfhaut mit Povidon-Iod.
6. Geben subkutane Injektionen von Bupivacain (~ 1 mg / kg SC verteilt auf 4 Injektionsstellen), um lokal betäuben die Kopfhaut. Lassen 5-10 min für die örtliche Betäubung wirksam wird.
7. Legen Sie eine Augen Schmiermittel über die Augen, um Feuchtigkeit während der Narkose zu halten.
8. Sichern Sie das Tier in die Ohr-und Nasenklemme Bars eines stereotaktischen Apparat.
9. Verwenden Sie visuelle Landmarken (z. B. einen horizontalen Balken auf der stereotaxic Rahmen) auf den Kopf des Tieres ca. Niveau. Dieser Schritt ist nur etwa in Höhe der Schädel gemeint.
10. Einen Einschnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut unter Verwendung einer # 11 Skalpellklinge auf einer Skalpellträger montiert. Der Schnitt muss direkt hinter den Ohren bis zum hinteren Teil des Nasenbeins zu verlängern.
11. Mit einem Dissektionsspatel, deaktivieren Sie die Schädel aller übrigen Gewebe, bis beide lateralen Schädel Grate und die hintere Schädelkamm erreicht wurden.
12. Ziehen Sie die Haut um den Einschnitt mit einer Reihe von Gefäßklemmen (6x).
13. Reinigen Sie den Schädel von Blut und lassen es trocknen. Wenn der verbleibende Blutung auftritt, beenden Sie den Rest Blutungen mit einem kleinen cauterizing Tool. Sicherzustellen, dass die Schädel sauber und trocken bleibt ermöglicht dem Zahnacryl in nachfolgenden Schritten verwendet werden, um an dem Schädel dauerhaft binden.
14. Filter Bregma und Lambda (Fig. 2D) durch Interpolation der Schnittpunkt der Schädelnähte. Ein Sezieren micROSCOPE ist notwendig, diese Positionen genau zu kennzeichnen.
15. Bringen Sie einen kleinen spitzen Gegenstand (z. B. ein Stift oder Dentalbohrer) zu einem stereotaktischen Arm und senken Sie es, um den dorsalen / ventralen (DV) bestimmen Koordinate des Bregma und Lambda.
16. Passen Sie den Nasenklemme, bis die DV-Koordinaten für Bregma und Lambda sind im Umkreis von 100 um (0,1 mm) voneinander.
17. Einmal eingeebnet, erfassen die anterior / posterior (AP), medial / lateralen (ML) und DV-Koordinaten von Scheitelhöhe zusammen mit der Position des Nasenklemme. Überprüfen Sie die Koordinaten für die Richtigkeit, wie der Rest der Operation hängt von der Genauigkeit dieser Koordinaten.
18. Mit den gemessenen Koordinaten, um den ML und AP-Koordinaten für die vier Ecken des "Toten Fenster" relativ zu Bregma (dh Kraniotomie Abbildung 1) zu berechnen. Der Schädel Fenster ist ein Rechteck genau positioniert, durch die der Mikroarray wird vorübergehen.
19. Mit den berechneten Koordinaten zu markieren dieSchädel Fensterkoordinaten auf den Schädel mit einem spitzen stereotaktischen Befestigung und Füllfederhalter Tinte. Um genau zu Marken zu erhalten, gelten nur eine kleine Menge Tinte auf die Spitze des Markierungswerkzeug mit einem Baumwoll Applikator.
20. Ausbohren des Schädels Fenster durch Entfernen des Knochens in einer Reihe von kleinen Ebenen.
    1. Beginnen Sie mit dem Bohren der markierten Ecken der Fenster, in dem die Marken platziert wurden.
    2. Anschließend verbinden Sie die Ecken, und stellen Sie das Fenster.
    3. Schließlich klar aus dem Bereich innerhalb der Kontur bis zur Tiefe von Dura mater. Das Loch muss breiter (dh abgeschrägten) unter den oberflächlichen Schichten des Schädels, um sicherzustellen, dass das Fenster hält eine angemessene Breite von oben nach unten.
21. Verwenden microforceps sorgfältig entfernen Sie alle verbleibenden Knochenspäne, Schutt, oder Dura mater in den Schädel-Fenster. Dieser Schritt ist sehr wichtig, da diese Bits Material kann die Integrität der Anordnung beim Absenken beeinträchtigen. Einmal gelöscht, muss man th haltene Fenster feucht bakteriostatische Kochsalzlösung für den Rest der Operation.
22. Zeigen Markierungen auf dem Schädel für 5 Schädel Schrauben und ein Massekabel (Abbildung 1). Diese Positionen werden in Abhängigkeit von der gezielten Gehirnregion variieren. Die heads wird sichersten, wenn eine Schraube an jeder der 5 Schädelknochen platziert. Legen Sie beide die Schädelschrauben und Erdungskabel an Orten, die nicht mit dem Mikroarray Platzierung stören.
23. Bohren Sie Löcher für die Schrauben Schädel und sichern Sie die Schrauben fest. Die Schrauben müssen, bis nur noch 3-4 Fäden zeigen (oder, wenn Sie andere als die empfohlenen Schrauben, tief genug, um die Dicke des Schädels, um Stabilität zu fördern Array zu durchqueren, aber nicht zu tief, um Cortex beschädigen) gesenkt werden. Reinigen Sie die Gewinde der Schrauben nach der Platzierung.
24. Bohren Sie ein Loch für die Erdungskabel. Senken Sie den Draht langsam (über 1-2 min) auf die Ziel DV koordinieren und fixieren den Draht mit Zahn Acryl.
25. In Acryl rund um die Themender Schädelschrauben. Vor den Acryl trocknet, entfernen Sie überschüssige Zement, der vom Boden Draht oder Schrauben Schädel fließt. Lassen Sie 15 Minuten für den Zahn Acryl auf / verhärten trocknen.
26. Befestigen Sie das Array an die stereotaktischen Arm. Stufe das Array und richten Sie sie so, dass sie direkt über die Grenzen des Schädels Fenster passieren.
27. Zeigen Kochsalzlösung in den Schädel Fenster, so dass es in Höhe der Schädel ist. Senken Sie das Array, bis es ein Grübchen in der Kochsalzlösung erzeugt. Diese Koordinate wird als Schädel-Ebene für das Array verwendet. Verwenden Sie diesen Wert zu berechnen, der letzte DV-Koordinate des Arrays.
28. Senken Sie die Array langsam, bis es seine endgültige DV koordinieren. Stoppen Sie alle 1mm senken und warten Sie einige Minuten, damit die Gehirngewebe von Dellen zu erholen und um den unteren Teil des Polyethylenglykol (PEG) auf dem Array lösen (PEG wird verwendet, um die Leitungen vorübergehend halten in ihrer Konformation und gleichzeitig die und löst sich langsam in Kochsalzlösung).
29. Wenn das Array 1mmvon dem Ziel entfernt, senken sie langsamer, bis die endgültige Ziel erreicht ist. Absenken auf 0,1-0,2 mm zu einem Zeitpunkt, bevor das Gewebe für eine Dauer von 5 min ruhen soll, um das Gewebe an der Zielstelle als auch proximal synaptischen Verbindungen erhalten. Wenn das Gerät verfügbar ist, können Präzision Senkung des Arrays mit einer motorischen Aufnahme unterstützt.
30. Lösen Sie die verbleibenden PEG und verwenden Zahn Acryl, die Mikrodrähte an Ort und Stelle zu zementieren. In mehreren Schichten von Zement, um sicherzustellen, dass die Leitungen sicher sind und dann lassen 15-20 min, bis der Zement aushärten, bevor Sie fortfahren. Dies stellt sicher, dass die Kabel nicht von ihrer endgültigen Platzierung angerempelt werden.
31. Bauen Sie den Rest des Tieres heads mit Zahn Acryl. Verwenden Sie die Acryl die Schädelschrauben, Erdungskabel und Stecker für die Mikrodrähte umhüllen. Lassen Sie die Acryl-Hut, um ausreichend aushärten, bevor Sie fortfahren.
32. Naht der Kopfhauteinschnitt mit resorbierbaren Fäden und verwalten 2 ml of bakteriostatische Kochsalzlösung (sc) Hydratation von der Operation wieder herzustellen.
33. Nehmen Sie das Tier von den Ohr Bars und platzieren Sie das Motiv in einem sauberen Bereich. Beachten Sie die häufig Tier während der postoperativen Erholung, bis die Thermoregulation und Fortbewegung haben sich erholt. Nach der Erholung von der Narkose, bewegen Sie das Tier in den Single-Gehäuse für den Rest der postoperativen Erholung.
34. Geben Tiere täglich postoperative Überwachung und Betreuung in den Tagen nach dem Eingriff. Wiederherstellung von diesem Verfahren ist optimal, wenn sieben oder mehr Tagen sind erlaubt.
35. Geben Tiere Injektionen von Carprofen (5mg/kg) und Enrofloxacin (5-10 mg / kg) oder deren Äquivalente während der Wiederherstellung dem Zeitplan durch den behandelnden Tierarzt empfohlen.

Ergebnisse

Eine Liste der Geräte von diesem Labor für die Aufzeichnung von elektrophysiologischen Signalen verwendet werden, können in der Tabelle 3 zu finden. Nach der Erholung von der Operation, sind Single-Einheiten, indem Sie ein Unity-Gain-heads in die implantierten Anschluss aufgezeichnet. Diese heads ist über ein Kabel mit einem Kommutator, der durch die Verwendung von elektrischen Schleifringen, geeignet zur freien Rotation ohne Brüche in der elektrophysiologischen Aufzeichnung verbunden. Der Kommutator er...

Diskussion

Extrazelluläre Aufnahmen stellen eine leistungsfähige experimentelle Technik, die in nahezu jedem Versuchsansatz in der Neurowissenschaft integriert werden können. Drähte, die auf organisierten Arrays implantiert wurden, können verfolgt werden, wie ihre Wellen durch das Gehirn und in die Zielregion (5A) übergeben. Wenn ein kleiner, post-experimentellen Läsion an der nicht isolierten Mikrospitze geschaffen, um eine kleine Eisen Kaution aus der Edelstahldraht zu erstellen, kann man genau markieren Sie die...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tabelle 1. Liste der chirurgischen Materialien.
Gauze	Fisher (MooreBrand)	19-898-144
Wattestäbchen	Fisher (Puritaner)	S304659
Nembutal (Pentobarbital)	Sigma Aldrich	P3761
Atropinmethylnitrat	Sigma Aldrich	A0382
Baytril (Enrofloxacin)	Butler Shein ( Bayer)	1040007
Ketaminhydrochlorid	Butler Shein	SKU# 023061
Betadine (Povidon-Jod)	Fisher (Perdue)	19-066452
Stereotax	Kopf	Modell 900
Kauterisationswerkzeug	Stoelting	59017
Präpariermikroskop	Nikon	SMZ445
Dentalbohrer	Buffalo	37800
Bakteriostatischer Kochsalzlösung	Bulter Schein	8973
Schmuckschrauben	Stoelting	51457
Mikrodraht-Array-Mikrosonden		Benutzerdefiniert (flexibel)
Erdungsdraht	Omnetics	Custom Plug
Dental Acryl	Fisher (BAS)	50-854-402
Resorbierbare Nähte	Fisher (Ethicon)	NC0258473
Puralube (Optische Salbe/Gleitmittel)	Fisher (Henry Schein)	008897
Tabelle 2. Liste der chirurgischen Instrumente.
2x Mikrozange	George Tiemann Co.	#160-57	Vielseitig einsetzbar (z.B. Trümmer im Schädelfenster beseitigen)
2x Pinzette	George Tiemann Co.	#160-93	Vielseitig einsetzbar (z.B. zum Binden von Nähten)
6x Hämostaten	George Tiemann Co.	#105-1125	Klemme und offener Schnitt
1x Kleine Schere	George Tiemann Co.	#105-411	Schnittnähte nach dem Binden
1x Gewebezange	George Tiemann Co.	#105-222	Halten von Gewebe beim Nähen
1x Nadelhalter	George Tiemann Co.	#105-1259	Haltenadel 1x
Skalpellhalter (mit #11 Klinge)	George Tiemann Co.	#105-80 (mit #105-71 Klinge)	Schädelschnitt
machen 1x #22 Skalpellklinge	George Tiemann Co.	#160-381	Kopfhaut rasieren
1x Chirurgischer Spatel	George Tiemann Co.	#160-718	Schaben von Schädel, um Gewebe auf Schädel zu reinigen
Maschinen-/Juwelierschrauben	Verschiedenes	N/A	0/80 x 1/8"
Tabelle 3. Liste der Geräte zur Aufzeichnung elektrophysiologischer Signale.
Microwire Array & Steckverbinder	Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD)	N/A (Teile-Nr. basierend auf den Array-Eigenschaften)	Schädelförmig implantiert in der Zielaufzeichnungsregion. Die Arrays werden basierend auf dem gewünschten Drahtabstand, der Länge etc angepasst.
Unity-Gain Harness/Headstage	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Projekt 1200	Erstverstärkung des neuronalen Signals; ermöglicht die Ausbreitung kleiner neuronaler Signale.
Kommutator (und optionaler Fluid-Drehregler)	Plastics One, Inc. (Roanoke, VA)	SL18C	Ermöglicht es Tieren, sich frei zu drehen, während das elektrische Signal an den Vorverstärker weitergegeben
wird. Vorverstärker	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1198	Verstärkt neuronale Signale differenziell gegen eine Referenzelektrode.
Filter und Verstärker	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1199	filtert und verstärkt das differenziell verstärkte Signal weiter.
Acquisition Computer	EnGen (Phoenix, AZ)	N/A (Custom Build)	Führt Software und Hardware für die verhaltensbezogene und neuronale Datenerfassung aus.
A/D-Karte	Data Translation (Marlboro, MA)	DT-3010	Digitalisiert neuronale Signale für die Computerprobenahme.
Digital I/O Card	Measurement Computing (Norton, MA)	PCI CTR-05	Erfasst verhaltensbasierte Ein- und Ausgänge

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