Ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Typ I-Kollagen aus der Haut

Zusammenfassung

Traditionelle Verfahren zur Isolierung von löslichen Typ-1-Kollagen (COL1) benötigen etwa 10 Tage von Anfang an wegen der langwierigen und mühsamen Puffer Inkubationen Resuspensionen von Fibrillen zu beenden. Hier beschreiben wir ein Mittel, um COL1 von kleinen Hautbiopsien in weniger als 3 Stunden zu reinigen.

Zusammenfassung

Lösliche Typ-1-Kollagen (COL1) wird weitgehend als Klebstoff Substrat für Zellkulturen sowie als Zellgerüst für regenerative Anwendungen verwendet. Klinisch wird dieses Protein häufig für kosmetische Chirurgie, Hautinjektionen, Knochentransplantation, und rekonstruktive Chirurgie. Die Quellen der COL1 für diese Verfahren sind allgemein nicht-menschlichen, welche das Potential für eine Entzündung und Ablehnung sowie xenobiotischen Krankheitsübertragung erhöht. Im Hinblick darauf wäre ein Verfahren, um schnell und effizient zu reinigen COL1 von begrenzten Mengen von autolog abgeleiteten Gewebe umgehen viele dieser Probleme, jedoch sind Standardisolierungsprotokolle langwierig und erfordern große Mengen an kollagenem Gewebe oft. Hier zeigen wir ein effizientes COL1 Extraktionsmethode, die die benötigte Zeit, um von ungefähr 10 Tage zu isolieren und zu reinigen, dieses Protein auf weniger als 3 h reduziert. Wir wählten die Dermis als unsere Gewebequelle wegen seiner Verfügbarkeit in vielen chirurgischen Verfahren. Tseine Methode verwendet traditionelle Extraktionspuffer kombiniert mit kraftvollen Bewegung und Zentrifugalfiltration zu hochreinem, lösliche COL1 von kleinen Mengen von Lederhaut erhalten. Kurz gesagt, Hautbiopsien werden gründlich in eiskaltem dH ₂ O nach Entfernen von Fett, Bindegewebe und Haare gewaschen. Die Hautproben werden von nicht-kollagenen Proteinen und Polysacchariden unter Verwendung von 0,5 M Natriumacetat und eine Hochgeschwindigkeitslabortisch-Homogenisators abgestreift. Kollagen von restlichen Feststoffen wird anschließend mit einer 0,075 M Natriumcitrat-Puffer unter Verwendung eines Homogenisators extrahiert. Diese Extrakte werden mit 100.000 MW Cut-off-Filter, die Kreisel COL1 Zubereitungen der vergleichbare oder überlegene Qualität, kommerzielle Produkte oder solche mit herkömmlichen Verfahren gereinigt, erhalten. Wir erwarten, dieses Verfahren die Verwendung von autologen abgeleiteten COL1 für eine Vielzahl von Forschungs-und klinischen Anwendungen zu erleichtern.

Einleitung

Seit Jahrzehnten haben Wissenschaftler und kommerzielle Anbieter solubilisierten COL1 aus einem Sortiment von Gewebequellen, einschließlich Haut und Sehnen mit irgendeiner Variation eines einfachen Säure-Extraktionsprotokolls, gefolgt von Neutralisation, die in einer Resuspendierung aus einer Matrix organisiert COL1 Fibrillen führt, die verwendet werden können, isoliert für eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen ^1-4. Zwar gibt es viele Beispiele für klinische Anwendungen für COL1, einige von diesen beschäftigen autolog stamm COL1 weil Herstellung dieses Proteins erfordert langwierige Extraktionen unter Tage oder Wochen auf ^5-7 durchzuführen. Als Ergebnis der Forschung Forscher und Ärzte verwenden in der Regel teuer, Handelspräparate, die unter Verwendung von COL1 nicht-menschlichen Geweben wie Ratten, Rinder-, Schweine-oder Lederhaut oder über die Haut von Leichen entfernt oder nach der Beschneidung von Männern zubereitet werden. Für regenerative Anwendungen sind viele dieser Produkte zeigen Variabilität in Bezug auf ihre Fähigkeit, feste bildenMatrices oder Gewebe-Konstrukte in der Lage ist die Zellhaftung und Wachstum. Folglich gibt es einen deutlichen Bedarf für eine neue standardisierte Methode entwickelt, um schnell zu extrahieren COL1 aus zugänglich und reichlich autologen Gewebequellen.

Ein derartiges Verfahren würde Zeit und Geld in die Forschung, in dem COL1 konnte aus dem Tiermodell von Interesse extrahiert und für die präklinische Prüfung von technischen Geweben auf Kollagenbasis Gerüste montiert werden zu speichern. Gleichzeitig würde mit der Möglichkeit, eine schnell isoliert, autolog stamm COL1 in der Klinik die allgemeine Sicherheit für die Patienten, die sonst erhalten würde allogenen oder xenogenen Vorbereitungen zu erhöhen. Bei Patienten, die eine autogenen Vorbereitung, würde dies die vereinfachte Verfahren stark das Intervall zwischen Biopsie-Sammlung und Kollagen-Anwendung zu reduzieren. Aus diesen Gründen haben wir versucht, auf eine lange etablierte COL1 Isolierung und Reinigung Verfahren unter Verwendung von High-Speed-ag verbessernitation und Größenausschluss-Zentrifugation. Dieses Verfahren ist einfach durchzuführen unter Verwendung von Standardpuffern und in vielen Labors gefunden. Durch den Einsatz von High-Speed-Agitation, reduziert unsere Protokoll die notwendige Zeit, um lösliche, Haut COL1 von etwa 10 Tagen auf weniger als 3 Stunden ⁸ zu isolieren. Wichtig ist, dass diese Methode kann leicht in der Klinik, um autolog stamm COL1 zur Anwendung bei Patienten während einer einzigen Reihe von Verfahren durchgeführt werden, vorzubereiten.

Protokoll

Hier werden wir die Isolierung von COL1 aus Lammfell zu demonstrieren. Wie geschrieben, kann dieses Protokoll auch verwendet, um erfolgreich von Kaninchen und die menschliche Haut zu isolieren COL1 werden.

1. Bereiten Dermal Beispiel

1. Ins Gleichgewicht alle Reagenzien auf 4 ° C vor der Verwendung.
2. Spülen Hautprobe (25-50 g) in eiskaltem dH ₂ O und entfernen Sie alle Wolle, Fell oder Haare mit Enthaarungscreme.
3. Verwenden Sie einen einzelnen Rasierklinge, um die Probe frei von Bindegewebe und Fett zu kratzen.
4. Die Probe in eiskaltem dH ₂ O spülen
5. Schneiden Sie die Hautprobe in 1 cm x 1 cm große Stücke mit einer einzigen Rasierklinge.

2. Entfernen kollagenen Solubilized Werkstoff

1. Wiegen Sie 5 g der Probe pro 50 ml konischen Röhrchen und 30 ml eiskaltem 0,5 M Natriumacetat.
2. Mix Röhrchen für 1 min bei 6 m / sec Einstellung mit einem 50-ml-Tube-Adapter in der Tisch-Homogenisator.
3. Entsorgen supernatant und wiederholen Sie für insgesamt 7 Natriumacetat Waschzyklen.
4. Spülen Sie die Probe in eiskaltem dH ₂ O und mischen Sie einmal, um Rest Natriumacetat zu entfernen.
5. Verwenden Sie einen Spachtel, um die Probe gegen die Seite des Rohres zu komprimieren, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und dann übertragen auf ein frisches 50 ml konischen Röhrchen.

3. Typ-I-Kollagen-Extraktion

1. Die Probe zweimal Waschen in 2 ml / g 0,075 M Natriumcitrat-Puffer für 1 min bei 6 m / sec in der Tisch-Homogenisator Komprimieren der Probe und Verwerfen des Überstandes nach jeder Wäsche.
2. Hinzufügen eines neues 2 ml / g Aliquot von 0,075 M Natriumcitrat-Puffer zu der Probe.
3. Führen sequentielle 6 1 min, 6 m / sec Tisch Homogenisator Mix Zyklen der Agitation, ohne den Puffer zwischen jedem Zyklus.
4. Übertragen Sie die dicke, klare Überstand in ein Sammelrohr.
5. Fügen Sie eine weitere 1 ml / g 0,075 M Natriumcitrat-Puffer auf die Probe und führen einen letzten Tisch-Homogenisator agitation Zyklus.
6. In diese letzte Überstand in ein Sammelrohr.
7. Das Sammelröhrchen zentrifugiert bei 3200 g für 10 min bei 4 ° C.
8. Den Überstand in der oberen Kammer eines Molekulargewicht von 100.000 abgeschnitten Kreiselfiltereinrichtung.
9. Zentrifugieren bei 3200 × g für 30 min bei 4 ° C
10. Übertragen Sie die gereinigten COL1 aus dem oberen Fach zu einer sauberen konischen Rohr und bei 4 ° C

Ergebnisse

Diese COL1 Isolation Protokoll benötigt etwa 2 Stunden und 15 Minuten in Anspruch. Fig. 1 zeigt ein schematisches Diagramm, das die Hauptschritte in diesem Verfahren. Herstellung der Probe und Durchführen der 7 Zyklen von Hochgeschwindigkeits-Agitation und spült mit Natriumacetat dauert etwa 35 min (Fig. 1A-C). Durchführen einer Agitation und spülen Zyklus mit dH ₂ O dauert ca. 5 min (1D und 1E). Hinzufügen von Natriumcitrat und Unterwerfen der Probe einem Rü...

Diskussion

Ein wesentlicher Bestandteil dieses Verfahrens ist die wiederholte effiziente Kompression der Hautprobe, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Es ist wichtig, so viel wie möglich Natriumacetat in Schritt 2.5 durch Komprimieren der Probe zu entfernen. Wir verwenden einen Spatel, um die Haut gegen die Seite der Röhre zu verdichten, jedoch könnte Gaze verwendet werden, obwohl dies die Entfernung der Probe aus dem Rohr erforderlich und erhöht die erforderliche Zeit, um diese Schritte durchzuführen. Ebenso ist es wichti...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
FastPrep-24 System	MP Biomedicals	116004500
Zentrifuge	Beckman	J6-MI	Ausschwingrotor zur Aufnahme von 50 ml konischen Röhrchen mit 3.200 x g.