Isolation und Charakterisierung von chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Monica M. Burdick; Nathan M. Reynolds; Eric W. Martin; Jacquelyn V. Hawes; Grady E. Carlson; Chaz M. Cuckler; Michael C. Bates; Steven R. Barthel; Charles J. Dimitroff

doi:10.3791/51023

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Methodenartikel

Isolation und Charakterisierung von chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

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DOI:

10.3791/51023

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8. Januar 2014

Monica M. Burdick¹^,² , Nathan M. Reynolds¹^,² , Eric W. Martin² , Jacquelyn V. Hawes¹ , Grady E. Carlson¹ , Chaz M. Cuckler¹ , Michael C. Bates¹ , Steven R. Barthel³ , Charles J. Dimitroff³

¹Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University, ²Biomedical Engineering Program, Russ College of Engineering and Technology, Ohio University, ³Department of Dermatology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Im Vergleich zur traditionellen Affinitätschromatographie mit Protein A Agarose Perlen-verpackten Säulen können Protein-A-Membranadsorber die Isolation von Antikörpern und anderen Fc-Fragment-exemittierenden Proteinen im Labormaßstab erheblich beschleunigen. Geeignete Analyse- und Quantifizierungsmethoden können die Proteinverarbeitung weiter beschleunigen, so dass die Isolierung/Charakterisierung an einem Werktag statt an mehr als 20 Arbeitsstunden abgeschlossen werden kann.

Zusammenfassung

Laborwaage numerativ zur industriellen Reinigung von Biomolekülen aus Zellkulturüberstand und Lysed-Zell-Lösungen kann mit Affinitätschromatographie durchgeführt werden. Während die Affinitätschromatographie mit porösem Protein A AgarosePerlen, die in Säulen verpackt sind, wohl die häufigste Methode zur Isolierung von Antikörpern und rekombinanten Proteinen im Labor maßstabsgetreu ist, die Fc-Fragmente von IgG exdrücken, kann es ein zeitaufwändiger und teurer Prozess sein. Zeit- und Finanzzwänge sind besonders beängstigend in kleinen wissenschaftlichen Grundlagenlabors, die Hunderte von Mikrogramm bis Milligramm Proteinmengen aus verdünnten Lösungen zurückgewinnen müssen, aber keinen Zugang zu Hochdruck-Flüssigkeitsabgabesystemen und/oder Personal mit Expertise in Bioseparationen haben. Darüber hinaus kann die Produktquantifizierung und -charakterisierung auch die Bearbeitungszeit über mehrere Arbeitstage hinaus übermäßig verlängern und die Ausgaben (Verbrauchsmaterialien, Löhne usw.)aufblähen. Daher ist ein schnelles, kostengünstiges und dennoch effektives Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von Antikörpern und anderen Proteinen, die ein Fc-Fragment besitzen, erforderlich. Zu diesem Zweck haben wir ein Protokoll entwickelt, das von technischem Personal mit begrenzter Erfahrung in weniger als 9 Stunden (ungefähr einen Arbeitstag) und bis zu 4 Stunden abgeschlossen werden kann, im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, die mehr als 20 Arbeitsstunden erfordern. Die meisten benötigten Geräte sind in standardbiomedizinischen, biochemischen und (bio-)chemischen Engineering-Labors leicht verfügbar, und alle Reagenzien sind im Handel erhältlich. Um dieses Protokoll zu demonstrieren, werden repräsentative Ergebnisse präsentiert, in denen chimäres murinisches Galant-1 mit dem menschlichen Fc (Gal-1hFc) aus Zellkulturüberstand verschmolzen wurde, mit einem Protein-A-Membranadsorber isoliert wurde. Gereinigte Gal-1hFc wurde mit einem beschleunigten Western Blotting-Analyseverfahren quantifiziert und mit Durchflusszytometrie charakterisiert. Der optimierte Workflow kann für andere Fc-exzessiven Proteine, wie Antikörper, geändert und/oder geändert werden, um alternative Quantifizierungs- und Charakterisierungsmethoden zu integrieren.

Einleitung

Die Isolierung von Antikörpern und rekombinanten Proteinen, die Immunglobulin G (IgG) fc-Fragmente aus Zellkulturüberstand und verdünnten lysierten Zelllösungen exemitzenen, kann mit Hilfe der Protein-A-Affinitätschromatographie erreicht werden. In wissenschaftlichen und technischen Grundlagenlaboren und der Industrie werden Säulen, die mit porösem Protein A-beschichteter Agarose, Glas oder Polymerperlen verpackt sind, am häufigsten für die Affinitätschromatographie verwendet, trotz hoher finanzieller Kosten und langer Verarbeitungszeiten^1-3. Es ist sehr zu schätzen, dass die Affinitätschromatographie den größten Aufwands- und Verarbeitungsengpass sowohl im....