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Isolation und Charakterisierung von chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

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DOI:

10.3791/51023

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8. Januar 2014

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1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University, 2Biomedical Engineering Program, Russ College of Engineering and Technology, Ohio University, 3Department of Dermatology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Im Vergleich zur traditionellen Affinitätschromatographie mit Protein A Agarose Perlen-verpackten Säulen können Protein-A-Membranadsorber die Isolation von Antikörpern und anderen Fc-Fragment-exemittierenden Proteinen im Labormaßstab erheblich beschleunigen. Geeignete Analyse- und Quantifizierungsmethoden können die Proteinverarbeitung weiter beschleunigen, so dass die Isolierung/Charakterisierung an einem Werktag statt an mehr als 20 Arbeitsstunden abgeschlossen werden kann.

Zusammenfassung

Laborwaage numerativ zur industriellen Reinigung von Biomolekülen aus Zellkulturüberstand und Lysed-Zell-Lösungen kann mit Affinitätschromatographie durchgeführt werden. Während die Affinitätschromatographie mit porösem Protein A AgarosePerlen, die in Säulen verpackt sind, wohl die häufigste Methode zur Isolierung von Antikörpern und rekombinanten Proteinen im Labor maßstabsgetreu ist, die Fc-Fragmente von IgG exdrücken, kann es ein zeitaufwändiger und teurer Prozess sein. Zeit- und Finanzzwänge sind besonders beängstigend in kleinen wissenschaftlichen Grundlagenlabors, die Hunderte von Mikrogramm bis Milligramm Proteinmengen aus verdünnten Lösungen zurückgewinnen müssen, aber keinen Zugang zu Hochdruck-Flüssigkeitsabgabesystemen und/oder Personal mit Expertise in Bioseparationen haben. Darüber hinaus kann die Produktquantifizierung und -charakterisierung auch die Bearbeitungszeit über mehrere Arbeitstage hinaus übermäßig verlängern und die Ausgaben (Verbrauchsmaterialien, Löhne usw.)aufblähen. Daher ist ein schnelles, kostengünstiges und dennoch effektives Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von Antikörpern und anderen Proteinen, die ein Fc-Fragment besitzen, erforderlich. Zu diesem Zweck haben wir ein Protokoll entwickelt, das von technischem Personal mit begrenzter Erfahrung in weniger als 9 Stunden (ungefähr einen Arbeitstag) und bis zu 4 Stunden abgeschlossen werden kann, im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, die mehr als 20 Arbeitsstunden erfordern. Die meisten benötigten Geräte sind in standardbiomedizinischen, biochemischen und (bio-)chemischen Engineering-Labors leicht verfügbar, und alle Reagenzien sind im Handel erhältlich. Um dieses Protokoll zu demonstrieren, werden repräsentative Ergebnisse präsentiert, in denen chimäres murinisches Galant-1 mit dem menschlichen Fc (Gal-1hFc) aus Zellkulturüberstand verschmolzen wurde, mit einem Protein-A-Membranadsorber isoliert wurde. Gereinigte Gal-1hFc wurde mit einem beschleunigten Western Blotting-Analyseverfahren quantifiziert und mit Durchflusszytometrie charakterisiert. Der optimierte Workflow kann für andere Fc-exzessiven Proteine, wie Antikörper, geändert und/oder geändert werden, um alternative Quantifizierungs- und Charakterisierungsmethoden zu integrieren.

Einleitung

Die Isolierung von Antikörpern und rekombinanten Proteinen, die Immunglobulin G (IgG) fc-Fragmente aus Zellkulturüberstand und verdünnten lysierten Zelllösungen exemitzenen, kann mit Hilfe der Protein-A-Affinitätschromatographie erreicht werden. In wissenschaftlichen und technischen Grundlagenlaboren und der Industrie werden Säulen, die mit porösem Protein A-beschichteter Agarose, Glas oder Polymerperlen verpackt sind, am häufigsten für die Affinitätschromatographie verwendet, trotz hoher finanzieller Kosten und langer Verarbeitungszeiten1-3. Es ist sehr zu schätzen, dass die Affinitätschromatographie den größten Aufwands- und Verarbeitungsengpass sowohl im Labor als auch in der Industrie darstellt2,4. Als Ergebnis wurden zahlreiche Verbesserungen entwickelt, um Kosten und Verarbeitungszeit zu senken, ohne die gesamte Produktrückgewinnung aus dem Prozesszug1,2,5-7zu opfern. Besonders vielversprechend für die Isolierung von Antikörpern und anderen Fc-exemittierenden Proteinen ist die Affinitätschromatographie mit einem Protein A Membranadsorber2,5,7-10. Während die Fc-Capture in der Säulenchromatographie diffusionsbegrenzt ist(d.h. das Fc-extierende Protein muss in und durch die inneren Poren diffundieren, um den Großteil des Proteins A zu erreichen) mit hohem Druckabfall über die Säule, wird der Massentransport in Membranadsorbern durch Massenkonvektion angetrieben, was zur Vermeidung von Diffusionsbeschränkungen8,9,11,12führt. Darüber hinaus ist der Druckabfall über den Membranadsorber gering, was eine schnellere Durchblutung im Vergleich zu perlenverpackten Säulen8,9,11,12ermöglicht. Daher wird für die Isolierung von Laborskalen prognostiziert, dass die Membranchromatographie die Isolationszeit um mehrere Stunden reduziert und die Produkterfassung im Vergleich zur Säulenchromatographie erhöht. Darüber hinaus wurden mathematische Modelle für die IgG-Adsorption in Membranadsorbern8,9,11,12vorgeschlagen, so dass Endbenutzer die Leistung im Labor vorhersagen können.

Ein weiterer Engpass in wissenschaftlichen und technischen Grundlagenlaboren ist die Charakterisierung des Fc-exemittigen Proteins. Die Auswahl geeigneter Methoden zum Abschließen von Charakterisierungstests, wie westlichen Flecken, kann jedoch den Zeitaufwand für Produkttests erheblich reduzieren. Zum Beispiel kann die semitrockene Übertragung in einem diskontinuierlichen Puffersystem den elektrophoretischen Transfer von Proteinen von einem SDS-PAGE-Gel auf eine Polyvinyldifluoridin -Membran (PVDF) in wenigen Minuten erreichen, im Gegensatz zu 1-2 Stunden im Tank (Nasstransfer) in einem kontinuierlichen Puffersystem13.

Ein schnelles, kostengünstiges und effektives Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung eines chimerischen Fusionsproteins, das ein Fc-Fragment menschlichen IgG ausdrückt, wird hierin beschrieben. Die meisten Geräte sind in grundlegenden biomedizinischen Grundlagen, Biologie, Chemie und (Bio-)Chemie-Engineering-Labors leicht verfügbar, und alle Reagenzien sind im Handel erhältlich. Obwohl repräsentative Ergebnisse aus der Isolierung und Charakterisierung eines murinen Galectin-1/menschlichen Fc chimeric Fusion Protein (Gal-1hFc) generiert wurden, kann das gestraffte Protokoll auf die Isolierung anderer Moleküle angewendet werden, die ein Fc-Fragment besitzen, wie Antikörper, Fc-Fragmente selbst oder andere Fc-Fusionsproteine. Unsere Verbesserungen verringerten die Verarbeitungszeit drastisch (nur 4 Stunden, aber in der Regel 9 Stunden, im Vergleich zu 20+ Arbeitsstunden) und erreichten gleichzeitig eine ähnliche oder verbesserte Produktwiederherstellung im Vergleich zu Standardmethoden.

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Protokoll

1. Überprüfen Sie die Affinität für Protein A

  1. Stellen Sie sicher, dass das Fc-exporierende Protein (rekombinantes Fusionsprotein oder IgG-Antikörper, bisher als "Protein" bezeichnet) eine akzeptable Affinität zu Protein A14-17 vor der Verwendung des Proteins A Membranadsorber hat, und testen Sie das Vorhandensein des Proteins in der Stammlösung(z. B. Zellkulturüberstand, der durch Zentrifugation bei 1.000 x g für 5 min zu einem). Verwenden Sie Durchflusszytometrie, Western Blotting, ELISA usw. Proteinfunktion und/oder Vorhandensein von Fc auf der Grundlage von Laborpräferenzen zu erkennen. Im Idealfall quantifizieren Sie das Protein in der Zellkultur Überstand (Schritt 6), um eine Überschreitung der Protein-A-Membranadsorberkapazität zu vermeiden. Fahren Sie fort, wenn Protein nachgewiesen wird.

2. Bereiten Protein A Membran Adsorber und Zellkultur Supernatant

  1. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zur Herstellung des Membranadsorbers. Lassen Sie niemals Luft in den Membranadsorber eindringen. Alle Lösungen, die durch den Membranadsorber durchsetzt werden, sollten bei Raumtemperatur sein und mit einem 0,22 m-Filter vorgefiltert werden. Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit 0,22 m-gefilterter Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS) oder Puffer nach Wahl und entleeren Luftblasen. Durchdringen Sie DPBS, um die Speicherlösung zu entfernen und den Membranadsorber unmittelbar vor der Anwendung auszudemt.
  2. Filtern Sie den Zellkulturüberstand unmittelbar vor der Perfusion durch den Membranadsorber, indem Sie eine vakuumgesteuerte sterile Filtrationseinheit mit 0,22 m verwenden.

3. Laden Sie das Protein A Membrane Adsorber

  1. Aspirieren Zellkultur Überstand in eine Luer Lock Spritze (30 ml oder größer), und entladen Alle Luftblasen.
  2. Montieren Sie Materialien und Ausrüstungen, wie in Abbildung 1dargestellt. Schließen Sie die Spritze an den Einlass des Membranadsorbers an. Befestigen Sie flexible Schläuche am Membranadsorberauslass. Legen Sie auf Wunsch einen Spritzenfilter von 0,22 m zwischen die Spritze und den Membranadsorber. Verwenden Sie einen Kolben oder eine Flasche, um den Durchfluss (auch als Filtrat bezeichnet) vom Adsorber zu fangen.
  3. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf den gewünschten Volumendurchfluss ein, überschreiten Sie jedoch nicht den vom Hersteller empfohlenen Durchfluss(z. B. 10 ml/min). Durchdringen Sie die Zellkultur, die durch den Membranadsorber durchläuft, und sammeln Sie den Durchfluss in einem Becher oder einem anderen Behälter. Laden Sie die Spritze mit den erforderlichen Überstanden nach.
  4. Auf Wunsch testen Sie den Durchfluss auf das Vorhandensein von Protein entoverwendend, indem Sie Diedurchflusszytometrie, Western Blotting, ELISA usw.verwenden. basierend auf labor-Präferenz. Es ist in der Regel nicht erforderlich, den Durchfluss durchzuspielen.

4. Elute Protein aus dem Membranadsorber

  1. Waschen Sie den Membranadsorber mit 10 ml DPBS, um alle nicht gebundenen Proteine zu entfernen.
  2. Elute-Protein aus dem Membranadsorber bei der gewünschten Durchflussrate(z.B. 1 ml/min) mit 10-15 ml Elutionspuffer(z.B. Amin-basierter Elutionspuffer (pH 2,8)). Fangen Sie eluat in einem Rohr mit Neutralisationspuffer(z. B. 1 M Tris (pH 9.4)) bei 10% des Elutionsvolumens (1,0-1,5 ml).
  3. Alternativ wird elute Protein in einem ml in Tuben mit einem Neutralisationspuffer von 100 l mit einem Gesamtvolumen von 10-15 ml Elutionspuffer erhöht. Verwenden Sie die bevorzugte Charakterisierungsmethode, um jede Fraktion auf das Vorhandensein von Protein zu testen.
  4. Regenerieren Sie den Membranadsorber gemäß den Anweisungen des Herstellers. Durchdringen Sie 10 ml 0,22 m-gefilterte DPBS oder Puffer nach Wahl, dann 10 ml 0,22 m-gefilterte 50 mM NaOH in 1 N NaCl und schließlich 10 ml 0,22 m-gefiltertes DPBS. Füllen Sie den Membranadsorber mit 20% Ethanol in DPBS für die Langzeitlagerung bei 4 oC.

5. Konzentrieren und Dialyse das Protein

  1. Legen Sie alle Eluate (oder Elutionsfraktionen, die Protein enthalten, wie in Schritt 4.3 bestimmt) in einer 10 kDa Molekulargewichts-Trennzentrifugalfiltereinheit abzulegen. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Zentrifugation.
  2. Dialysieren Sie das Retentat in einer dialysatenkleinen Dialyseeinheit (10 kDa Molekulargewichtsabschaltung) nach den Anweisungen des Herstellers gegen den Puffer der Wahl. Wenn die Proteinfällung anlasse, muss dem Dialysematerial ein Puffer hinzugefügt werden. Auf Wunsch kann das Dialysematerial bis Schritt 6 gekühlt werden, eine Langzeitlagerung ohne Konservierungsstoffe wird jedoch nicht empfohlen.

6. Quantifizieren und Charakterisieren von gereinigtem Produkt in einem beschleunigten Western Blotting-Verfahren

  1. Lösen Sie gereinigte Protein- und Fc-Standards auf dem Gel der Wahl von SDS-PAGE, unter reduzierenden oder nicht reduzierenden Bedingungen wie gewünscht18-20. Verwenden Sie ein Mini-Gel anstelle von Midi-Gel, um die Laufzeit zu minimieren.
    1. Wenn nicht bereits bekannt, bestimmen Sie den Fc-Normbereich, über den das Bandsignal in Bezug auf die Menge der geladenen(z. B. 0,1-1 mg) linear variiert. Verwenden Sie das gleiche Gel, Laufbedingungen, Transferbedingungen und Reagenzien, die verwendet werden, um gereinigtes Protein zu quantifizieren und zu charakterisieren.
    2. Laden Sie mehrere Probenmengen an gereinigtem Protein, einschließlich probenverdünnt mit DPBS, um sicherzustellen, dass die gereinigten Proteinbandsignale innerhalb des linearen Signalbereichs der Fc-Standards in der Bildanalyse liegen.
  2. Übertragen Sie Proteine aus dem Gel auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran (PVDF) in einem diskontinuierlichen Puffersystem mit einem semidry blotter13, entsprechend den Anweisungen des Blotterherstellers. Die Transferzeit beträgt in der Regel 5-10 min. Wenn gewünscht, Coomassie Färben sie das Gel nach der Übertragung, um Transfer-Effizienz zu überprüfen21.
  3. Durchführung von Immunoblotting mit Anti-Fc oder Anti-IgG konjugiert zu alkalischer Phosphatase (AP) oder Pferderettichperoxidase (HRP), basierend auf Laborpräferenz, mit einem vakuumunterstützten Proteinnachweissystem. Immunoblotting Zeit ist in der Regel weniger als 1 Stunde.
  4. Entwickeln Sie Immunoblot mit dem Substrat und der Methode ihrer Wahl(z. B. AP-Substrat und verbesserte Chemilumineszenz).
  5. Quantifizieren Sie gereinigtes Protein durch Bildanalyse. Führen Sie eine lineare Regression der Bandsignale von Fc-Standards durch. WennR2>0,90, verwenden Sie die Gleichung für die Linie, um die Proteinmenge aus ihren Bandsignalen zu berechnen. Ggf. Berücksichtigung der Probenverdünnung. Da die Quantifizierung des Proteins auf Basis von Fc erfolgt, passen Sie den Wert für molekulare Gewichtsunterschiede zwischen dem Protein und Fc an. WennR2<0,90, wiederholen Sie Schritt 6 in seiner Gesamtheit.
  6. Validieren Sie Protein emittiert mit funktionellen Assays oder Methoden, um Fc über Durchflusszytometrie, Western Blotting, ELISA usw.zu erkennen. basierend auf labor-Präferenz.
  7. Protein auf die gewünschte Konzentration verdünnen und/oder gewünschte Konservierungsstoffe oder Stabilisatoren in die gereinigte Proteinlösung geben, bevor es für eine langfristige Lagerung, gefroren oder auf andere Weise aliquotiert wird.

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Ergebnisse

Das gestraffte Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Fc-exezierenden Proteinen wird routinemäßig verwendet, um charisch-murines Galectin-1 mit dem menschlichen Fc (Gal-1hFc) aus verdünnten Zellkultur-Übertreibmitteln zu verarbeiten. Das Flussdiagramm in Abbildung 2 veranschaulicht den Workflow und die Zeit für jeden Schritt im Protokoll. Bei einer typischen Charge von 300 ml Überstand beträgt die Gesamtverarbeitungszeit ca. 9 Stunden, wenn die optionale Durchflusszytometrieprüfung von Elutio...

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Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um ein chimäres Fusionsprotein, das den menschlichen Fc (Gal-1hFc) exzeichnet, schnell zu isolieren und zu charakterisieren, ohne die Produktrückgewinnung oder die Aufblähungskosten erheblich zu beeinträchtigen. Die wichtigsten Komponenten des optimierten Workflows sind ein Protein-A-Membranadsorber für die Isolierung sowie semidry transfer und vakuumunterstütztes Immunoblotting zur Charakterisierung durch Western Blotting.

Die dramatische Verk...

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Offenlegungen

Es gibt nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren danken Herrn Luis F. Delgadillo (Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University), Herrn Matthew H. Williams (Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University) und Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women es Hospital und Harvard Medical School) für die technische Unterstützung von Experten. Die Autoren danken auch den Studenten des Winter 2011 CHE 404/BME 504 und des Herbst 2012 CHE 4830/BME 5830 (Department of Chemical and Biomolecular Engineering and Biomedical Engineering Program, Ohio University) für technische Beratung und Diskussion. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Major Research Instrumentation Grant CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), National Institutes of Health (NIH) NCI Grant 1R15CA1 61830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Postdoktorandenstipendium F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) und NIH NCCAM-Stipendium R01AT004628 (CJD).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Protein A Membranadsorber (Sartobind Protein A 2 ml) Sartorius-Stedim93PRAP06HB-12--A
Amicon Ultra Zentrifugalfilter, 10 kDa, 4 mlMilliporeUFC801008Bei Bedarf 15 ml Volumen verwenden
Sterile Vakuumfiltereinheit, 0,22 & Mikro; m, 500 mlMilliporeSCGPU05RE
10 ml Spritzen mit Luer-Lock-SpitzenBD301604
30 ml Spritzen mit Luer-Lock-SpitzenBD309650
Tygon Laborschlauch (1/16 Zoll x 1/8 Zoll x 50 ft)Cole ParmerWU-95903-16
Slide-A-Lyzer MINI Dialysegeräte (10K MWCO)Thermo Scientific69576
Snap i.d. Antikörper-SammelschaleEMD MilliporeWBAVDABTR
Snap i.d. Single Well Blot-HalterEMD MilliporeWBAVDBH01
ElutionspufferThermo Scientific21004
Tris, ultrareinesFisher Scientific819623
NatriumchloridFisher Scientific7647-14-5
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
DPBSThermo ScientificSH30028.02
DPBS mit Ca2+/Mg2+Life Technologies14080-055
BSASigmaA9647
Human FcBethyl Research LaboratoriesP80-104
Anti-Human Fc-APCJackson Immunforschung109136170
Anti-human Fc-APBio-Rad170-5018
Alkalisches Phosphatase-SubstratPromegaS3841
Durchflusszytometrie-Röhrchen (5 ml Polystyrol oder Polypropylen)BD352054
SpritzenpumpeHarvard Apparatus55-2226Eine Schlauchpumpe ist ebenfalls akzeptabel
Proteingel ElektrophoresesystemBio-Rad Laboratories552BR094876Jedes Gelelektrophoresesystem ist akzeptabel, aber Mini-Gel-Systeme laufen am schnellsten
Semidry BlotterBio-Rad Laboratories690BR006163Jedes Transfersystem ist akzeptabel, aber diskontinuierliche Transfersysteme führen den elektrophoretischen Transfer am schnellsten durch
SNAP i.d. vakuumunterstütztes ProteinnachweissystemEMD MilliporeWBAVDBASEDieses spezielle Instrument wurde durch ein verbessertes Modell ersetzt, aber beide sollten genauso gut funktionieren

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Schlagwörter

ZellkultursupernatantDurchflusszytometrieWestern BlottingUltrafiltrationDialyseProteinquantifizierungProteincharakterisierung

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