Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

Zusammenfassung

Um hochorganisierte Strukturen aus komplexem Gewebe zu erzeugen, muss man mehrere Materialien und Zelltypen zu einem integrierten Komposit zusammenfügen. Dieses kombinatorische Design umfasst organspezifische geschichtete Zellblätter mit zwei unterschiedlichen biologisch abgeleiteten Materialien, die eine starke fibröse Matrixbasis enthalten, und Endothelzellen zur Verbesserung der Bildung neuer Gefäße.

Zusammenfassung

Vielen Geweben, wie die erwachsenen menschlichen Herzen, sind nicht in der Lage nach der Beschädigung ausreichend zu regenerieren. ^2,3 Strategies in Tissue Engineering vorschlagen Innovationen, um den Körper bei der Wiederherstellung und Reparatur zu unterstützen. Zum Beispiel kann TE Ansätze in der Lage, Herz Remodeling nach Myokardinfarkt (MI) zu dämpfen und möglicherweise erhöhen insgesamt die Herzfunktion zu einer fast normalen Pre-MI Ebene. ⁴ Wie bei jedem Funktionsgewebe, eine erfolgreiche Regeneration von Herzgewebe umfasst die ordnungsgemäße Lieferung von mehrere Zelltypen mit Umweltreize Begünstigung Integration und das Überleben der implantierten Zellen / Gewebetransplantat. Löslichen Signale Zell-Zell-Wechselwirkungen und Matrixmaterialien als Lieferfahrzeuge, deren Auswirkungen auf das Überleben der Zelle, der Materialfestigkeit, und Erleichterung der Zell-Gewebeorganisation ausgewertet: mehrere Parameter einschließlich sollte konstruiert Gewebe richten. Studien mit direkten Einspritzen von Transplantat-Zellen nur diese wesentlichen Elemente ignorieren. ^2,5,6Eine Gewebe Design kombiniert diese Zutaten noch entwickelt werden. Hier präsentieren wir ein Beispiel von integrierten Designs mit Schichtung von gemusterten Zellschichten mit zwei verschiedenen Arten von biologischen Materialien, die abgeleitete das Zielorgan Zelltyp und Endothelzellen für die Verbesserung neuer Schiffe Bildung in der "Gewebe". Obwohl diese Studien konzentrieren sich auf die Erzeugung von Herz-ähnliches Gewebe, kann dieses Gewebe Design zu vielen anderen als Herz mit minimalen Design-und Materialwechsel Organe angelegt werden und soll ein Off-the-shelf-Produkt für regenerative Therapien sein. Das Protokoll enthält fünf detaillierte Schritte. Ein temperaturempfindlichen Poly (N -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) wird zur Beschichtung Gewebekulturschalen verwendet. Dann werden gewebespezifische Zellen auf der Oberfläche der beschichteten Platten / Mikroflächen kultiviert, um die Zellplatten mit starken seitlichen Adhäsionen bilden. Drittens wird eine Basismatrix für das Gewebe durch Kombination von porösen Matrix mit neovaskulärer Permissi geschaffenve Hydrogele und Endothelzellen. Schließlich werden die Zellschichten von den PNIPAAm beschichteten Schalen angehoben und übertragen zu dem Basiselement, so dass die gesamte Konstruktion.

Einleitung

Die Injektion von Zellen und/oder einzelnen Materialien allein hat in anderen Organsystemen einen unterschiedlichen Erfolg gezeigt und einen begrenzten Erfolg bei der kardiologischen Regeneration. ^5,7-12 Derzeit werden aus Stammzellen gewonnene Zellen mit einer Vielzahl von Verabreichungsmethoden an geschädigtes Gewebe abgegeben, darunter: direkte Zellinjektion in das Gewebe und Perfusion in die Blutversorgung. ^13-17 Andere haben Zellen allein, allein mit Material und/oder in Kombination mit Materialträgern implantiert, um die Regeneration geschädigter Organe zu unterstützen. ^18-21 Dieses Design kombiniert mehrere Strategien, die Materialfestigkeit, Strukturierung in mehreren Materialien und mehreren Zelltypen bieten.

Insbesondere verleiht die basisbasierte azellularisierte fibröse Matrix dem Konstrukt die grundlegende physikalische Festigkeit, wodurch es bei Bedarf zum Einnähen in den Patienten geeignet ist. Die Hohlräume in der Basismatrix sind mit Endothelzellen in einem neovaskulären permissiven Hydrogel²² gefüllt, um eine rasche Vaskularisierung des implantierten Konstrukts zu etablieren. Dieses Komposit wird dann mit vorstrukturierten Zellblättern integriert, die eine verbesserte Zell-zu-Zell-Kommunikation ermöglichen und das native Gewebe besser nachahmen. ^1,23-25 Der gesamte Produktionsprozess für das geschichtete zelluläre Pflaster ist durch das Flussdiagramm in Abbildung 1 dargestellt.

Protokoll

1. Schaffung PNIPAAm-beschichteten Platten

1. Man löst 2,6 g PNIPAAm in 2 ml einer 60% Toluol / Hexan-Lösung 40%.
2. Das Gemisch wird auf 60 ° C für 10 min gerührt, bis die PNIPAAm gelöst.
3. Cut Filterpapier in ein 60 mm Durchmesser-Kreis und Ort Papier in der Büchner-Trichter.
4. Die Lösung wird über Büchner-Trichter in die vorgewogen Becherglas (keine Kunststoffe, wie Hexan wird Kunststoffschmelze).
5. Das Becherglas und den Inhalt in eine Vakuumglocke (24 psi) O / N (16 h). Hinweis: Bis der Rückstand mit Isopropyl reagierte sie oxidieren, so stellen Sie sicher, dass es nicht in Kontakt mit Sauerstoff kommen.
6. Wiegen Sie das Becherglas, das Gewicht des PNIPAAm herzustellen.
7. Fügen Sie Isopropylalkohol auf die PNIPAAm, die Schaffung eines 50:50 w / w Lösung.
8. Je 2 ml der Lösung auf die Oberfläche der Gewebekulturplatte und Mantel für 5 Minuten unter UV-Licht.
9. Zweimal waschen Sie die Platte mit 2 ml warmem PBSvor der Verwendung für die Zellkultur.

2. Schaffung von Zellschichten

Hinweis: Zellschichten von Primärzellen für das Zielorgan unter Verwendung einer Anzahl von verschiedenen Verfahren erzeugt werden, oder durch Beschichten Gewebekulturflächen mit thermo-reaktive Polymer, wie hier beschrieben. Vorbeschichtete thermosensitiven Platten werden auch von einer Reihe von Herstellern angeboten.

Hinweis: Dieses Protokoll ist für die Kultur mit Hilfe eines 35-mm-Schale. Kurz gesagt, Zellen werden zuerst bei 37 ° C für mindestens 24 Stunden bei Konfluenz inkubiert, um Querverbindungen zwischen benachbarten Zellen zu schaffen. Um Zellschichten zu lösen, werden die Platten auf Temperaturen unterhalb 32 ° C unterzogen. Die Zellschicht wird dann auf die starke Base, die eine Fasermatrix neovaskulären permissive Hydrogel mit vaskulären Endothelzellen übertragen.

1. Isolieren Sie die Zellpopulation. Hinweis: Dieses Verfahren ist abhängig von den einzelnen Ableitungsverfahren und der Art der Zellen. Rattenaorta glatt muSCLE Zellen (RASMC) werden in diesem Beispiel verwendet. Dies sind primäre glatte Muskelzellen aus der Aorta einer Ratte isoliert.
2. Mit 2 ml warmem PBS waschen der Zellen.
3. 3 ml Trypsin (oder anderen Abspaltungs / distanziert Lösung) auf die Zellen für 5 min.
4. Hemmung der Trypsin durch Zugabe von 3 ml des Kulturmediums oder der Phosphatpufferlösung (PBS), enthaltend 10% fötales Rinderserum (FBS).
5. Sammeln Sie die Zellen in einem konischen Rohr und zählen einen aliquoten.
6. Dreh die Zellen bei 1000 Upm (228 × g) für 5 min.
7. Aspiration des Überstands und Resuspendieren der Zellen in der Wachstumsmedien (SmGM2 und Kugel Kit Kulturmedium für RASMC verwendet).
8. Legen Sie die Medien mit den Zellen auf einer 35 mm wärmeempfindliche Platte - PNIPAAm beschichtete Platte in einer Konzentration, die 100% zu erreichen, wird Zusammenfluss. Hinweis: Für RASMCs dass Zahl bestimmt zu 100.000 Zellen / cm ² betragen. Jedoch durch den Verlust von Zellen bei der Weitergabe, 120% des VA lue verwendet.
9. Platzieren in einen Inkubator bei 37 ° CO / N. Hinweis: Es ist wichtig, die Zellen bei 37 ° C zu halten, um die Zellhaftung an der Platte zu halten.

3. Vorbereitung der Grundlagen Matrix

Hinweis: Verschiedene 3D-Faser Matrizen können verwendet werden, um starke Fasermatrix zwischen den zarten Zellschichten Schicht sein. Einige Beispiele: Gelschaum, Bioglas, natürliche Materialien azellularisierten ²⁶ oder nanospun Materialien ^27,28 Schweine Harnblase Matrix (UBM) in diesen Studien verwendet wurde großzügig von unserem Mitarbeiter, Dr. Badylak ²⁹ versehen.

1. Vor der Verwendung bestimmen Matrixeigenschaften, einschließlich des Fehlens von Zellinhalts wenn dezellularisierte Matrix verwendet, ^27,28 zellspezifischen Lebensfähigkeit und Hohlraum. ²²
2. Schneiden die vorsterilisiert Matrix in eine gewünschte Größe und Form. Hinweis: Hier wird eine Loch verwendet, um eine 4 mm Durchmesser-Kreis geschnitten.

ve_title "> 4. Seeding Endothelzellen in einen Neovaskuläre Tolerant Hydrogel

Anmerkung: Die Endothelzellen können aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich Differenzierung von Stammzellen oder Vorläuferzellen erhalten werden. Hier HUVECs verwendet.

1. Verwenden Sie eine permissive Hydrogel (Fibrin, Kollagen Gele), solange die Vernetzungszeit ist kurz genug, um die Zellen lebensfähig zu bleiben. Anmerkung: Hier wird ein Hyaluronsäure (HA), bezogen Gel mit einer Disulfid-Brücke verwendet wird vernetzt.
2. Vorbereiten des HA-Hydrogel gemäß der Firma Protokoll.
3. Sammeln Sie die Endothelzellen und verteilen in eine einzelne Zelle Lösung mit 1x Trypsin. Hinweis: Accutase oder Zelldissoziationspuffer könnte auch als Einzelzelldispersion verwendet werden.
4. Deaktivieren des Enzyms Trypsin durch Verwendung einer gleichen Menge des Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (wenn es wichtig ist, dass die Zellen nicht in Berührung kommen mit Serum) oder 10% FBS in PBS, das Sammeln der Lösung / Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen.
5. Count die Zellen, und die Berechnung der für die Patch-Abmessungen benötigte Volumen (vorher quantifiziert). Hinweis: Für eine 4 mm-Patch, hier 2 Millionen endothelialen Zellen verwendet werden.
6. Auszug 2 Millionen Zellen, und in einen neuen 15 ml konischen Röhrchen.
7. Drehen sich mit (228 × g) für 5 min.
8. Saugt den Überstand, so dass die Zellen als Pellet in einem konischen Röhrchen.
9. Mischen Sie die HA und Gelatine flüssigen Materialien in einer 1: 1-Verhältnis. Dann werden 80% des Gesamtvolumens in der konischen Röhrchen, Pellets.
10. Resuspendieren der Endothelzellen in dem 1: 1-HA / Gelatine-Mischung
11. Legen Sie die suspendierten Zellen im HA / Gelatine-Mischung in die Basis Fasermatrix aus Schritt 2.
12. Hinzufügen 1/5 (20 Prozent) der der Vernetzer gewünschte Gesamtvolumen
13. Inkubation für 1 h bei 37 ° C aufweist.

5. Isolierung von Zellschichten

1. Entfernen Sie die 35 mm PNIPAAm-behandelten Platten die Zellen aus dem Inkubator und Ort enthalten, in einer Zellkultur Haube anRT.
2. Absaugen schnell die Medien aus den Zellen, und 2 ml 6% normaler Gelatine, die auf 37 ° C erhitzt wurde.
3. Während die Gelatine noch warm ist, setzen das Metallgitter in die Gelatine, Eintauchen unter die Oberfläche der normalen Gelatine (Film 1).
4. Zeigen die gesamte Platte auf Eis für 5 bis 7 min, so dass die Gelatine zu härten.
5. Nach 7 min, verwenden Sie einen Spachtel, um sorgfältig trennen die Gelatine Kanten von der Seite der Platte, und verwenden Sie dann Zange, um die Metallgitter von der Platte heben Hinweis: Die 6% Gelatine, und die Zellschicht sollte mit dem Gitter zu heben.
6. Bewegen Sie die Zellschicht auf der Schale und auf der Oberseite der Basisfasermatrix-Hydrogel Kombination sorgfältig Einstellen der Gitter auf der Oberseite des Konstrukts. Anmerkung: Die apikale Seite der Zellschicht noch in der oberen Position sein.
7. 2 ml warmem Medium (37 ° C).
8. Inkubieren O / N so dass die Zellschicht auf dem Hydrogel Oberfläche haften.
9. T entfernener Metallgitter, nachdem die Lösung erwärmt (etwa 1 h), oder am nächsten Tag.

Ergebnisse

Das Flussdiagramm (Figur 1) zeigt das gesamte Verfahren zur Herstellung des mehrschichtigen Patch. Zellschichten werden aus dem PNIPAAm behandelte Platte durch Senken der Temperatur unter 32 ° C abgelöst. Dann wird die Zellschicht auf der Oberseite des vernetzten Hydrogels der Endothelzellen in die darunterliegende faserige Matrix (Figur 1) enthält, beimpft platziert. Die vorbehandelten wärmeempfindlichen Platten können auch zur Erzeugung der Zellschichten eingesetzt werden. Sonder topo...

Diskussion

Die kritischen Schritte im Protokoll enthalten: die Beschichtung der Plattenoberflächen mit dem Polymer und thermoresponsiven Manipulation der Zellschichten nach dem Abkühlen der Platten. Da verschiedene Zellen weisen unterschiedliche physikalische Eigenschaften, wie Haftfähigkeit, die Hebezeit sollte für jeden anderen Zelltyp optimiert werden. Die zweite und am meisten deutlich anspruchs Komponente dieses Protokoll, konzentriert sich auf die Manipulation der Zellschicht, ein kritischer Aspekt der Verfahren zur Gewebean...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenzien
Calcein-AM	Invitrogen	C3099	Zelltracker / Lebendfarbstoff
Lysotracker Rot	Invitrogen	L7528	Zelltracker
Neutral Rot	Sigma	N7005	Sichtbarer Zellfarbstoff
pNIPAAM	Sigma Aldrich	412780250	Poly(N-isopropylacrylamid)
Toluol	Sigma Aldrich	244511-1L
Hexan	Sigma Aldrich	296090-1L
RAOSMC	Lonza	R-ASM-580	Glatte Muskelzellen der Ratte
SmGM2	Lonza	CC-4149	Medien der glatten Muskulatur
HUVEC	Invitrogen	C-003-5C	Humane venöse Endothelzellen
HyStem	Glycosan/ Biotime
Isopropylalkohol	VWR International	BDH1133-4LP
Trypsin	Corning Cellgro	25-053-C1
PBS	Gibco	14287-072
FBS	Gibco	16140-071<
Filterpapier	Ahlstrom	6310-0900
Buchner Trichter	Sigma Aldrich	Z247308
UpCell Platten	Nunc	2014-11
UV-Licht	Jelight Company	UVO Reiniger Modell Nr.42