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Methodenartikel

Ein Orthotopische Glioblastoma Maus-Modell Pflege Gehirn Parenchymale Körperliche Einschränkungen und geeignet für Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie

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DOI:

10.3791/51108

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21. April 2014

 ,  ,  , 
1Developmental Biology Institute of Marseille, Aix Marseille University, 2European Research Center for Medical Imaging, Campus de la Timone, 3Vesalius Research Center, KU Leuven Campus Gasthuisberg

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir haben eine kortikale orthotopen Glioblastom-Modell bei Mäusen für die Intravital Zwei-Photonen-Mikroskopie, die die biophysikalischen Einschränkungen im Spiel während des Wachstums des Tumors rekapituliert normalerweise etabliert. Eine chronische Glasfenster ersetzt den Schädel über dem Tumor ermöglicht die Follow-up der Tumorprogression über die Zeit durch Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Zusammenfassung

Glioblastoma multiforme (GBM) ist die aggressivste Form von Hirntumoren ohne heilende Behandlungen zur Verfügung zu halten.

Murine Modelle dieser Pathologie beruhen auf der Injektion einer Suspension von Gliomzellen in das Hirnparenchym nach Inzision der Dura mater. Während die Zellen oberflächlich injiziert zugänglich Intravital Zwei-Photonen-Mikroskopie zu sein, oberflächliche Injektionen nicht den pathophysiologischen Bedingungen zu rekapitulieren. In der Tat, auf der Flucht durch die Einspritztrakt meisten Tumorzellen zu erreichen, die extra-duralen Raum, wo sie in Abwesenheit von mechanischen Einschränkungen von Parenchym ungewöhnlich schnell zu erweitern.

Unsere Verbesserungen bestehen nicht nur in der fokal Implantieren eines Gliom Sphäroid anstatt Injizieren einer Suspension von Gliomzellen in den oberflächlichen Schichten der Hirnrinde, sondern auch ein Verstopfen der Injektionsstelle von einem vernetzten Dextran-Gel, halb Wulst, die zu der Umge geklebtding Parenchym und Dura mater mit Sekundenkleber verschlossen. Insgesamt sind diese Maßnahmen durchzusetzen, die physiologische Ausdehnung und Infiltration der Tumorzellen innerhalb der Hirnparenchym. Kraniotomie wurde schließlich geschlossen mit ein Glasfenster zementiert auf den Schädel, um chronische Bildgebung über Wochen in Abwesenheit von Narbengewebe Entwicklung zu ermöglichen.

Unter Ausnutzung der Fluoreszenz-transgene Tiere mit fluoreszierenden Tumorzellen haben wir gezeigt, dass die Dynamik der Wechselwirkungen zwischen Gliomzellen, Neuronen (z. B. Thy1-GFP-Mäuse) und Gefäßen (durch eine intravenöse Injektion eines fluoreszierenden Farbstoff markiert) auftreten, können durch intravitalen visualisiert gepfropften Zwei-Photonen-Mikroskopie während des Fortschreitens der Erkrankung.

Die Möglichkeit, Bild ein Tumor in mikroskopischer Auflösung in einem minimal beeinträchtigt Hirn Umwelt stellt eine Verbesserung der derzeitigen GBM Tiermodellen, die den Bereich der Neuro-Onkologie-und Drogentests profitieren sollte.

Einleitung

Glioblastoma multiforme erscheint als die aggressivste Form von Hirntumoren bei Erwachsenen mit einer medianen Überlebens von 12 Monaten und einer 5-Jahres-Überlebensrate von 5%. Clinical Management setzt auf Operation, Bestrahlung und Chemotherapie häufig in Kombination verwendet. Die Wirkungen dieser Behandlungen bleiben jedoch palliative 1-3.

Bis heute basieren die meisten neuro onkologischen Studien über Verfahren, die nur in der Lage sind, ein statisches Bild vermittelt und auf großen Kohorten von Tumor-tragenden Tieren durchgeführt geopfert zu verschiedenen Zeitpunkten (siehe beispielsweise 4,5). Die jüngste Entwicklung der Folgeverfahren, die auf intravitalen Bildgebung ermöglicht das Studium Gliom Wachstum und die Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und ihrer Mikroumgebung pathophysiologischen auf demselben Tier im Laufe der Zeit. Dies eröffnet den Weg zu exklusiven Stück von Informationen, die bisher unerreichbar war 6. Transgene Tiere ausdrücken fluoreszierenden Markierungen in Zellen von Interesse sein können aufd die spezifische Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und zB Neuronen in diesem Papier zu studieren.

Während des letzten Jahrzehnts, Intravital Zwei-Photonen-Mikroskopie 7 hat sich zu einem Standard in der Grundneuroonkologie Studien und präklinischen Studien 8,9 für seine Fähigkeit, tief Intravital Beobachtung Gehirn der Maus durchführen (> 500 um unter die Dura mater) mit eine mikrometrischen räumlichen Auflösung 10. Mit Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie mit orthotopical Tiermodellen mit einer chronischen Hirn Fenster 11 implantiert, ist es möglich, die Tumorprogression im Laufe der Zeit auf der gleichen Maus 9,12 folgen.

Einer der Hauptnachteile dieser vorveröffentlichten Tiermodell ist jedoch, daß sie die physikalischen Beschränkungen, die das Tumorwachstum regeln, die Dura mater wird nicht nach der Injektion der Zellsuspension 9,13,14 abgedichtet nicht nachahmen müssen. Gliom-Zellen können in der Leckextraduralen Raum Transformation eines orthotopen Gliom-Modell in eine heterotope ein.

Das Tiermodell hier dargestellt, besteht in der Injektion eines Sphäroids fluoreszierender Gliomzellen in der Hirnrinde bei einer Tiefe von 200 &mgr; m, gefolgt von der Abdichtung der Dura mater mit einer vernetzten Dextran-Gel-hemi-Wulst und histo-kompatible Kleber . Das Tumorwachstum wird dann in das Hirnparenchym, die pathophysiologischen physikalischen Beschränkungen hält beschränkt. Eine chronische Glasfenster über dem Tumor implantiert ermöglicht einen einfachen optischen Zugang für Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie. Mit transgenen Tiere exprimieren fluoreszierenden Markierungen in Zellen von Interesse ist es möglich, ein Follow-up der Gliom-Wachstum im Laufe der Zeit durchzuführen und seine Interaktion mit seiner Mikroumgebung (hier mit Neuronen und Gefäßsystem mit fluoreszierenden Dextranen hervorgehoben) zu studieren.

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Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Gesetzgebung Französisch und in Übereinstimmung mit der Richtlinie der Europäischen Gemeinschaft Rates vom 24. November 1986 (86/609/EWG) für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Die Forschung an Tieren wurde von der Direction des services Départementale Vétérinaires des Bouches-du-Rhône (Lizenz-D-13-055-21) zugelassen und wird von der Ethikkommission der Provence Côte d'Azur n ° 14 (Projekt 87-04122012) zugelassen .

1. Spheroids Vorbereitung

  1. Herstellung von Agarose-beschichteten Petrischalen
    1. Mischen 1 g Agarose mit 100 ml Zellkulturmedium mit fötalem Rinderserum. Verwenden Sie eine Mikrowelle (850 Watt für 40 Sekunden, dann 3 x 15 sec; rühren Sie die Lösung zwischen den einzelnen Mikrowellen Sitzung), um die Lösung zu kochen und um die Agarose vollständig zu lösen. Autoklavieren 1% Agarose-Lösung für 20 min bei 120 ° C zu gewährleisten, Steri. keit Hinweis: Achten Sie darauf, um die Agarose vollständig zu lösen, bevor der Autoklav-Protokoll. Inhomogenität kann die Bildung von Sphäroiden beeinträchtigen.
    2. Sobald aus dem Autoklaven abgerufen gießen 10 ml der 1% igen Lösung in 100 x 20 mm Petrischalen. Verlassen die Petrischalen 20 min lang bei Raumtemperatur, damit das 1% Agarose-Lösung zu verfestigen.
    3. 10 ml PBS über dem Agarose Feuchtigkeit zu halten. Verschließen Sie den Deckel der Agarose-beschichteten Petrischalen, indem Sie sie mit Parafilm um Verdunstung zu vermeiden. Petrischalen für bis zu 2 Monate bei 4 ° C gelagert, wenn sie richtig mit der PBS-Schicht befeuchtet werden.
  2. Sphäroid-Kultur
    1. In einer 75 cm 2-Kolben, die Kultur Gliom-Zellen in ihrer empfohlenen Medium als Monoschicht.
    2. Ersetzen der PBS aus einer 1%-Agarose-beschichteten Petrischale mit 1,5 ml "vorkonditioniert mittel" von den Kolben mit dem 2D-Gliom-Zellmonoschicht gesammelts.
    3. Entfernen des Mediums aus den Kolben mit dem 2D-Monoschicht von Gliomzellen.
    4. Die Monoschicht vorsichtig spülen mit 10 ml PBS.
    5. 2 ml 0,05% Trypsin / EDTA-Lösung und Inkubieren der Kolben 4 min bei 37 º C Anmerkung: Die Inkubationszeit kann je nach der verwendeten Zelllinie variieren.
    6. In 8 ml Kulturmedium, um die Wirkung von Trypsin zu stoppen, sanft spülen Sie die Zellsuspension. Hinweis: Achten Sie darauf, nicht in die Luft in der Zellsuspension zu spülen, wie es Zelltod erhöht.
    7. Setzen 6 ml der Zellsuspension in einem sterilen Fläschchen.
    8. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 4 min bei 800 Umdrehungen pro Minute.
    9. Entfernen des Überstandes und sanft auszusetzen das Zellsediment in 3 ml Kulturmedium.
    10. Samen der Zellsuspension in die vorbereitete Agarose-beschichteten Petrischale.
    11. Setzen Sie die Petrischale bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Atmosphäre für 2 bis 3 Tage, bis Sphäroiden gewünschten Durchmesser gebildet werden.

2. Sphäroid-und Fenster-Implantation

  1. Herstellung des Einspritzsystems
    1. Rein Glaskapillaren (1 mm im Durchmesser) durch Beschallung in 70% Ethanol für 10 min. Zwei Mal mit Wasser vor Platzierung innerhalb eines Inkubators, bis sie trocken spülen.
    2. Ziehen Sie mehrere gereinigte Glas Kapillaren mit einer Pipette Puller, um einen kleinen Vorrat vorzubereiten.
    3. Brechen die Spitze der Kapillare gezogen durch Kratzen der Extremität auf einem Papiertuch, um eine abgeschrägte Ende der gewünschten Größe zu erhalten: in der Regel einen Außendurchmesser von 300-350 &mgr; m und einem Innendurchmesser von 250-300 &mgr; m. Während dieser Formgebungsverfahren, steuern die Durchmesser der Kapillare mit einem Makroskop deren Okular mit einem abgestuften Mira ausgestattet.
    4. Verbinden des nicht abgeschrägten Ende der Kapillare mit einem 3-Wege-Verteiler mit einem Stück Kunststoffschlauch, dessen Innendurchmesser entspricht dem Außendurchmesser der Kapillare.
    5. Mit Kunststoff Tubing, verbinden die beiden anderen Möglichkeiten, den Verteiler ein 25 &mgr; l Mikroliter-Spritze und einer 1 ml Spritze mit histo-kompatiblen Mineralöl beladen.
    6. Stellen Sie die vielfältigen Wahlschalter auf einen Weg zwischen der Mikroliter-Spritze und dem 1 ml Spritze zu etablieren. Entfernen der Kolben des Mikroliter-Spritze aufgezogen und Mineralöl rückwärts in Mikroliter-Spritze, bis er austritt, indem der Kolben der 1 ml Spritze. Ersetzen Sie den Kolben der Mikroliterspritze, während die Betreuung keine Luftblasen in der Röhre zu verlassen.
    7. Stellen Sie die vielfältigen Wahlschalter auf einen Weg zwischen der Kapillare und der 1-ml-Spritze zu etablieren. Füllen Sie die Kapillare mit Mineralöl, bis es aus Lecks von der Spitze, während die Betreuung keine Luftblasen in der Röhre zu verlassen.
    8. Einstellen der Verteiler Selektor, um eine Verbindung zwischen der Mikroliterspritze und der Kapillare zu schaffen. Auszustoßen etwa 10 &mgr; l Mineralöl.
    9. Tauchen Sie die Kapillare Spitze in PBS-Lösungund mit Hilfe der Gradmesser für die Mikroliter-Spritze, saugen in 5 ul PBS in der Kapillare. Beachten Sie, dass der Meniskus zwischen Öl und PBS ist deutlich sichtbar.
    10. Befestigen Sie die Kapillare auf einem 3-Achs-Mikromanipulator Montage unter der Operation Makroskops. Dieses System wird verwendet, um die Kapillarwirkung an der Injektionsstelle unter Sichtkontrolle zu zielen.
  2. Sphäroid-Implantation
    1. Die Maus leicht sedieren durch Inhalation von Isofluran in einem Induktionskammer (1,5% in Luft während 1 bis 1,5 min).
    2. Betäuben das Tier mit einer intraperitonealen Injektion einer Mischung aus Ketamin / Xylazin (120 mg / kg, 12 mg / kg). Beachten Sie, dass der Anästhesie die Körpertemperatur des Tieres verringert oft. Es wird empfohlen, mit der Operation in einem Raum bei 26 ° C gehen und das Tier warm, mit einer darunter liegenden temperaturgeregelten Heizkissen halten.
    3. Augensalbe anwenden, um ein Austrocknen der Augen zu vermeiden.
    4. Rasur der Kopfhaut des Tieres.
    5. Ortdas Tier in einem stereotaktischen Rahmen mit Ohr-Bars und ein Mundstück.
    6. Reinigen Sie die Haut mit Povidon-Iod (3% Seife, dann 10% Lösung).
    7. Einen 1 cm langen Schnitt in Längsrichtung in der Mitte der Kopfhaut mit einem Skalpell. Mit einer Schere schneiden und entfernen Sie die Haut oberhalb der Scheitelbeine.
    8. Mit einem Skalpell vorsichtig die Knochenhaut über dem Schädel. Cyanacrylat Großzügig auf dem Knochen, um eine raue Oberfläche für später Zement Treue zu erzeugen.
    9. Bohren Sie das Scheitelbein unter einem chirurgischen Makroskops um eine Kraniotomie von 4 mm Durchmesser zu erzeugen. Großzügig hinzufügen eiskaltem PBS mit Pencillin (1.000 U / ml) und Streptomicin (1 mg / ml) während des gesamten Verfahrens zur Erwärmung zu verhindern. Entfernen Sie die kleine Knochenfragmente mit einer Zange und einem nassen steriler Gaze. Achten Sie darauf, mindestens 1 mm vom parietalen Schädelnähte zu vermeiden, Blutungen zu bohren.
    10. Dünn der Knochen an der Grenze der Kraniotomie, wo die Glasfenster verschlossen werden. Ziel ist es, eNsure später ebenen Positionierung der Glasscheibe mit einer maximalen Kontaktfläche zwischen dem Gehirn und dem Glas. Entfernen Sie langsam den Knochen mit einer Pinzette und reinigen Sie die freiliegenden Dura mater mit der PBS-Lösung.
    11. Nehmen Sie einen runden Glasdeckglas 5 mm Durchmesser, reinigen Sie es mit Alkohol und trocknen Sie sie mit Seidenpapier. Versuchen Sie, das Deckglas als Deckel für die Kraniotomie verwenden und bestätigen, dass eine große, flache Oberfläche des Gehirns in Kontakt mit dem Glas bekommt. Bei Bedarf entfernen Sie das Deckglas auf die Seiten weitere dünne Knochen. Gehen Sie, bis das Gehirn kann flach zusammengedrückt, wenn sanft Druck auf das Deckglas einmal an Ort und Stelle zu bekommen.
    12. Reinigen Sie wieder das Deckglas mit Alkohol, trocknen Sie sie mit Seidenpapier, und speichern Sie sie auseinander.
    13. Mit einer 26-Gauge-Nadel ein Loch in der Dura mater in der Mitte der Schädel noch vermieden Hauptblutgefäße. Achten Sie darauf, nicht die Hirnparenchym als Zweck dieses Schrittes beschädigt wird, nur um die Dura mater zu öffnen.
    14. Reinigen Sie die Dura mater-with PBS-Lösung zu hämorrhagischen Blut zu entfernen. Abdeckung mit einem Stück Seidenpapier während der Vorbereitung der Injektion Sphäroid.
    15. Mit dem Sphäroid Einspritzsystem in Schritt 2.1 hergestellt, saugen einen runden Sphäroid Montage des kapillaren Innendurchmesser (ungefähr 200-250 &mgr; m) aus der Petrischale in Schritt 1.2 hergestellt. Sphäroid sollte die zusammen mit rund 5 ul Kulturmedium. Es sollte bis in die Spitze der Kapillarwirkung unter seinem Gewicht fallen.
    16. Entfernen Sie die nasse Seidenpapier verwendet, um die Kraniotomie decken und die Position des Tieres unter dem Einspritzsystem.
    17. Senken Sie die Injektionspipette, bis sie das Loch in der Dura mater gemacht berührt. Dann senken Sie es wieder von 250 um. Warten Sie 30 Sekunden.
    18. Spritzen Sie das Sphäroid mit dem Kolben der Mikroliterspritze (2-3 ul), während das Pumpen Sie das überschüssige Flüssigkeit mit einem dünnen Stück Seidenpapier. Warten Sie 30 Sekunden und dann sanft heben Sie die Injektionspipette um 50 um in Richtung der Oberfläche. Warten Sie erneut 30 sec und repeat die Hebevorgang von den Schritten von 50 &mgr; m bis zur Oberfläche. Wartezeiten vermeidet Extraktion des Sphäroiden, die mit der Pipette haften würde.
    19. Bestätigen das Vorhandensein des Sphäroids im Gehirn unter Verwendung eines Fluoreszenz-Makroskop.
    20. Mischen 100-300 um Durchmesser vernetztes Dextran-Gel-Perlen mit PBS-Lösung in einer Petrischale. Warten 1min und Fisch einige hydratisierten Perlen. Legen Sie sie auf den Knochen neben dem Kraniotomie.
    21. Unter makroskopischen Steuer, wählen Sie eine Perle mit einem Durchmesser ähnlich der Größe der Dura mater-Öffnung. Schneiden Sie das vernetzte Dextran Gelkügelchen in zwei Hälften mit einer Pinzette.
    22. Sanft legte ein vernetztes Dextran-Gel Hemi-Perle in die Injektionsbohrung mit der konvexen Seite in Richtung der Sphäroid. Achten Sie darauf, das Sphäroid, und drücken Sie leicht nach unten zu entfernen, bis die Grenze der konkaven in Kontakt mit der umgebenden Dura mater zu erhalten.
    23. Geben Sie einen Tropfen Sekundenkleber auf einem Glasträger; Tauchen Sie die Spitze eines Zahnstochers in die drop eine kleine Menge von Klebstoff zu nehmen. Dichtung schnell die Kanten des vernetzten Dextran-Gel Hemi-Wulst an der benachbarten Dura mater durch Stanzen Kleber an. Achten Sie auf eine schnelle und präzise Bewegungen, um zu verhindern Verkleben der vernetzten Dextrangel Hemi-Wulst zum Zahnstocher durchzuführen. Vermeiden Sie Überschuß von Leim, zu verbreiten und behindern kann, wenn nicht zu verhindern, Bild einmal getrocknet. Warten Sie 2 min für den Leim trocknen und reinigen Sie den Kraniotomie und den umgebenden Knochen mit PBS-Lösung.
  3. Fenster-Implantation
    1. Setzen Sie die 5 mm Durchmesser rund Deckglas über der Kraniotomie (siehe 2.2.12). Die Ränder des Deckglases muss mit dem ausgedünnten Schädel an der Außenseite des Schädel sein. Das Deckglas ist in Kontakt mit der Dura mater und der Knochendünnt auf den Kanten. Es ist sehr wichtig, einen direkten Kontakt zwischen der Dura mater und dem Deckglas haben sonst kann Narbengewebe entwickeln und behindern optische Klarheit.
    2. Mit einem Gewebe, absorbieren die PBS auf the Deckglas, so dass die Kanten-Lösung nicht vollständig decken die Kraniotomie bei Anlegen einer kleinen Druck in der Mitte des Deckglases. Dadurch wird sichergestellt, dass der Knochen-, Glas-und Gehirn gemeinsam auf der Seite des Bereichs von Interesse verklebt.
    3. Halten Sie einen kleinen Druck auf der Mitte des Deckglases mit einer Pinzette vorsichtig, während die Anwendung Cyanacrylat an der Grenze zwischen dem Knochen und dem Deckglas. Der Kleber spontan, bis die Schnittstelle mit PBS-Lösung verteilt. Lösung als Barriere aufgrund der Hydrophobie des Klebstoffs dienen. Dicht sollten wirksam in weniger als einer Minute, aber nehmen einen extremen darauf, nicht die Deck bewegen, bis es behoben ist. Dies würde sonst in Sekunden Leckage auf die Dura mater damit zu einem Scheitern der Operation führen führen.
    4. Im Falle würde Kleber auf dem Glas ausgebreitet haben, entfernen Sie sie mit einem Mikro-Skalpell, indem Sie Spiralbewegungen, wie es sonst optische Klarheit zu verringern. Achten Sie nicht auf das Deckglas Durin brecheng das Verfahren wegen zu hoher Druck.
    5. Konsolidieren des Glasfixierungs indem Zahnzement an den Kanten des Deckglases in Richtung der benachbarten Schädel. Stellen Sie sicher, die ganze Schädel ausgesetzt, bis die Kopfhaut bedecken. Mit Extra-Zement, aufzubauen Seitenwände rund um das Deckglas auf den Pool für das Eintauchen des Ziels erforderlich erstellen. Der Zahnzement wird in weniger als 10 min zu härten.

3. Post-operative Pflege und Vorbereitung für Imaging

  1. Post-operative Betreuung
    1. Entfernen Sie die Maus von der stereotaktischen Rahmen, injizieren Dexamethazon (0,2 mg / kg) und Rimadyl (5 mg / kg) sc in den Beckenregionen und legen sie in einen Käfig mit einem warmen Gewebe-Nest.
    2. Überwachen Sie die Tier, bis die Auswirkungen der Narkose sind verschwunden. In der Regel 2 bis 3 Stunden nach der Operation, sind Mäuse voll mobil. Stellen Sie sicher, dass das Tier hat einen einfachen Zugang zu Nahrung und Wasser. Geben Sie das Tier mit Agarose, die Glukose (Agarose3% Glucose 3%).
    3. Überwachung der Tiergewicht täglich und injizieren Dexamethazon (0,2 mg / kg) und Rimadyl (5 mg / kg) sc für die erste 10d nach der Operation. Aus ethischen Überlegungen, die Mäuse einschläfern, wenn ein Verlust von mehr als 15% seines ursprünglichen Gewichts. Hirndruck steigt mit der Größe des Tumors, die zu motorischen Beeinträchtigungen für das Tier. Dies ist abhängig von Tumorzelllinie und tritt bei verschiedenen Verzögerungen nach der Operation. Besondere Vorsicht ist geboten, um den Endpunkt des Experiments mit der verwendeten Zelllinie zu charakterisieren.
  2. Vorbereitung für die Bildgebung
    1. Die Maus leicht sediert durch Inhalation von Isofluran in einer Induktionskammer (1,5% in Luft für 1 bis 1,5 min).
    2. Betäuben das Tier mit einer intraperitonealen Injektion einer Mischung aus Ketamin / Xylazin (100 mg / kg, 10 mg / kg). Eine solche Betäubung erlaubt in der Regel 45 Minuten der Beobachtung. Um mehr Imaging-Sitzungen durchführen, wird der Maus unter Dauer Inhalation von Isofluran in platziertLuft (0,25 bis 0,75%).
    3. Augensalbe anwenden, um ein Austrocknen der Augen zu vermeiden.
    4. Setzen Sie das Tier auf einem stereotaktischen Rahmen und blockieren die Schädel mit den earbars.
    5. Um die Darstellung von Blutgefäßen, kann ein fluoreszierender Farbstoff intravenös injiziert werden.
    6. Wenn das Fenster erscheint schmutzig, kann es durch sanftes Entfernen der Fremdkörper mit einer dünnen Klinge und der Ecke eines Gewebe gereinigt werden. Verwenden Sie keinen Alkohol, um das Fenster zu reinigen, da es nicht immer mit Zahnzement kompatibel und unter dem Fenster das Gehirn kühlen.

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Ergebnisse

Sobald die chirurgische Protokoll ist (Fig. 1) durchgeführt wird, Tieren kann mittels Fluoreszenzmikroskopie über Wochen bis zur Tötung beobachtet werden. Eine entzündliche Reaktion kann nach der Operation, die in ein bis zwei Wochen verschwindet beobachtet werden. Tumorwachstum kann durch verschiedene Techniken, einschließlich Fluoreszenzmikroskopie makroskopische und Zwei-Photonen-Mikroskopie (Fig. 2) beobachtet werden. Beispiel hier gezeigten Bilder wurden auf einem Fluoreszenz Makro...

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Diskussion

Dieser Ansatz ermöglicht die Verwendung von optischen bildgebenden Verfahren zu überwachen, über Tage und Wochen das Wachstum einer orthotop Gliom implantiert. Das gleiche Tier kann anschließend im Verlauf der Pathologie zu praktisch jeder Hirnbildgebungsverfahren unterzogen werden; noch die Zwei-Photonen-Mikroskopie spezifische Vorbereitung bietet die einmalige Gelegenheit, subzellulärer Auflösung im Gehirn des lebenden Tieres zu erreichen. Unser Protokoll bietet den Vorteil, das Tumorwachstum in Hirngewebe und nicht a...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

Die Autoren herzlich danken Dr. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. und A. Weber Jaouen für hilfreiche Diskussionen; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, die Mitarbeiter der Tierhaltung bei IBDML und das Personal der PicSIL Imaging-Plattform an IBDML für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) an GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche unterstützt sur le Cerveau (FRC) auf FD, durch Stipendien von der Fédération de la Recherche Médicale und Cancéropôle PACA CR.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BohrerDremel (Deutschland)398jeder hochwertige chirurgische Knochenbohrer würde ausreichen Bohrgrat
(#1/4 Hartmetall-Rundgrat)World Precision Instruments (USA)501860 (#1/4)auch verkauft von Harvard Apparatus
GewebeschereWorld Precision Instruments (USA)14395
Dumont Pinzette M5SWorld Precision Instruments (USA)501764
ZahnzementGACD (USA)12-565 & 12-568
CyanacrylatEleco-EFD (Frankreich)Cyanolit 201
Glaskapillaren ohne FilamentClark Electromedical Instruments (UK)GC100-15
Mikroliterspritze (25 & Mikro; l)Hamilton (USA)702
MikromanipulatorWorld Precision Instruments (USA)Kite-R
T Ableitung (3-Wege-Absperrhahn - Luer-Lock)World Precision Instruments (USA)14035-10
Stereotaktischer Rahmen (Mausadapter)World Precision Instruments (USA)502063
GlasdeckgläserWarner Instruments (USA)CS-5R Elektronikartikel (64-0700)
Vernetztes Dextran-Gel (Sephadex) G50 Grob 100-300 & Mikro; m KügelchenErhältlich von verschiedenen Anbietern u.a. Sigma (Deutschland)
AugensalbeTVM (Frankreich)Ocry-gel
Fluoreszenz-MakroskopLeica MZFLIII (Deutschland)auch von anderen Firmen verkauft
Zwei-Photonen-MikroskopZeiss LSM 7MP (Deutschland)auch von anderen Firmen verkauft (Nikon, …)
Durchstimmbarer Infrarot-Femtosekundenlaser (Ma&�um;-Taï)Spectra Physics (USA)wird auch von anderen Unternehmen vertrieben

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Orthotopes Glioblastom-ModellImplantation durch kraniales FensterImplantation von Gliomsphäroidenvernetztes Dextran-GelCyanacrylat-Versiegelungfluoreszierende transgene TiereBildgebung der TumorprogressionAnalyse des GefäßumbausUntersuchung der zellulären Mikroumgebung
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