Summary
La paroi cellulaire bactérienne est composée de peptidoglycane, un réseau macromoléculaire de brins de sucre réticulés par des peptides. La chromatographie liquide ultra-performante offre une résolution et un débit élevés pour de nouvelles découvertes de composition de peptidoglycane. Nous présentons un procédé pour l’isolement des murs de cellules (sacculi) et leur préparation suivante pour l’analyse par l’intermédiaire d’UPLC.
Abstract
La paroi cellulaire bactérienne est essentielle pour la détermination de la forme cellulaire pendant la croissance et la division, et maintient l’intégrité mécanique des cellules face aux pressions de la turgescence de plusieurs atmosphères en magnitude. À travers les différentes formes et tailles du règne bactérien, la paroi cellulaire est composée de peptidoglycane, un réseau macromoléculaire de brins de sucre réticulés par de courts peptides. L’importance centrale du peptidoglycane pour la physiologie bactérienne sous-tend son utilisation en tant que cible antibiotique et a motivé des études génétiques, structurelles et biologiques cellulaires sur la façon dont il est solidement assemblé pendant la croissance et la division. Néanmoins, des investigations approfondies sont encore nécessaires pour caractériser pleinement les activités enzymatiques clés dans la synthèse du peptidoglycane et la composition chimique des parois cellulaires bactériennes. La chromatographie liquide à haute performance (CLHP) est une méthode d’analyse puissante pour quantifier les différences dans la composition chimique des parois des bactéries cultivées dans diverses conditions environnementales et génétiques, mais son débit est souvent limité. Ici, nous présentons une procédure simple pour l’isolement et la préparation des parois cellulaires bactériennes pour les analyses biologiques du peptidoglycane via HPLC et ultra performance chromatographie liquide (UPLC), une extension de HPLC qui utilise des pompes pour fournir des pressions ultra-élevées allant jusqu’à 15 000 psi, par rapport à 6 000 psi pour HPLC. En combinaison avec la préparation des parois cellulaires bactériennes présentée ici, les injecteurs d’échantillons à faible volume, les détecteurs avec des taux d’échantillonnage élevés, des volumes d’échantillons plus petits et des temps d’exécution plus courts de l’UPLC permettront une résolution et un débit élevés pour de nouvelles découvertes de composition de peptidoglycane et de biologie cellulaire bactérienne fondamentale dans la plupart des laboratoires biologiques ayant accès à une ultracentrifuge et à un UPLC.
Introduction
Le but de la méthode décrite ici est d’isoler les parois cellulaires bactériennes intactes (sacculi) et de digérer le peptidoglycane (PG) de telle sorte que la chromatographie liquide ultra-performante (UPLC) peut être utilisée pour fournir des informations telles que l’identité des composants muropeptides et leurs concentrations, la longueur moyenne des brins de glycane, et la fraction de matériau impliquée dans les réticulations entre les brins. Pour une discussion détaillée de la biochimie PG et des espèces de muropeptides, il existe plusieurs excellentes revues qui décrivent la structure de PG et son rôle dans l’infection, la résistance, la morphogenèse et la croissance1-6. La chromatographie liquide haute performance (HPLC) pour l’analyse PG a été initialement développée par Glauner et Schwarz dans les années 1980, et plus récemment a été améliorée et largement appliquée dans les laboratoires de Miguel de Pedro et Waldemar Vollmer. Les méthodes précédentes utilisaient l’analyse d’acides aminés ou la chromatographie sur papier, des techniques fastidieuses et fastidieuses qui ne donnent pas d’évaluations précises ou complètes des composants de la paroi cellulaire.
L’analyse UPLC peut être facilement mise en œuvre dans n’importe quel laboratoire de recherche fondamentale ayant accès à un ultracentrifuge et à un UPLC. La méthode UPLC que nous présentons ci-dessous isole des sacculi complets, fournissant ainsi des informations quantitatives complètes sur toutes les espèces chimiques qui s’y trouvent. Cette méthode donne une quantification précise de tous les muropeptides à travers une population de bactéries, le tout dans un run UPLC de 20 minutes. La mise en œuvre de cette méthode n’implique que des compétences de laboratoire de base, sans investissement financier important dans les matériaux. Pour exécuter les étapes de cette méthode, les chercheurs n’ont qu’à être qualifiés pour pipetter, préparer des tampons et des enzymes et ajuster le pH, le rendant accessible à un large éventail de disciplines scientifiques. Le choix des enzymes utilisées dans ce protocole dépend de l’espèce de bactérie analysée; le protocole décrit ici est utile pour Escherichia coli,et s’est généralement avéré adéquat pour isoler des sacculi d’autres organizations Gram négatif. Il est recommandé de consulter la littérature lors de l’application de cette méthode aux bactéries à Gram positif; chez ces espèces, la purification du sacculus a traditionnellement été plus difficile. En particulier, cette méthode peut devoir être modifiée en termes de choix d’enzymes et de durée de digestion pour s’adapter aux parois plus épaisses et aux polymères accessoires tels que les acides téichoïques des bactéries à Gram positif. La première enzyme de ce protocole fend la lipoprotéine membranaire externe (telle que la lipoprotéine de Braun, ou Lpp) attachement au peptidoglycane, libérant ainsi tout sauf le peptide di- (ou tri-) C-terminal du Lpp de la paroi cellulaire. Cette étape est nécessaire lors de l’examen des entérobactéries, mais de nombreuses autres bactéries à Gram négatif n’ont pas d’équivalents Lpp, et donc cette étape peut être ignorée. Une deuxième enzyme se fend spécifiquement après le composant acide muramique du peptidoglycane, solubilisant la sous-unité disaccharide qui forme l’espèce muropeptide. Pour fournir une évaluation précise de l’architecture du PG, des précautions doivent être prises en digérant les sacculi pour empêcher le clivage des ponts croisés ou de toute autre partie de la tige peptidique.
Bien que les compositions chimiques du peptidoglycane provenant de plus de 100 souches d’environ 40 espèces bactériennes aient été analysées par HPLC, aucune analyse n’a été effectuée avec la technologie UPLC. En outre, des travaux antérieurs ont caractérisé le peptidoglycane à partir d’une petite fraction du domaine bactérien, en partie limitée par le débit de HPLC. Par conséquent, la diffusion de cette méthode au plus grand nombre de chercheurs possible, et sa mise en œuvre sur les plateformes UPLC, seront essentielles pour conduire des études physiologiques de la grande fraction d’espèces bactériennes dont le peptidoglycane n’a pas encore été catégorisé.
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Protocol
1. Cultiver des cultures bactériennes dans 2,5 ml de milieux pendant la nuit
Cultures diluer 1:100 dans 250 ml de milieux frais et atteindre600 DO de 0,7-0,8. Préparer une solution de dodécyl sulfate de sodium (FDS) à 6% dans l’eau.
ATTENTION: La poudre de FDS est dangereuse - évitez d’inhaler de la poudre de FDS; porter un masque sur le nez et la bouche.
2. Jour 1 - Les cultures bactériennes lysantes sont effectuées au cours d’une journée et pendant la nuit
- Pendant que les cultures diluées se développent, placez un bain d’eau bouillante sur une plaque chauffante dans un bécher de 1 L. Une fois l’eau bouillante, aliquote 6 ml de FDS à 6% dans des tubes en polypropylène de 50 ml, ajouter une petite barre d’agitation à chaque tube, fixer les couvercles du tube à bout de doigts, placer les tubes au bain-marie et activer l’agitation à 500 tr / min sur la plaque chauffante.
- Récolter les cultures de 250 ml à 5 000 × g pendant 10 min à température ambiante et ressusciter les granulés dans 3 ml de milieu ou 1x saline tamponnée au phosphate. Pipeter lentement les suspensions cellulaires dans des tubes de 50 ml avec une FDS bouillante à 6% pour lyser les cellules (concentration finale 4% SDS) pendant que les tubes sont immergés dans le bain d’eau bouillante, et refermer les couvercles à doigts serrés. Les suspensions cellulaires doivent être rapidement transférées dans une FDS bouillante une fois remises en suspension. Les changements environnementaux brusques doivent être évités, car cela pourrait entraîner une altération erronée de la structure de la paroicellulaire.
- Couvrez le bain d’eau bouillante et laissez les cellules bouillir pendant 3 heures, en vérifiant périodiquement le niveau d’eau et en remplissant le bain-marie si nécessaire. Après 3 heures, éteignez l’élément chauffant de la plaque chauffante et continuez à remuer pendant la nuit à 500 tr / min.
3. Jour 2 - Les digestions enzymatiques sont effectuées au cours d’une journée
- Si la FDS a précipité dans les tubes de 50 ml pendant la nuit, régler le bain d’eau pour qu’il bout pendant 1 à 2 heures supplémentaires. Allumez un bloc chauffant à 60 °C. Préparer un stock de 1 mg/ml de Pronase E dans 10 mM de Tris-HCl (pH 7,2) + 0,06 % p/v de NaCl et activer la Pronase E à 60 °C pendant au moins 30 min.
- Utilisez un ultracentrifuge réglé à 400 000 × g pour faire tourner des échantillons pendant 20 min à température ambiante afin de granuler les grands polymères PG et ainsi les purifier d’autres composants cellulaires. Retirez soigneusement le surnageant, puis ressuscitez chaque pastille dans de l’eau ultrapure à température ambiante. NOTA : Le volume de remise en suspension dépend du volume des tubes ultracentrifugés utilisés; utiliser un volume qui remplit les tubes au moins à mi-chemin, mais ne dépasse pas le volume maximal des tubes. Répéter la centrifugation/lavage jusqu’à ce que l’eau ne forme pas de bulles pendant la remise en suspension, ce qui indique que la FDS a été complètement enlevée (généralement trois lavages). Arrêtez de laver le culot si un précipité blanc se forme, car cela indique que les sacculi s’agglutinent. L’agglutination n’est pas catastrophique, mais les touffes se lient très fortement au plastique et à la verrerie, ce qui entraîne une perte importante d’échantillons. Dans ce cas, procédez au protocole à l’aide de l’échantillon de sacculi agglutiné.
- Lors de la dernière étape de centrifugation/lavage, ressusciter les échantillons dans 900 μl de Tris-HCl 10 mM (pH 7,2) + 0,06 % p/v naCl et les transférer dans des tubes de 2 ml préalablement percés de trous dans les sommets avec une petite aiguille. Ajouter 100 μl de 1 mg/ml de Pronase E activée (concentration finale de 100 μg/ml) à chaque échantillon et incuber à 60 °C pendant 2 h. Réglez un bloc thermique différent à 100 °C.
- Arrêtez la digestion de la Pronase E en ajoutant 200 μl de FDS à 6% à chaque échantillon et faites bouillir les échantillons dans le bloc thermique à 100 °C pendant 30 min. Régler un bloc thermique différent à 37 °C et faire un stock de muramidase (mutanolysine) de 1 mg/ml dans un tampon phosphate de 50 mM (pH 4,9).
- Comme à l’étape 3.2, utiliser une ultracentrifugation fixée à 400 000 × g pour faire tourner les échantillons pendant 20 min à température ambiante et laver à l’eau ultrapure à température ambiante jusqu’à ce que la FDS soit complètement retirée (généralement trois lavages). Le volume de remise en suspension dépend du volume des tubes ultracentrifugés utilisés; utiliser un volume qui remplit les tubes au moins à mi-chemin, mais ne dépasse pas le volume maximal des tubes.
- Lors de la dernière étape de centrifugation/lavage, remise en suspension des échantillons dans 200 μl de tampon phosphate de sodium de 50 mM (pH 4,9). Ce volume peut être ajusté en fonction de la quantité de peptidoglycane dans l’échantillon et peut dépendre de l’espèce. S’il existe des rapports d’analyse HPLC déjà publiés pour les espèces d’intérêt, ce volume peut être estimé en fonction de ces quantifications (une compilation des études HPLC PG peut être trouvée dans les informations supplémentaires de la référence7). Pour d’autres espèces, la préparation du sacculus peut être exécutée jusqu’à cette étape, puis différentes quantités de volumes de remise en suspension peuvent être ajoutées pour reproduire les échantillons afin de déterminer le volume minimal qui permet au PG de rester en solution (voir Discussion pour d’autres estimations). Si l’échantillon contient plus de peptidoglycane, augmentez le volume de remise en suspension; si l’échantillon contient peu de peptidoglycane, réduire le volume de remise en suspension à un minimum de 50 μl.
- Transférer les échantillons dans des tubes de 1,5 ml et ajouter 1 mg/ml de muramidase pour obtenir une concentration finale de 40 μg/ml. Incuber 6-8 heures ou pendant la nuit à 37 °C.
4. Jour 3 - La préparation des échantillons pour UPLC est effectuée le dernier jour
- Allumez un bloc chauffant à 100 °C. Faire bouillir les échantillons sans FDS pendant 5 min pour arrêter la digestion de la muramidase. Échantillons de centrifugeuses pendant 10 min à 16 000 × g à température ambiante, puis transférer le surnageant (les muropeptides sont maintenant solubles) dans des tubes de verre de 13 mm x 100 mm. Essayez de récupérer autant de surnageant que possible, en vous rapprochant très près de la pastille sans la déranger.
- Ajuster le pH en ajoutant un tampon de borate de 500 mM (pH 9) à l’échantillon pour une concentration finale de tampon de borate de 100 mM. Le tampon borate est compatible avec l’agent réducteur borohydrure de sodium. Ajouter 1-2 grains de borohydrure de sodium pour réduire chaque échantillon et laisser la réaction se poursuivre pendant au moins 30 min à température ambiante. ATTENTION: Le borohydrure de sodium est très réactif et dangereux à manipuler - évitez tout contact avec la peau (portez des gants) et évitez tout contact avec les yeux (portez des lunettes de sécurité).
- Ajuster les échantillons à un pH de 3-4 (le point isoélectrique du muropeptide est d’environ 3,5) avec de l’acide orthophosphorique à 50 % v/v en utilisant des incréments de 20 μl jusqu’à pH 6, mesurés avec du papier indicateur de pH, puis en utilisant des incréments de 2 μl. ATTENTION: L’acide orthophosphorique est corrosif et dangereux à manipuler - évitez tout contact avec la peau (portez des gants) et évitez tout contact avec les yeux (portez des lunettes de sécurité). L’échantillon doit bouillonner en réponse à l’ajout d’acide orthophosphorique; lorsque l’échantillon cesse de bouillonner, cela indique généralement qu’un pH de 6 a été atteint. Si aucun bouillonnement ne se produit dans l’échantillon, cela peut indiquer que la quantité de borohydrure de sodium ajoutée était trop faible. Dans ce cas, arrêtez d’abaisser le pH, ajoutez soigneusement un ou deux grains de borohydrure de sodium, laissez réagir pendant 5-10 min, puis reprenez l’ajustement du pH.
- Filtrer l’échantillon à travers un filtre à seringue de 0,22 μm directement dans un flacon UPLC. Si un précipité s’est formé, chauffer le tube avec plusieurs passages à travers une flamme avant de filtrer. Si l’échantillon ne doit pas être injecté dans l’instrument UPLC dans la journée, congeler à -20 °C pendant la nuit. Les échantillons peuvent être conservés jusqu’à un an à -80 °C. L’échantillon peut être décongelé en passant plusieurs fois à travers une flamme.
- Injecter 10 μl de chaque échantillon sur un instrument UPLC équipé d’une colonne en phase inversée C18 de 1,7 μm et d’un détecteur d’absorbance réglé pour surveiller 202-208 nm. Les échantillons sont injectés séquentiellement, mais les capacités d’échantillonnage automatique permettent de traiter jusqu’à 96 échantillons par lots. Utiliser du phosphate de sodium à 50 mM (pH 4,35) + 0,4 % v/v d’azoture de sodium pour le solvant A, et du phosphate de sodium à 75 mM (pH 4,95) + 15 % v/v de méthanol pour le solvant B. REMARQUE : De l’azoture de sodium est ajouté pour compenser l’absorption de 205 nm du méthanol afin d’éviter la dérive de base. Réglez le débit à 0,25 ml/min et utilisez un gradient linéaire sur 25 min pour obtenir 100% de solvant B et une élution séquentielle des muropeptides dans les 30 min. Si la spectrométrie de masse est utilisée pour caractériser les muropeptides après UPLC, recueillir des fractions du pic d’intérêt dans un collecteur de fractions et sécher les fractions à l’aide d’un évaporateur centrifuge.
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Representative Results
Selon la procédure décrite à la figure 1,l’échantillon final devrait être constitué d’au moins 200 μl de solution claire qui a été filtrée directement dans un flacon UPLC (étape 4.4). La séparation UPLC des différents muropeptides dans un échantillon bactérien repose sur leur solubilité relative entre la phase mobile liquide et la phase stationnaire de la colonne. Les colonnes C18 en phase inversée fournissent une matrice fortement hydrophobe pour séparer les espèces de muropeptides en fonction de l’hydrophobicité et de la taille8; les monomères polaires de faible poids moléculaire s’éluent en premier, et les oligomères apolaires de poids moléculaire plus élevé s’éluent après (Figure 2). Un résultat typique de l’UPLC est illustré à la figure 2,avec une détection par absorbance UV à 202-208 nm en fonction du temps qui établit le temps de rétention d’un muropeptide particulier. Ce résultat représentatif montre une résolution claire entre la plupart des espèces de muropeptides et une forte force du signal à travers le spectre, ce qui permet l’analyse, et la longueur moyenne des brins de glycane.
La dernière étape décrite à la figure 1 consiste à ajuster le pH et à filtrer les particules fines qui peuvent obstruer les petites dimensions du tube utilisé dans l’UPLC. Si un échantillon est superconcentré, par exemple en ressuscitant dans 100 μl de tampon phosphate de sodium à l’étape 3.5 au lieu de 200 μl, l’échantillon peut devenir trouble, indiquant qu’une concentration critique a été atteinte et que les muropeptides ont précipité. Cette perte de solubilité entraînera le colmatage du filtre à seringues utilisé à l’étape 4.4, empêchant le dépôt de muropeptides dans le flacon UPLC et/ou le colmatage des conduits et de la colonne de la machine UPLC, qui sont des articles coûteux à remplacer. Un exemple de chromatogramme reflétant ce traitement d’échantillon aberrant est représenté à la figure 3; aucun pic n’a été élué, ce qui a entraîné l’absence de données sur la composition des PG. Un ajustement erroné du pH bien en dessous du point isoélectrique des muropeptides(par exemple à un pH de 2) peut également entraîner la précipitation de muropeptides et donc l’absence de pics discernables de l’analyse UPLC.
Figure 1. Schéma de la préparation des sacculi. Cette méthode s’appuie sur des cycles itératifs d’ultracentrifugation pour purifier la FDS loin des sacculi granulés.
Figure 2. Exemple de chromatogramme UPLC de PG à partir de sacculi digéré à partir de cellules E. coli MG1655. Notez que la résolution comparable de tous les muropeptides est obtenue dans 10% du temps d’une exécution HPLC typique. Étiquettes muropeptide - M = monomère, D = dimère, T = trimère; (2,3,4,5) indiquer le nombre de peptides de tige d’acide aminé ; modifications - G = glycine remplaçant la L-alanine, L = deux acides aminés supplémentaires du clivage de la pronase E, D = acide 3,3-diaminopimélique (DAP)-DAP crossbridge, N = terminaison anhydro-muropeptide. Par exemple, le D33DL est un dimère avec des peptides de tige 3-aa, liés par un pont croisé DAP-DAP, contenant deux acides aminés supplémentaires du clivage de la pronase E.
Figure 3. Analyse infructueuse d’UPLC des sacculi digérés des cellules MG1655 d’E. coli. L’absence de pics, indiquant qu’il n’y avait pas de muropeptides présents dans l’échantillon, est due au fait que les muropeptides se sont écrasés hors de la solution avant l’extraction dans un flacon UPLC (étape 4.4). Cette précipitation peut être due à une surconcentration des muropeptides ou à un pH trop bas.
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Discussion
Une étape critique de cette procédure est l’étape 3.1 du deuxième jour de préparation de l’échantillon. Si la FDS a précipité pendant la nuit, ou si les échantillons ont été stockés dans une FDS à 4 % pendant plusieurs semaines à température ambiante, les échantillons doivent être rediffusés pendant au moins 1 heure pour dissoudre la FDS. Une cause fréquente de précipitation de la FDS est l’utilisation de milieux avec des sels de potassium, de sorte que le potassium doit être évité dans les milieux si possible. Comme mentionné dans la section Résultats représentatifs, il est également essentiel d’ajuster le pH à l’intérieur du point isoélectrique des muropeptides (~ 3,5), mais pas trop inférieur au pH 3, sinon le matériau peut précipiter. Enfin, la remise en suspension de l’échantillon doit se produire dans le volume approprié de tampon phosphate de sodium (étape 3.5), qui doit être jugé par le chercheur. Lors du choix du volume de remise en suspension du tampon phosphate de sodium, il est important de considérer la quantité de matériau muropeptide susceptible d’être générée à partir d’une culture bactérienne particulière. Par exemple, si le volume final de culture est de 250 ml, comme indiqué ci-dessus, l’échantillon doit être ressuscité dans au moins 200 μl de tampon phosphate de sodium. Si le chercheur modifie la méthode à des cultures de 50 ml, les échantillons peuvent être remises en suspension dans 100 μl de tampon phosphate de sodium ou moins. Il est également important de tenir compte des quantités prévues de peptidoglycane chez une espèce; par exemple, les sphéroplastes d’E. coli contiennent beaucoup moins de peptidoglycane (environ 7 % de la quantité dans les cellules de type sauvage de E. coli 10), et la remise en suspension dans 100 μl ou moins de tampon phosphate de sodium est appropriée. S’il est difficile de cultiver une certaine espèce bactérienne ou souche en grande quantité (250 ml), le volume final de la culture peut être réduit et/ou la dilution de la culture de nuit peut être réduite. Enfin, l’injection sur un système HPLC nécessite un volume minimum de 200 μl, alors que 10 μl est suffisant pour un système UPLC.
La purification des composants PG dans différents organismes ou pour différentes applications peut être réglée en faisant varier le type de phase mobile, de colonne et de gradient sur l’instrument UPLC. Les phases mobiles à base de solvants, comme l’acétonitrile, peuvent être utilisées pour dessaler des échantillons avant la spectrométrie de masse. Différentes chimies de colonne peuvent également être nécessaires pour dessaler soigneusement les échantillons en vue d’une analyse ultérieure. La figure 2 montre le profil d’élution commun des muropeptides pour la bactérie Gram négatif en forme de bâtonnet E. coli MG1655; l’analyse de PG à partir de bactéries à Gram positif et/ou d’espèces avec d’autres formes peut nécessiter un réglage fin du gradient décrit à l’étape 4.5. Bien que les spectres UPLC tels que celui illustré à la figure 2 génèrent de nombreuses classes d’informations concernant le peptidoglycane, telles que l’identité muropeptide, le pourcentage de réticulation et la longueur des brins de glycane, la méthode présente plusieurs limitations, y compris l’incapacité de cartographier la distribution spatiale des caractéristiques structurelles à travers les sacculi. Par exemple, ni les emplacements de crossbridging le long d’une chaîne de glycane ni les emplacements des lipoprotéines liées ne peuvent être discernés par l’intermédiaire de HPLC ou UPLC.
Les avantages de l’analyse de la composition chimique du PG avec HPLC comprennent une résolution plus élevée, un temps d’analyse plus court et une quantification précise11 par rapport aux techniques traditionnelles telles que l’analyse d’acides aminés12-14 ou la chromatographie sur papier15,16. UPLC offre une vitesse et une sensibilité plus élevées que la HPLC en raison de pressions plus élevées qui permettent des débits plus rapides et donc des temps d’exécution plus courts. La résolution n’est pas sacrifiée avec UPLC, car les colonnes de taille de particules inférieures à 2 μm, les détecteurs à taux d’échantillonnage élevé et les injecteurs à faible volume sont capables de résister à des pressions très élevées et fonctionnent donc avec précision à des vitesses élevées17,18. Il en résulte la capacité d’analyser les volumes d’échantillons de l’ordre de 1 μl en dizaines de minutes, comparativement à 200 μl et heures pour hplc.
Les techniques complémentaires à l’UPLC comprennent l’analyse de masse muropeptide par spectrométrie de masse. UPLC n’est pas une technique destructrice; l’éluat de la colonne peut être collecté après détection UV et séché à l’aide d’un évaporateur centrifuge couramment disponible dans la plupart des laboratoires. Bien que l’échantillon puisse être dessalé pour le préparer à la spectrométrie de masse (étape 4.5), la désorption/ionisation laser assistée par matrice - Spectrométrie de masse à temps de vol permet une analyse sans grande sensibilité à la concentration en sel19,et donne des données de masse capables d’identifier définitivement les muropeptides. Le coût de préparation d’un échantillon de paroi cellulaire pour UPLC est d’environ 6-7 $, y compris les coûts des enzymes, des produits chimiques et des fournitures utilisées. Compte tenu de ses coûts de fonctionnement peu coûteux, de son accessibilité et de son utilité démontrée pour les études de la paroi cellulaire bactérienne, l’UPLC devrait devenir la méthode de choix pour une quantification précise, à haute résolution et à haut débit de la composition du peptidoglycane dans tout le règne bactérien.
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Disclosures
Les coûts de production de cet article ont été commandités par Waters Corporation.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le prix du nouvel innovateur du directeur des NIH DP2OD006466 (à K.C.H.). Les auteurs remercient Russell Monds pour une démonstration pratique de la méthode et pour les discussions scientifiques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler |
References
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