Isolierung und Vorbereitung von bakteriellen Zellwänden für die Kompositionsanalyse durch Ultra Performance Liquid Chromatographie

Die bakterielle Zellwand besteht aus Peptidoglycan, einem makromolekularen Netzwerk von Zuckersträngen, die durch Peptide vernetzt sind. Ultra Performance Liquid Chromatography bietet eine hohe Auflösung und Durchsatz für neuartige Entdeckungen der Peptidoglykan-Zusammensetzung. Wir präsentieren ein Verfahren zur Isolierung von Zellwänden (Sacculi) und deren anschließender Vorbereitung auf die Analyse über UPLC.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, bakterielle Zellwände zu isolieren und zu verdauen, um die Identitäten und relativen Anteile verschiedener Neuropeptide zu bestimmen. Bei der UPLC-Analyse wird dies erreicht, indem Bakterienproben zunächst durch Einkochen von Natrium-Ecolsulfat lysiert werden. Nach dem Auswaschen von SDS besteht der zweite Schritt darin, Proben mit Pronase E zu verdauen, um die äußere Membran gramnegativer Bakterien zu reinigen.

Anschließend werden die Proben mit Mease verdaut, um das Peptidoglykan in einzelne Neuropeptide zu lösen. Der letzte Schritt besteht darin, die Neuropeptide zu reduzieren und den pH-Wert an den isoelektrischen Punkt des Neuropeptids anzupassen. Letztendlich wird UPLC verwendet, um Neuropeptide nach Größe und Hydrophobizität zu trennen und so die Quantifizierung wichtiger Zellwandeigenschaften wie dem Grad der Vernetzung und der durchschnittlichen Glykanstranglänge zu erleichtern.

Diese Methode kann helfen, Antworten auf Schlüsselfragen im Bereich der Mikrobiologie zu finden, wie z.B. die Beziehungen zwischen Morphogenese, Zellwandarchitektur, Aktivierung des Immunsystems und Pathogenese. Obwohl diese Methode entwickelt wurde, um gramnegatives Peptidylglykan zu reinigen, kann sie auch auf grampositive Bakterien angewendet werden, wobei einige Enzyme und chemische Behandlungen hinzugefügt werden. Um die Bakterienkulturen wieder wachsen zu lassen, verdünnen Sie die Übernachtkulturen eins bis 100 in 250 Milliliter frisches Medium und wachsen Sie auf die gewünschte optische Dichte bei 600 Nanometern, während verdünnte Kulturen wachsen. Stellen Sie ein kochendes Wasserbad auf einer heißen Platte in einem Ein-Liter-Becher auf.

Sobald das Wasser kocht, aliquotieren Sie sechs Milliliter 6%iges Natrium-Dylsulfat oder SDS in 50-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen. Füge ein kleines Rührstäbchen zu jeder Tube hinzu und ziehe die Tubendeckel mit den Fingern fest an. Legen Sie die Röhren in das kochende Wasserbad und rühren Sie mit 500 U/min auf der Heizplatte.

Ernten Sie die 250-Milliliter-Kulturen, indem Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 5.000 G schleudern. Resuspendieren Sie die Pellets in drei Millilitern Medium oder einer x phosphatgepufferten Kochsalzlösung. Pipettieren Sie die Zellsuspensionen langsam in die 50-Milliliter-Röhrchen mit 6 % siedendem SDS, um die Zellen zu läusieren, während die Röhrchen in das kochende Wasserbad getaucht werden, und schließen Sie die Deckel wieder, um sie fingerfest zu halten.

Decken Sie das kochende Wasserbad ab und lassen Sie die Zellen drei Stunden lang kochen, wobei Sie den Wasserstand regelmäßig überprüfen und das Wasserbad bei Bedarf nachfüllen. Schalten Sie nach drei Stunden die Hitze auf der Herdplatte aus und rühren Sie über Nacht bei 500 U/min weiter. Wenn sich über Nacht SDS in den 50-Milliliter-Röhrchen abgesetzt hat, stellen Sie das Wasserbad für weitere ein bis zwei Stunden zum Kochen.

Hier wird gezeigt, wie eine normale Kultur nach der Lyse über Nacht aussehen sollte. Beachten Sie in SDS die Transparenz im Gegensatz zur Undurchsichtigkeit, die mit Niederschlag korreliert. Bereiten Sie den Puffer für Bauchlage E vor und aktivieren Sie E bei 60 Grad Celsius in einem Heizblock für mindestens 30 Minuten.

Verwenden Sie eine Ultrazentrifuge, die auf das 400.000-fache G eingestellt ist, um Proben 20 Minuten lang bei Raumtemperatur zu schleudern, um die großen Peptolglykan- oder PG-Makromoleküle zu pelletieren und sie dadurch von anderen zellulären Bestandteilen zu reinigen. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und suspendieren Sie dann jedes Pellet bei Raumtemperatur. Das Volumen der Reinstwasser-Reanimationssuspension hängt vom Volumen der verwendeten Ultrazentrifugenröhrchen ab.

Verwenden Sie ein Volumen, das die Röhrchen mindestens zur Hälfte ausfüllt, aber das maximale Volumen der Röhrchen nicht überschreitet. Wiederholen Sie das Zentrifugieren und Waschen, bis das Wasser während der Resus-Suspension keine Blasen mehr bildet, was darauf hinweist, dass das Sicherheitsdatenblatt zu diesem Zeitpunkt vollständig entfernt wurde. Die Proben werden bei der Reanimation in 900 Mikrolitern Tris-HCL-Puffer suspendiert und in zwei Milliliterröhrchen überführt, die zuvor mit Löchern in den Oberseiten gestochen wurden.

Geben Sie mit einer kleinen Nadel 100 Mikroliter aktivierte Pronase E in jede Probe, bevor Sie sie zwei Stunden lang bei 60 Grad Celsius inkubieren. Stoppen Sie die anfällige Verdauungsstörung, indem Sie jeder Probe 200 Mikroliter 6 % SDS hinzufügen und die Proben 30 Minuten lang im 100 Grad Celsius heißen Block kochen. Verwenden Sie wie zuvor eine Ultrazentrifuge, die auf 400.000 G eingestellt ist, um die Proben 20 Minuten lang bei Raumtemperatur zu schleudern und mit Reinstwasser bei Raumtemperatur zu waschen, bis das SDS beim letzten Zentrifugationswaschschritt vollständig entfernt ist.

Dieses Volumen kann entsprechend der Menge an Peptoglykan in der Probe angepasst werden und kann speziesabhängig sein. Wenn die Probe mehr Pepglykan enthält, erhöhen Sie das Suspensionsvolumen. Wenn die Probe wenig Peptidglykan enthält.

Reduzieren Sie das Volumen der Reanimationssuspension auf ein Minimum von 50 Mikrolitern. Übertragen Sie die Proben in 1,5-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie ein Milligramm pro Milliliter hinzu, um eine Endkonzentration von 40 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Inkubieren Sie sechs bis acht Stunden oder über Nacht in einem 37 Grad Celsius warmen Heizblock.

Um Proben für UPLC vorzubereiten, schalten Sie einen Heizblock auf 100 Grad Celsius ein. Kochen Sie die Proben ohne SDS fünf Minuten lang, um die Proben der Aufschlusszentrifuge 10 Minuten lang bei 16.000 Mal zu stoppen. G bei Raumtemperatur.

Die Neuropeptide befinden sich nun im Überstand. Den Überstand auf 13 x 100 Millimeter große Glasröhrchen übertragen. Versuchen Sie, so viel Überstand wie möglich zurückzugewinnen und so nah an den Gaumen heranzukommen, ohne ihn zu stören.

Passen Sie den pH-Wert an, indem Sie der Probe 500 Millimolar Boratpuffer zusetzen, um eine Endkonzentration von 100 Millimolar Boratpuffer zu erreichen. Der Puffer mit Bohrung acht ist mit dem Reduktionsmittel kompatibel. Natriumborhydrid: Fügen Sie mehrere Körner Natriumborhydrid hinzu, um jede Probe zu reduzieren, und lassen Sie die Reaktion mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ablaufen. Stellen Sie als Nächstes die Proben auf einen pH-Wert von sechs ein, der mit pH-Indikatorpapier mit Ortho-Phosphorsäure in 20-Mikroliter-Schritten gemessen wurde, die Probe sollte als Reaktion auf die Zugabe von Ortho-Phosphorsäure blasen.

Die Probe hört in der Regel auf zu sprudeln, wenn ein pH-Wert von sechs erreicht ist. Stellen Sie dann die Proben mit ortho-Phosphorsäure in Schritten von zwei Mikrolitern auf einen pH-Wert zwischen drei und vier ein. Filtrieren Sie die Probe durch eine 0,22-Mikron-Spritze.

Direkt in das A-U-P-L-C-Fläschchen filtrieren. Wenn sich in den Proben nach dem Übergang in die UPLC-Fläschchen ein Niederschlag gebildet hat, erhitzen Sie die Fläschchen in mehreren Durchgängen durch eine Flamme. Setzen Sie das UPLC-Fläschchen in den Autosampler ein und injizieren Sie 10 Mikroliter jeder Probe in das A-U-P-L-C-Gerät.

Ausgestattet mit einer C 18-Umkehrphasen-UPLC-Säule und einem Absorptionsdetektor zur Überwachung von 202 bis 208 Nanometern werden nacheinander Proben injiziert. Stellen Sie den Durchfluss auf 0,25 Milliliter pro Minute ein und verwenden Sie einen linearen Gradienten über 25 Minuten, um innerhalb von 30 Minuten 100 % Lösungsmittel B und sequenzielles E von Neuropeptiden zu erreichen.

Wenn Massenspektrometrie zur Charakterisierung von Neuropeptiden nach UPLC verwendet wird, sammeln Sie Fraktionen des interessierenden Peaks in einem Fraktionssammler, übertragen Sie die Fraktionen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und trocknen Sie die Fraktionen dann mit einem Zentrifugalverdampfer, müssen die Fraktionen vor der MS-Analyse entsalzt werden. In diesem typischen UPLC-Ergebnis. Die Detektion über die UV-Absorption bei 202 bis 208 Nanometern in Abhängigkeit von der Zeit legt eine bestimmte Retentionszeit der Neuropeptide fest.

Es wird eine klare Auflösung zwischen den meisten Neuropeptidspezies und eine starke Signalstärke über das gesamte Spektrum beobachtet, was die Analyse des Grades der Vernetzung der durchschnittlichen Glykanstranglänge und der Identität von Neuropeptiden und deren Konzentrationen ermöglicht. Ein Beispiel für ein Chromatogramm, das die C-Ausfällung von Neuropeptiden widerspiegelt, ist hier dargestellt. Es wurden keine Peaks angegeben, so dass keine Daten über die PG-Zusammensetzung vorliegen.

Das Fehlen erkennbarer Peaks bei der UPLC-Analyse kann als Folge einer Überkonzentration der Probe oder einer falschen Einstellung des pH-Werts auf weit unter dem isoelektrischen Punkt der Neuropeptide auftreten. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Tagen durchgeführt werden, wenn auch in hektischen Tagen, die nach diesem Verfahren ordnungsgemäß ausgeführt werden. Andere Methoden wie die Massenspektrometrie können verwendet werden, um Neuropeptidspezies anhand der Masse nach ihrer Entwicklung positiv zu identifizieren.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Mikrobiologie den Weg, um die biochemische Funktion wichtiger Zellwandenzyme und die Wirkungsweise chemischer Inhibitoren in einer Vielzahl von Spezies und Mutanten zu erforschen.