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Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

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DOI:

10.3791/51195

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21. August 2014

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1Stem Cell Research Center, Department of Bioengineering and Orthopedic Surgery, University of Pittsburgh, 2Department of Orthopedic Surgery, University of Pittsburgh, 3Nazarbayev University Research and Innovation System, Nazarbayev University, 4Department of Orthopaedic Surgery, UCLA Orthopaedic Hospital and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California at Los Angeles, 5Department of Cell Biology, Erasmus MC Stem Cell Institute, 6OHSU Center for Regenerative Medicine, Oregon Health & Science University, 7Centre for Cardiovascular Science and MRC Centre for Regenerative Medicine, Queen's Medical Research Institute and University of Edinburgh, 8David Geffen School of Medicine and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California at Los Angeles, 9Stem Cell Research Center, Department of Orthopedic Surgery and McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Blutgefäße innerhalb der menschlichen Skelettmuskulatur Hafen mehrere Multi-Linie Vorläuferpopulationen, die sich ideal für die regenerative Anwendungen sind. Dieses Isolierungsverfahren ermöglicht die gleichzeitige Reinigung von drei multiVorläuferZellPopulationen jeweils drei Strukturschichten der Blutgefäße: myogenen Endothelzellen aus Intima, Perizyten von Medien und Adventitia-Zellen von Adventitia.

Zusammenfassung

Seit der Entdeckung von mesenchymalen Stammzellen / Stromazellen (MSCs), haben die einheimische Identität und Lokalisation von MSCs durch ihre Retrospektive Isolation in Kultur verdeckt worden. Kürzlich wurde unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS), haben wir und andere Forscher prospektiv identifiziert und gereinigt drei Subpopulationen von multipotenten Vorläuferzellen mit dem Gefäßsystem des menschlichen Skelettmuskel verbunden. Diese drei Zellpopulationen: Intima, Media und Adventitia: myogenen Endothelzellen (MEC), Perizyten (PCs) und Adventitia-Zellen (ACS), sind jeweils mit den drei Strukturschichten von Blutgefäßen lokalisiert. Alle diese menschliche Blutgefäßstammzellen (hBVSC) Populationen nicht nur klassische MSC Marker auszudrücken, sondern auch Entwicklungspotenziale mesodermalen ähnlich typischen MSCs besitzen. Bisher haben MEC, PCs und ACs durch verschiedene Protokolle isoliert und anschließend in separaten Studien aus. Die aktuelle Isolations ProtOcol, durch Änderungen an der Isolierungsverfahren und Anpassungen in den selektiven Zelloberflächenmarker, ermöglicht es uns, gleichzeitig reinigen alle drei Subpopulationen hBVSC durch FACS aus einer menschlichen Muskelbiopsie. Dieses neue Verfahren wird nicht nur rationalisieren die Isolierung von mehreren BVSC Subpopulationen sondern erleichtern auch die zukünftige klinische Anwendungen der hBVSCs für verschiedene therapeutische Zwecke.

Einleitung

Menschlichen Skelettmuskel wurde als klinisch attraktive Quelle für Stammzellen / Vorläuferzellen. Skelettmuskulatur enthält nicht nur verpflichtet myogenen Vorläuferzellen, Skelett-Myoblasten, aber auch primitive myogenen Stammzellen, einschließlich Satellitenzellen und Muskelstammzellen (MDSCs) 1. Die Verwendung von menschlichen Muskel-abgeleitete Stammzellen / Vorläuferzellen, autologen oder allogenen, in der regenerativen Medizin ist weitgehend in präklinischen Tiermodellen und klinischen Studien untersucht. Die regenerative Anwendungen von Muskelstammzellen / Vorläuferzellen reichen von Regeneration des dystrophischen Muskel in Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) Patienten auf die Reparatur des verletzten Herzens bei Patienten mit Herzinfarkt.

Seit der Entdeckung von mesenchymalen Stammzellen / Stromazellen (MSCs) und anderen multiVorläuferZellPopulationen, einschließlich Knochenmark stammenden multipotente adulte Vorläuferzellen (MAPCs) und Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ADSCs), adulte Stammzellen /Vorläuferzellen sind umfassend auf den neuesten Stand 1-9 untersucht. Dennoch haben ihre Mutter Identität und Lokalisation in situ durch die Retrospektive Isolationsverfahren verdunkelt. Kürzlich wurde unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS), haben wir und andere Gruppen haben prospektiv identifiziert und gereinigt drei multiVorläuferZellPopulationen aus den Blutgefäßen im menschlichen Skelettmuskel und verschiedene andere Organe: myogenen Endothelzellen (MEC), Perizyten (PCs), und Adventitia-Zellen (ACS) 10. Intima, Tunica media und Adventitia: Diese drei Subpopulationen von menschlichen Blutgefäßstammzellen (hBVSCs) jeweils in den drei Strukturschichten der Blutgefäße gefunden werden. Genauer gesagt, MEC und PCs sind in Mikrogefäßen und Kapillaren nachgewiesen während ACS sind in der Adventitia Schicht von größeren Arterien und Venen lokalisiert. Jeder Vorläuferzellenteilsatz drückt eine einzigartige Kombination von Zelloberflächenantigenen: MEC (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), PC (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -), und ACS (CD34 + / 31 - / 45 - / 56 - / 146 -).

Weitere Charakterisierung dieser hBVSC Untergruppen zeigte, dass alle drei Vorläuferzellpopulationen besitzen mesodermalen Entwicklungspotentiale ähnlich typischen MSCs, einschließlich Skelett myogenesis, Osteogenesis, Chondrogenese und Adipogenese. Alle hBVSC Teilmengen weisen auch klassische MSC Marker, einschließlich CD44, CD73, CD90, CD105 und frisch und in der Kultur. Gemeinsam diese Beweisstücke unterstützte die vaskulären Ursprungs von MSCs. Darüber hinaus haben die therapeutischen Kapazitäten von MEC, PCs, und ACS kürzlich in verschiedenen Studien nachgewiesen. MEC aus erwachsenen menschlichen Muskelbiopsien sortiert wurden gezeigt, um verletzte und dystrophischen Skelettmuskeln und Reparatur verletzt Myokard effizienter als Skelettmyoblasten und Gefäß endo regenerierenthelial Zellen (ECs). Gereinigten PCs aus verschiedenen menschlichen Organen haben auch gezeigt, um zu reparieren / regenerieren verletzten und dystrophischen Skelettmuskulatur und zur Satelliten-Zellpool 13-16. Erst vor kurzem haben wir gezeigt, dass PCs aus menschlichen Skelettmuskel abgeleitet das Myokard durch indirekte und direkte parakrine Wirkung zellulären Interaktionen 17 effektiv zu reparieren. ACs, auf der anderen Seite, entweder direkt aus explantierten Blutgefäße oder durch FACS isoliert aus humanem Fettgewebe und Skelettmuskel gereinigt. Eine bemerkenswerte pro-angiogene Wirkung von ACS wurde in einem Maus-Hinter Extremitäten-Ischämie-Modell 19 demonstriert. Weiterhin haben ACs auch gezeigt, Myokard effizienter als herkömmliche MSCs reparieren, was die stabile therapeutische Potenzial von ACS in ischämischen Gewebereparatur 20.

Die aktuellen Reinigungsprotokoll Zuschüsse gleichzeitige, Interessenten Reinigung von MEC, PCs undACs aus dem Gefäßsystem eines einzelnen menschlichen Skelettmuskelbiopsie. Dies ermöglicht es uns, zu studieren und / oder wählen Sie die optimale hBVSC Subpopulation für verschiedene therapeutische Zwecke. Darüber hinaus bietet diese neue Technik erweitert das Repertoire von Stammzellen / Vorläuferzellen, die aus menschlichem Skelettmuskel abgeleitet werden kann, so dass es eine ideale Quelle für multipotente Vorläuferzellen für die regenerative Medizin.

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Protokoll

1. Muskelbiopsie Verarbeitung

  1. Erhaltung menschlichen Skelettmuskelbiopsie auf Eis in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt und 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) während des Transports.
  2. Nach dem Erhalt der Muskelbiopsie, entfernen Sie die Probe aus dem Transportbehälter und waschen Sie es zweimal in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 2% Antibiotikum-Antimykotikum-Lösung (A / A) unter sterilen Bedingungen zu ergänzen.
  3. Entfernen Sie den beigefügten Fettgewebe und Bindegewebe mit steriler Schere und Pinzette in DMEM mit 2% A / A ergänzt.
  4. Entfernen Sie den großen Blutgefäße unter Dissektionsmikroskop und anschließend schneiden die Muskelprobe in kleine Stücke (<1 cm 2 groß).
  5. Wahren Schnittmuskelstücke (<5 g) in 20 ml Erhaltungsmedium (PM, DMEM, ergänzt mit 10% FBS und 1% P / S) bei 4 ℃ für bis zu 5 Tage.

2. Muskel DissociatIonen-und Zellisolation

  1. Am Tag der Zellisolation entfernen Muskelstücke aus PM und wasche zweimal in PBS, ergänzt mit 2% P / S. Um die Aufschlusslösung zu machen, fügen Typ-I, Typ-II-und Typ-IV Kollagenasen (100 mg / ml) frisch in Uhr.
  2. Fein hacken und Muskelstücke mit steriler Schere und Pinzette mechanisch Hackfleisch in einer Petrischale mit einer kleinen Menge von PM, bis die Lösung durchläuft 10 ml serologische Pipette ohne Blutgerinnung. Entfernen der Rest Fettgewebe und Bindegewebe während dieses Prozesses. Verwenden Sie mindestens 8-10 Gramm erwachsenen Muskel-oder 2 Gramm fetalen Muskel für jede Zelle Isolation.
  3. Übertragen 4-5 Gramm Hackfleisch erwachsenen Muskel zu 20 ml (oder 2 Gramm Hackfleisch fötalen Muskel in 10 ml) OFTHE Aufschlusslösung mit 10 ml serologische Pipette. Verdauen für 50-60 min bei 37 ℃ auf einem Orbitalschüttler bei 70 bis 80 Umdrehungen pro Minute. Optimierung der Zellausbeute und Oberflächenantigen Konservierung durch Einstellen der Kochzeit und / oder Bewegungsgeschwindigkeit entsprechend der Menge basierendGewebe. Beachten Sie die Verdauung Status alle 15-20 min, bis die Trübung fast löscht.
  4. Kräftig pipettieren Die verdaute Gewebe 3-5 mal mit einer 10 ml serologische Pipette. Hinzufügen gleiche Menge PM um die Reaktion abzubrechen, und dann bei 400 × g zentrifugieren für 4 min.
  5. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand; das Pellet mit 10 ml PM zu waschen, und dann durch ein 100 um Sieb filtriert Zelle.
  6. Zentrifuge bei 400 g für 4 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Resuspendieren Pellets in Erythrozyten Lysepuffer (155 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mm EDTA), filtriert durch ein 70 um Sieb Zelle um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, und dann für 10 min bei RT inkubiert. Filtriert durch ein 70-m Zelle Sieb wieder, wenn eine Fällung beobachtet.
  7. Zentrifuge bei 400 × g für 4 min und Resuspendieren des Zellpellets in 0,5 ml PBS. Die Anzahl der Zellen. Abrufen einer Gesamtmenge von mindestens 5 Millionen Zellen für die Zellsortierung. Verdünnen Sie die einze Zellsuspension auf weniger als 5 Millionen Zellen pro ml mit PBS-Färbung. Nehmen Sie 50-100 ul der Zellsuspension und aufgeteilt in 11 Rohre für Steuer Färbungen (ungefärbten Kontrolle, Negativkontrollen und einfarbige positive Kontrollen).

3. Zellmarkierung und Sortieren

  1. Inkubieren der Einzelzellsuspension für 10 min bei 4 ℃ in Mausserum (verdünnt 1:10 in PBS) zur Blockierung Zweck, falls erforderlich.
  2. Fügen CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, und CD146-FITC (alle 1: 100) in den Einzelzellsuspension und Inkubation für 20 min bei 4 ℃. Für negative Kontrolle, fügen äquivalenten Konzentrationen von APC-APC-Cy7-, PE-Cy7-, PE-und FITC-konjugierten Isotyp IgG-Antikörper und Inkubation für 20 min bei 4 ℃. Für einfarbige positive Kontrollen, fügen äquivalenten Konzentrationen von CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, und CD146-FITC individuell in jedes Röhrchen und Inkubation für 20 min bei 4 ℃.
  3. Nach Inkubation, Zentrifuge bei 400 g für 4 min zu waschen. Zellpellet in werden 1 - 2 ml DMEM mit 5% FBS und 1% P / S ergänzt. Die Endkonzentration der Zellsuspension sollte weniger als 5 Millionen Zellen pro ml sein. Hinzufügen 7-AAD (1: 100) und die Proben für 15 min bei RT tote Zelle Ausgrenzung. Für Negativkontrolle und Single-Farbpositivkontrollen, resuspendieren Zellpellets in 0,5 ml DMEM mit 5% FBS und 1% P / S ergänzt.
  4. Übertragen Sie alle Zellsuspensionen auf Polystyrol-Rundröhrchen für die Durchflusszytometrie. Bereiten Zellröhrchen (jedes Rohr ist vorgefüllt mit 500 ul der geeigneten Kulturmedium: MPM für MEC; EGM-2 für PC, AC-Medium für ACS). Transportzellsuspensionen auf Eis auf die Zellsortierer.
  5. Führen Zellsuspensionen auf der Zellsortierer in der Reihenfolge der ungefärbten Kontrolle, Negativkontrollen, einfarbig Positivkontrollen, und der Hauptzellsuspension während der Anpassung der Laserintensität, Kanalkompensation und Zellpopulation Gating stringent zu Zelle p maximierenurity (siehe Artikel beim Zeus und andere Fachzeitschriften für Details der Durchflusszytometrie veröffentlicht wurde).
  6. Sammeln gewünschten Zellpopulationen in den entsprechenden Sammelröhrchen. Shop gesammelten Zellen bei 4 ℃, wenn nicht sofort der Aussaat.

4. Post-Sortierzellkultur

  1. Saatgut frisch sortiert MEC (P0) auf <10.000 Zellen / cm 2 in MPM auf Platten mit vorge beschichtet Typ-I-Kollagen. Für die anschließende Passage von MEC, Saatgut 3500 - 4000 Zellen / cm 2 in MPM auf Platten / Flaschen mit Pre-beschichtet Typ-I-Kollagen.
  2. Saatgut neu geordnet PCs (P0) in <20.000 Zellen / cm 2 in EGM-2 auf Platten mit frisch 0,2% Gelatine beschichtet. 3-Verhältnis im PC-Medium (DMEM mit 20% FBS und 1% P / S ergänzt) auf regelmäßige Polystyrol-Kulturplatten bis P2: Für die anschließende Passage von PCs, bei 1 aufgeteilt Zellen. Von P3 Weiter, Samenzellen bei 6.500 - 7.000 Zellen / cm 2 in PC Medium auf regelmäßige Polystyrol-Kulturplatten / Kolben.
  3. Saatgut neu geordnet ACs (P0) in <20.000 Zellen / cm 2 in AC-Medium (DMEM mit 20% FBS und 1% P / S ergänzt) auf regelmäßige Polystyrol-Kulturplatten. Für die anschließende Passage von ACS, Samenzellen bei 6.500 - 7.000 Zellen / cm 2 in AC-Medium auf regelmäßige Polystyrol-Kulturplatten / Kolben.

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Ergebnisse

FACS-Parameter werden zunächst auf der Grundlage der von den nicht markierten Kontrolle, Negativkontrollen und Single-Farbpositivkontrollen gewonnenen Daten korrigiert. Nach Ausschluß von toten Zellen wird die Fluoreszenz-markierte Zellsuspension auf eine Reihe von negativen und positiven Zelloberflächenmarker Auswahl unterworfen. Zuerst werden die CD45 +-Zellen vor CD56 + und CD56 gated - Zellen aus CD45 getrennt - Fraktion. Die CD56 +-Fraktion wird weiter auf CD34...

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Diskussion

Identifizierung und Reinigung von hBVSC Subpopulationen stellen einen wesentlichen Fortschritt in das Verständnis der MSC Ontogenese. Es gibt zunehmend Hinweise, die den Ursprung der perivaskulären MSCs und die Verbindung zwischen Gewebe-spezifischen Vorläuferzellen und Blutgefäße 22-25. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, homogene Subpopulationen von hBVSCs weiter hilft dem Verständnis der MSC Heterogenität und Vaskuläre Zellbiologie 26 zu isolieren.

In den vergangenen J...

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Offenlegungen

J.H. erhielt von Cook MyoSite, Inc. eine Vergütung für Beratungsdienstleistungen und für Lizenzgebühren, die er während des Zeitraums, in dem die oben genannten Forschungsarbeiten durchgeführt wurden, aus der Lizenzierung von Technologien erhalten wurde. Alle anderen Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren möchten sich Alison Logar für ihre hervorragende technische Unterstützung bei der Durchflusszytometrie bedanken. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Department of Defense (JH), der Henry J. Mankin Stiftungslehrstuhl (JH) und des Ministeriums für Bildung und Wissenschaft der Republik Kasachstan (AS) unterstützt. CWC wurde zum Teil von der American Heart Association Promotionsstipendium (11PRE7490001) unterstützt. M.Corselli wurde von der California Institute for Regenerative Medicine Ausbildungsförderung (TG2-01169) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Kollagenase Typ 1SigmaC5894Steriles Fläschchen
Kollagenase Typ 2SigmaC1764Steriles Fläschchen
Kollagenase Typ 4SigmaC1889Steriles Fläschchen
Anti-human CD34 APCBD Pharmingen555824Steril halten
Anti-Human-CD45 APC-Cy7BD Pharmingen557833halten
Anti-Human-CD56 PE-Cy7BD Pharmingen 557747Steril halten
Anti-Human-CD144 PEBeckman CoulterA07481Steril halten
Anti-Human-CD146 FITCAbD SerotecMCA2141FSteril halten
FACS Aria II DurchflusszytometerBecton-Dickinson
EGM-2 Komplettes MediumLonzaCC-3162Für die Kultivierung von PCs (nur P0)
DMEM high glucose (1X), flüssig, mit L-Glutamin, ohne NatriumpyruvatInvitrogen11965Zur Kultivierung von PCs
DMEM high glucose (1X), flüssig, mit L-Glutamin, mit NatriumpyruvatInvitrogen11995Zur Kultivierung von MECs und ACs
Fötales RinderserumInvitrogen10437-028
Hitzeinaktiviertes PferdeserumInvitrogen26050-088
Penicillin/StreptomycinInvitrogen15140-122
Antibiotikum-Antimykotikum (100X)Invitrogen15240-062
Trypsin-EDTA 0,5% (10X)Invitrogen15400-054
Dulbecco' s PBS ohne Calcium und MagnesiumInvitrogen14190-250
Kükenembryo-ExtraktGenaue ChemikalieCE650T-10Filter vor Gebrauch
steril

Referenzen

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