Blutgefäße innerhalb der menschlichen Skelettmuskulatur Hafen mehrere Multi-Linie Vorläuferpopulationen, die sich ideal für die regenerative Anwendungen sind. Dieses Isolierungsverfahren ermöglicht die gleichzeitige Reinigung von drei multiVorläuferZellPopulationen jeweils drei Strukturschichten der Blutgefäße: myogenen Endothelzellen aus Intima, Perizyten von Medien und Adventitia-Zellen von Adventitia.
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Methodenartikel
Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Seit der Entdeckung von mesenchymalen Stammzellen / Stromazellen (MSCs), haben die einheimische Identität und Lokalisation von MSCs durch ihre Retrospektive Isolation in Kultur verdeckt worden. Kürzlich wurde unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS), haben wir und andere Forscher prospektiv identifiziert und gereinigt drei Subpopulationen von multipotenten Vorläuferzellen mit dem Gefäßsystem des menschlichen Skelettmuskel verbunden. Diese drei Zellpopulationen: Intima, Media und Adventitia: myogenen Endothelzellen (MEC), Perizyten (PCs) und Adventitia-Zellen (ACS), sind jeweils mit den drei Strukturschichten von Blutgefäßen lokalisiert. Alle diese menschliche Blutgefäßstammzellen (hBVSC) Populationen nicht nur klassische MSC Marker auszudrücken, sondern auch Entwicklungspotenziale mesodermalen ähnlich typischen MSCs besitzen. Bisher haben MEC, PCs und ACs durch verschiedene Protokolle isoliert und anschließend in separaten Studien aus. Die aktuelle Isolations ProtOcol, durch Änderungen an der Isolierungsverfahren und Anpassungen in den selektiven Zelloberflächenmarker, ermöglicht es uns, gleichzeitig reinigen alle drei Subpopulationen hBVSC durch FACS aus einer menschlichen Muskelbiopsie. Dieses neue Verfahren wird nicht nur rationalisieren die Isolierung von mehreren BVSC Subpopulationen sondern erleichtern auch die zukünftige klinische Anwendungen der hBVSCs für verschiedene therapeutische Zwecke.
Einleitung
Menschlichen Skelettmuskel wurde als klinisch attraktive Quelle für Stammzellen / Vorläuferzellen. Skelettmuskulatur enthält nicht nur verpflichtet myogenen Vorläuferzellen, Skelett-Myoblasten, aber auch primitive myogenen Stammzellen, einschließlich Satellitenzellen und Muskelstammzellen (MDSCs) 1. Die Verwendung von menschlichen Muskel-abgeleitete Stammzellen / Vorläuferzellen, autologen oder allogenen, in der regenerativen Medizin ist weitgehend in präklinischen Tiermodellen und klinischen Studien untersucht. Die regenerative Anwendungen von Muskelstammzellen / Vorläuferzellen reichen von Regeneration des dystrophischen Muskel in Duchenne-Muskeldystroph....
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Protokoll
1. Muskelbiopsie Verarbeitung
- Erhaltung menschlichen Skelettmuskelbiopsie auf Eis in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt und 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) während des Transports.
- Nach dem Erhalt der Muskelbiopsie, entfernen Sie die Probe aus dem Transportbehälter und waschen Sie es zweimal in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 2% Antibiotikum-Antimykotikum-Lösung (A / A) unter sterilen Bedingungen zu ergänzen.
- Entfernen Sie den beigefügten Fettgewebe und Bindegewebe mit steriler Schere und Pinzette in DMEM mit 2% A / A ergänzt.
- Entfernen Sie den großen Blutgefäße u....
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Ergebnisse
FACS-Parameter werden zunächst auf der Grundlage der von den nicht markierten Kontrolle, Negativkontrollen und Single-Farbpositivkontrollen gewonnenen Daten korrigiert. Nach Ausschluß von toten Zellen wird die Fluoreszenz-markierte Zellsuspension auf eine Reihe von negativen und positiven Zelloberflächenmarker Auswahl unterworfen. Zuerst werden die CD45 +-Zellen vor CD56 + und CD56 gated - Zellen aus CD45 getrennt - Fraktion. Die CD56 +-Fraktion wird weiter auf CD34.......
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Diskussion
Identifizierung und Reinigung von hBVSC Subpopulationen stellen einen wesentlichen Fortschritt in das Verständnis der MSC Ontogenese. Es gibt zunehmend Hinweise, die den Ursprung der perivaskulären MSCs und die Verbindung zwischen Gewebe-spezifischen Vorläuferzellen und Blutgefäße 22-25. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, homogene Subpopulationen von hBVSCs weiter hilft dem Verständnis der MSC Heterogenität und Vaskuläre Zellbiologie 26 zu isolieren.
In den vergangenen J.......
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Offenlegungen
J.H. erhielt von Cook MyoSite, Inc. eine Vergütung für Beratungsdienstleistungen und für Lizenzgebühren, die er während des Zeitraums, in dem die oben genannten Forschungsarbeiten durchgeführt wurden, aus der Lizenzierung von Technologien erhalten wurde. Alle anderen Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.
Danksagungen
Die Autoren möchten sich Alison Logar für ihre hervorragende technische Unterstützung bei der Durchflusszytometrie bedanken. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Department of Defense (JH), der Henry J. Mankin Stiftungslehrstuhl (JH) und des Ministeriums für Bildung und Wissenschaft der Republik Kasachstan (AS) unterstützt. CWC wurde zum Teil von der American Heart Association Promotionsstipendium (11PRE7490001) unterstützt. M.Corselli wurde von der California Institute for Regenerative Medicine Ausbildungsförderung (TG2-01169) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Kollagenase Typ 1 | Sigma | C5894 | Steriles Fläschchen |
| Kollagenase Typ 2 | Sigma | C1764 | Steriles Fläschchen |
| Kollagenase Typ 4 | Sigma | C1889 | Steriles Fläschchen |
| Anti-human CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Steril halten |
| Anti-Human-CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | halten |
| Anti-Human-CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Steril halten |
| Anti-Human-CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Steril halten |
| Anti-Human-CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Steril halten |
| FACS Aria II Durchflusszytometer | Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 Komplettes Medium | Lonza | CC-3162 | Für die Kultivierung von PCs (nur P0) |
| DMEM high glucose (1X), flüssig, mit L-Glutamin, ohne Natriumpyruvat | Invitrogen | 11965 | Zur Kultivierung von PCs |
| DMEM high glucose (1X), flüssig, mit L-Glutamin, mit Natriumpyruvat | Invitrogen | 11995 | Zur Kultivierung von MECs und ACs |
| Fötales Rinderserum | Invitrogen | 10437-028 | |
| Hitzeinaktiviertes Pferdeserum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotikum-Antimykotikum (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA 0,5% (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco' s PBS ohne Calcium und Magnesium | Invitrogen | 14190-250 | |
| Kükenembryo-Extrakt | Genaue Chemikalie | CE650T-10 | Filter vor Gebrauch |
Referenzen
- Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat C....
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Nachdrucke und Genehmigungen
