Method Article

Charakterisierung komplexer Systeme Mit dem Design of Experiments Ansatz: Transient Protein Expression in Tabak als Case Study

DOI:

10.3791/51216

⸱

January 31st, 2014

 , 
1Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 2Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, Fraunhofer Gesellschaft

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben eine Anordnung von Experimenten Ansatz, der verwendet werden kann, um festzustellen und das Modell des Einflusses der Transregulationselemente, Pflanzenwachstum und Entwicklung Parameter und Inkubationsbedingungen für die vorübergehende Expression von monoklonalen Antikörpern und Reporter-Proteine ​​in Pflanzen auf.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pflanzen bieten mehrere Vorteile für die Produktion von Biopharmazeutika mit niedrigen Kosten, Skalierbarkeit und Sicherheit. Die transiente Expression bietet den zusätzlichen Vorteil der kurzen Entwicklungs-und Produktionszeiten, sondern Expressionsniveaus erheblich zwischen den Chargen so was zu rechtlichen Bedenken im Rahmen der guten Herstellungspraxis variieren. Wir verwendeten eine Versuchsplanung (DOE) Ansatz, die Auswirkungen der wichtigsten Faktoren wie regulatorische Elemente in dem Expressionskonstrukt, das Pflanzenwachstum und Entwicklung Parametern und den Inkubationsbedingungen während der Expression, auf die Variabilität der Expression zwischen den Chargen zu bestimmen. Wir untersuchten Pflanzen ein Modell Anti-HIV-Antikörper (2G12) und einen fluoreszierenden Marker-Protein (DsRed) ausdrückt. Wir diskutieren die Gründe für die Auswahl bestimmter Eigenschaften des Modells zu identifizieren und ihr Potenzial Einschränkungen. Das allgemeine Konzept kann leicht auf andere Probleme übertragen werden, da die Prinzipien des Modells einwieder breit anwendbar: wissensbasierte Parameterauswahl, Komplexitätsreduktion durch Aufteilung der anfängliche Problem in kleinere Module, Software-geführte Installation der optimalen Experiment Kombinationen und schrittweise Design Augmentation. Daher ist die Methode nicht nur nützlich für die Charakterisierung der Proteinexpression in Pflanzen, sondern auch für die Untersuchung von anderen komplexen Systemen fehlt eine mechanistische Beschreibung. Die Vorhersagegleichungen zur Beschreibung der Interkonnektivität zwischen Parameter können verwendet werden, um mechanistische Modelle für andere komplexe Systeme aufgebaut werden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Produktion von biopharmazeutischen Proteinen in Pflanzen ist vorteilhaft, da Pflanzen kostengünstig zu wachsen, kann die Plattform sich nur durch den Anbau von Pflanzen mehr skaliert werden, und menschliche Krankheitserreger sind nicht in der Lage zu 1,2 replizieren. Transiente Expressionsstrategien zum Beispiel auf Basis der Infiltration von Blättern mit Agrobacterium tumefaciens bietet zusätzliche Vorteile, da die Zeit zwischen dem Punkt der DNA-Zufuhr und die Abgabe eines gereinigten Produktes von Jahren auf weniger als 2 Monate 3 reduziert. Transiente Expression ist auch für die funktionelle Analyse, z. B. verwendet wer....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Planen Sie eine DoE-Strategie

  1. Identifizieren relevanten Faktoren und Antworten für die Aufnahme in den Entwurf.
    1. Definieren Sie eine oder mehrere Antworten für die Messung. Hier wurden 2G12 und DsRed-Expressionsniveaus verwendet (ug / ml), einschließlich der minimalen nachweisbaren Unterschied als relevant (10 und 20 ug / ml) betrachtet und ein Näherungswert für die geschätzte Standardabweichung des Systems (4 und 8 ug / ml) auf der Grundlage früherer Experimente.
    2. Verwenden Sie die verfügbaren Literatur, Daten aus früheren Experimenten oder Fach Screening-Designs (z. B. einem faktoriellen Design finden Sie in der Einleitung), ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein Beschreibungsmodell für DsRed Akkumulation während transiente Expression mit verschiedenen Promotoren und 5'UTRs

DsRed-Fluoreszenz in Blattextrakten wurde verwendet, um das Expressionsniveau des rekombinanten Proteins zu zeigen und damit als Antwort auf das SVM-Strategie verwendet. Die minimale nachweisbare Differenz wir als relevant war 20 ug / ml und die geschätzte Standardabweichung des Systems war 8 ug / ml bezogen auf den anfänglichen Experimenten. Faktoren, die in .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedes Experiment erfordert eine sorgfältige Planung, da die Ressourcen sind oft knapp und teuer. Dies gilt insbesondere für DoE Strategien, weil Fehler in der Planungsphase (z. B. Auswahl eines Basismodell, die nicht alle wesentlichen Faktor Wechselwirkungen einschließen) im wesentlichen die Vorhersagekraft der resultierenden Modelle verringern und damit entwerten das gesamte Experiment. Allerdings können diese Fehler leicht durch folgenden grundlegenden Verfahren vermieden werden.

Übe.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Veröffentlichungsgebühr wurde teilweise von den Unternehmen Statease, Inc. (USA) und Statcon (Deutschland), die bei der Herstellung des Manuskripts oder für ihren Inhalt verantwortlich nicht in den beteiligten beteiligt waren gesponsert.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Herrn Dr. Thomas Rademacher für die Bereitstellung der pPAM Pflanzenexpressionsvektor und Ibrahim Al Amedi zur Kultivierung der Tabakpflanzen in dieser Studie verwendet. Wir möchten Dr. Richard M. Twyman für seine Unterstützung bei der Bearbeitung des Manuskripts danken. Diese Arbeit wurde zum Teil durch den European Research Council Advanced Grant "Future-Pharma" gefördert, Vorschlagsnummer 269110 und der Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer-Zukunftsstiftung).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Design-Experte(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.DoESoftware
TryptonCarl Roth GmbH8952.2Medienkomponente
HefeextraktCarl Roth GmbH2363.2Medienkomponente
NatriumchloridCarl Roth GmbHP029.2Medienkomponente
AmpicillinCarl Roth GmbHK029.2Antibiotikum
Agar-AgarCarl Roth GmbH5210.2Medienkomponente
Escherichia coli K12 DH5aLife Technologies18263-012Mikroorganismen
pPAMGenBankAY027531Klonierungs-/Expressionsvektor;  
NucleoSpin Plasmid MACHEREY-NAGEL GmbH740588.250Plasmid-DNA-Isolationskit
NucleoSpin Gel und PCR-AufreinigungMACHEREY-NAGEL GmbH740609.250Plasmid-DNA-Aufreinigungskit
NanoDrop 2000Thermo Scientificn.a.Spektralphotometer
NcoINew England Biolabs Inc.R3193LRestriktionsendonuklease
EcoRINew England Biolabs Inc.R3101LRestriktionsendonuklease
AscINew England Biolabs Inc.R0558LRestriktionsendonuklease
NEB 4New England Biolabs Inc.B7004SRestriktionendonuklease-Puffer
TRISCarl Roth GmbH4855.3Medienkomponente
DinatriumtetraboratCarl Roth GmbH4403.3Medienkomponente
EDTACarl Roth GmbH8040.2Medienkomponente
AgaroseCarl Roth GmbH6352.4Medienkomponente
BromphenolblauCarl Roth GmbHA512.1Farbindikator
XylolcyanolCarl Roth GmbHA513.1Farbindikator
GlycerinCarl Roth GmbH7530.2Medienkomponente
Mini-Sub Cell GT CellBioRad170-4406Gelelektrophoresekammer
Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101:pMP90RKDSMZ12365Mikroorganismen
Elektroporator 2510Eppendorf4307000.658Elektroporator
RinderextraktCarl Roth GmbHX975.2Medienkomponente
PeptonCarl Roth GmbH2365.2Medienkomponente
SaccharoseCarl Roth GmbH4621.2Medienkomponente
MagnesiumsulfatCarl Roth GmbH0261.3Medienkomponente
CarbenicillinCarl Roth GmbH6344.2Antibiotikum
KanamycinCarl Roth GmbHT832.3Antibiotikum
RifampicinCarl Roth GmbH4163.2Antibiotikum
FWD PrimerEurofins MWG Operonn.a.CCTCAG GAA GAG CAA TAC
REV PrimerEurofins MWG Operonn.a.CCAAAG CGA GTA CAC AAC
2720 ThermocyclerApplied Biosystems4359659Thermocycler
RNAfold WebserverUniversität Wienn.a.Software
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Dünger
Grodan Steinwolle Würfel 10 x10 cmGrodann.a.SteinwolleBlock
Gewächshausn.a.n.a.Fürden Pflanzenanbau
PhytotronIlka Zelln.a.Fürdie Pflanzenzucht
Omnifix-F SoloB. Braun6064204Spritze
Murashige und Skoog SalzeDuchefaM 0222.0010Medienkomponente
GlukoseCarl Roth GmbH6780.2Medienkomponente
AcetosyringonSigma-AldrichD134406-5GPhytohormon-Analogon
  BioPhotometer plusEppendorf6132 000.008Photometer
Osram kaltweiß 36 WOsram4930440Lichtquelle
DinatriumphosphatCarl Roth GmbH4984.3Medienkomponente
Zentrifuge 5415DEppendorf5424 000.410Zentrifuge
Forma -86C ULT GefrierschrankThermoFisher88400Gefrierschrank
Synergy HTBioTekSIAFRTFluoreszenzplatten-Reader
Biacore T200GE Healthcaren.a.SPRGerät
Protein ALife Technologies10-1006Antikörper-bindendes Protein
HEPESCarl Roth GmbH9105.3Medienkomponente
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3Medienkomponente
2G12 AntikörperPolymunAB002Referenz-Antikörper

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fischer, R., Emans, N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. Transgenic research. 9, 277-299 (2000).
  2. Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. The biosafety of molecular farming in plants. AgBiotechNet. 5, 9 (2003).
  3. Shoji, Y., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Design Of ExperimentsTransient Protein ExpressionTobacco PlantsProtein AccumulationLeaf AgeIncubation ConditionsFluorescence MeasurementResponse SurfaceNumerical OptimizationPredictive Modeling

Related Articles