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Methodenartikel

Drug-induzierte Sensibilisierung der Adenylatzyklase: Assay Straffung und Miniaturisierung für Small Molecule-und siRNA-Screening-Anwendungen

12K Ansichten

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DOI:

10.3791/51218

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27. Januar 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Persistent Aktivierung inhibierenden G-Protein-gekoppelten Rezeptoren führt Sensibilisierung von Adenylylcyclase-Signalisierung. Um die wesentlichen molekularen Signalwege zu identifizieren, sind nonbiased Ansätze notwendig, aber diese Strategie erfordert die Entwicklung einer skalierbaren zellbasierten Assay-cAMP-Sensibilisierung. Hier beschreiben wir eine Sensibilisierung Assay für Kleinmolekül-und siRNA-Screening.

Zusammenfassung

Sensibilisierung von Adenylylcyclase (AC) Signal wurde in einer Vielzahl von neuropsychiatrischen und neurologischen Störungen, einschließlich Drogen-und Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht. Akute Aktivierung von Gai / o-gebundenen Rezeptoren hemmt AC-Aktivität, während die anhaltende Aktivierung dieser Rezeptoren führt zu heterologe Sensibilisierung von AC-und erhöhten intrazellulären cAMP. Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Verbesserung der AC Ansprechempfindlichkeit sowohl in vitro als auch in vivo nach der chronischen Aktivierung von mehreren Arten von Gai / O-verknüpften Rezeptoren, Dopamin-D 2 und μ-Opioid-Rezeptoren beobachtet. Obwohl heterologe Sensibilisierung AC wurde vor vier Jahrzehnten berichtet, wobei der Mechanismus (en), die dieses Phänomen zugrunde liegen, bleiben weitgehend unbekannt. Der Mangel an mechanistische Daten vermutlich spiegelt die Komplexität, die mit dieser Anpassungsreaktion beteiligt, was darauf hindeutet, dass nonbiased Konzepte könnten helfen, zu identifizierenten die molekularen Signalwege in heterologen Sensibilisierung von AC beteiligt. Frühere Studien haben Kinase und Gbγ Signalisierung als überlappende Komponenten, die die heterologe Sensibilisierung von AC regeln verwickelt. Um einzigartige und zusätzliche Ziele mit überlappenden Sensibilisierung der AC zu identifizieren, ist die Entwicklung und Validierung eines skalierbaren Sensibilisierung cAMP-Assay für mehr Durchsatz benötigt. Bisherige Ansätze zur Sensibilisierung Studium sind in der Regel schwerfällig mit kontinuierlichen Zellkultur-Wartung sowie eine komplexe Methode zur Messung der cAMP-Akkumulation, die mehrere Waschschritte beinhaltet. Somit wäre die Entwicklung eines robusten Test auf Zellbasis, die für Hochdurchsatz-Screening (HTS) in einem 384-Well-Format verwendet werden können zukünftige Studien erleichtern. Mit zwei D 2-Dopaminrezeptor-Zellmodellen (dh. CHO-D 2L und HEK-AC6 / D 2L), haben wir unsere 48-Well-Assay-Sensibilisierung (> 20 Schritte 4-5 Tage) zu einem Fünf-s umgewandelttep, Tag-Assay in 384-Well-Format. Dieses neue Format ist offen für kleine Molekül-Screening, und wir zeigen, dass dieser Assay-Design kann auch leicht für Reverse Transfektion von siRNA in Erwartung von gezielten siRNA-Bibliothek-Screening verwendet werden.

Einleitung

Eine adaptive Adenylatzyklase (AC) Signal Antwort als hetero-oder Super-Sensibilisierung bekannt wurde zuerst im Labor von Nobelpreisträger Dr. Marshall Nirenberg entdeckt. Dr. Nirenberg vorgeschlagen, dass die beobachtete erhöhte AC Reaktionsfähigkeit nach chronischer δ-Opioid-Rezeptor-Aktivierung war ein Mechanismus, bei Opiat-Toleranz und Abhängigkeit 1 beteiligt. Neben chronischen δ-Opioid-Rezeptor-Aktivierung tritt diese neuroadaptive Antwort von AC-Signalisierung auch nach anhaltenden Aktivierung von mehreren anderen Gai / o-gekoppelten Rezeptoren 2. Bemerkenswerterweise sind viele dieser Rezeptoren mit Schmerzen, neuropsychiatrischen und neurologischen Störungen verbunden und umfassen μ / κ-Opioid-, D 2/4 Dopamin, 5-HT 1A und M 2/4 2-Muskarinrezeptoren. Neben Dr. Nirenberg die Erkenntnisse, eine große Zahl von Hinweisen existiert Verknüpfung Sensibilisierung der AC-Signalisierung, um chronische Opioid-Rezeptor-Aktivierung sowohl in vitro und in vivo 3-7. Sensibilisierung von AC hat auch mit einer Vielzahl von Erkrankungen, die D 2-Rezeptoren wie Dopamin wie Schizophrenie und Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht worden (für eine Übersicht siehe Referenz 2). Trotz der potentiellen Bedeutung der Sensibilisierung, der genaue Mechanismus (en) mit persistierender G ☐ i / o-gekoppelten Rezeptor-Aktivierung, die zu einer erhöhten Reaktionsfähigkeit AC weitgehend unbekannt führt verbunden.

Diese Studien liefern die Begründung für die Untersuchung der Mechanismen zur Sensibilisierung der Adenylatzyklase als wichtige neurobiologische Ziel. Ebenso sollte die physiologische Relevanz der AC Signal 8 und die Bedeutung, die den einzelnen AC-Isoformen in dieser adaptive Reaktion halten auch erkannt, 2,9,10 werden. Im Rahmen der Forschung, die allgemeinen Merkmale mit heterologen Sensibilisierung der rekombinante Isoformen von AC zugeordnet parallel jene Eigenschaften described zur Untersuchung der endogenen Isoformen von AC. Insbesondere frühere Forschung hat festgestellt, dass die Aktivierung von Gai / o Proteine ​​und anschließende Freisetzung / Umlagerung βγ-Untereinheiten sind wichtige Voraussetzungen für die Rezeptor-induzierte Sensibilisierung aller AC-Isoformen. Darüber hinaus lassen sich mehrere Studien, dass die Signalisierung von Proteinkinasen und Gβγ-Untereinheiten sind in 2,11-13 Sensibilisierung beteiligt. Individuelle ACs zeigen auch einzigartigen und unterschiedlichen Mustern 12 Sensibilisierung. Zum Beispiel wird persistent Exposition von D 2-Rezeptoren Agonisten Sensibilisierung AC1 und AC8 Ca 2 + / Calmodulin-Stimulation 14,15 zugeordnet, wohingegen die eng verwandte AC3 nicht sensibilisiert 2. AC2, AC4, und AC7 sind eng miteinander verbunden, jedoch nur PKC-Aktivität stimuliert AC2 kräftig nach längerer Einwirkung von D 2-Rezeptoren sensibilisiert Agonisten 7,14,16,17. Zusätzlich AC5 und AC6 zeigen eine deutliche Grad der Heterologen Sensibilisierung für Gas-und Forskolin-stimulierte cAMP-Akkumulation nach der Aktivierung von D 2-Rezeptoren 14,18-20, scheinen aber in ihrer Forderung nach Gβγ-Untereinheit-AC Wechselwirkungen unterscheiden 21. Obwohl die meisten Studien der AC Sensibilisierung Modellzelllinien (zum Beispiel HEK293-Zellen, die einzelne AC-Isoformen) verwendet wird, scheint es, daß diese Ergebnisse zu übersetzen nativen neuronalen Zellmodellen 4,22. In jüngerer Zeit können die Auswirkungen der AC-Isoform-selektive niedermolekulare Inhibitoren in HEK293-Zellen, die AC-Isoformen identifiziert auch in vivo Verhaltensstudien 23 übersetzt werden.

Das Fehlen eines identifizierten molekularen Mechanismus für die heterologe Sensibilisierung spiegelt wahrscheinlich die Komplexität des adaptiven Reaktion sowie die einzigartigen regulatorischen Eigenschaften der einzelnen AC-Isoformen 12. Die Aufklärung solcher Komplexität wird durch die Verwendung von umständlich Methodik t kompliziertHut hat akademischen Forschern aus der Verwendung unvoreingenommene Ansätze beschränkt. Zum Beispiel beteiligt unseren früheren mechanistischen Studien den Einsatz von kontinuierlich kultiviert zellulären Modellen mit 24 - und 48-Loch-Gewebekultur Format 15. Kultivierte Zellen wurden typischerweise für 48 Stunden gezüchtet und dann auf Agonisten Drogenbehandlung (2-18 h), gefolgt von einer Reihe von Zellen wäscht und Inkubationen (Fig. 1) unterzogen. AC-Isoform-spezifische Akkumulation von cAMP Protokolle wurden dann verwendet, gefolgt von einer Messung der cAMP-Anhäufung unter Verwendung einer arbeits-und zeitaufwendig [3 H] cAMP-Bindemethode 15,24. Die Dauer vom Beginn bis zum Abschluss für jeden Assay benötigt im allgemeinen insgesamt vier bis fünf Tagen von Zelle Plattierung Datenanalyse (Abb. 1). Die Anwendung der neuen Technologien und Automatisierung hat zu deutlichen Verbesserungen für die Sensibilisierung Studien in der Industrie-und HTS-Mittelstellung geführt. Zum Beispiel kann eine Gruppe arbeitet mit dem Nationalen Zentrum für Chemical Genomics berichtet eine zweitägige HTS-Assay-Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des μ-Opioidrezeptor-induzierte Sensibilisierung in 1536 25-well Format.

Der vorliegende Artikel beschreibt unsere Bemühungen um eine HTS-Assay für die Untersuchung der heterologen Sensibilisierung unter Verwendung von Technologien, die in den meisten akademischen Forschungseinrichtungen verfügbar sind, zu entwickeln. Diese Strategie wurde durch Einbringen der Verwendung von kryokonservierten Zellen aus Zellmodellen heterolog exprimieren, die D-2-Dopamin-Rezeptor in Kombination mit endogenen oder einzelne rekombinante Adenylatcyclase-Isoformen (CHO-oder HEK-D 2L-AC6 / D 2 l) gelöst. Um unsere Durchsatz zu verbessern, haben wir unsere neu gestaltete 48-Loch-Sensibilisierung Assay (ca.> 20 Stufen über 4-5 Tage) zu einem Fünf-Schritt-, Einzel-Tagestest in 384-Well-Format, das im Wesentlichen "zu mischen und zu lesen" war. Das neue Format verwendet einen handelsüblichen homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (HTRF)-Assay, die cAMP-acc messenumulation in intakten Zellen mit einem Multi-Mode-Plattenlesegerät. Der Assay ist robust und zugänglich für Kleinmolekül-Screening, und kann wirksam angewendet, um nach Inhibitoren von heterologen Sensibilisierung screenen. Zusätzlich stellen wir Daten, die den Einsatz dieses Tests mit reverser Transfektion von siRNA zur gezielten oder genomweite siRNA-Bibliothek-Screening mit nur geringfügiger Modifikation des allgemeinen Ansatzes ermöglicht.

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Protokoll

1. Ausbau und Kryokonservierung von Zellen bereit Assay

  1. Kultur CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) Zellen auf einer 15 cm 2-Zellkulturschale in Ham-F12-Medium mit 1,0 &mgr; M L-Glutamin, 800 &mgr; g / &mgr; l G418, 300 &mgr; g / &mgr; l Hygromycin, 100 u / ul ergänzt Penicillin, 100 &mgr; g / &mgr; l Streptomycin und 10% fötalem Rinderserum (FBS).
  2. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2, bis die Zellen 90-95% konfluent. Waschen der Zellen mit 10 &mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) geerntet und die Zellen durch Zugabe von 3 ul Zelldissoziationspuffer für 5 min bei 37 ° C. Resuspendieren der Zellen mit 12 ul der Kulturmedien und zählen Zellen mit Trypanblau-Ausschluss.
  3. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Absaugen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 5 ul Gefriermedien (10% Dimethylsulfoxid, 90% FBS). Verdünnte Zellsuspension, um die gewünschte Zellkonzentration (z. B. 1-20 × 10 6 Zellen / &mgr; l) zu erreichen.
  4. Aliquot 1,0 ul Zelllösung zu jeder Kryoröhrchen. Die Kryoröhrchen in einen Zellgefrierbehaelter Inkubation bei -80 ° C über Nacht. Übertragen Sie die Kryoröhrchen in einen flüssigen N 2-Tank für langfristige Lagerung.

2. Plating Assay Bereit Cells (und umge Transfektion Option)

  1. Schnell auftauen eine gefrorene Kryoröhrchen von Zellen in einem 37 ° C Wasserbad. Sobald Zellen werden aufgetaut, übertragen Sie die Zellen auf eine 15 ul konische Röhrchen mit 9 ul Opti-MEM, und mischen durch Umdrehen der Röhre 3-5x.
  2. Zentrifugieren der Zellen bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand und resuspendieren in 1 ul Opti-MEM.
  3. Zählen der Zellen unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluss, um die Zellviabilität zu bestimmen, und löst die lebensfähigen Zellen nach Bedarf (z. B.. 3 x 10 5 Zellen / &mgr; l Konzentration) inOpti-MEM. Platte 10 ul / Vertiefung von Zellen in einer Gewebekultur-behandelten 384-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette.
  4. Machen serielle Verdünnungen von cAMP in Opti-MEM um eine Standardkurve für die Schätzung cAMP-Produktion der Zellen zu generieren (gemäß der Empfehlungen des Herstellers - siehe Abschnitt 7). In 10 ul / Vertiefung der cAMP-Standards auf die Platte. Hinweis: eine einzelne Standardkurve kann auf einem separaten Teller oder leere Brunnen auf einer der Testplatten hergestellt werden.
  5. Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur und bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 1 Stunde.

3. Reverse-siRNA-Transfektion Option *

Dieser Abschnitt ist optional und relevante auf 3.

  1. Bereiten Sie eine Lösung von siRNA in RNase-freiem ddH2O (zB 0,4 pmol / ul). In 5 ul einzelnen Vertiefungen von 384-Well-Platte, und die Platte Zentrifuge bei 100 g für 15 sec bei Raumtemperatur.
  2. Verdünnen Lipofectamine 2000 in Opti-MEM mit einem Faktor von 0,006 (z. B. hinzufügen 6 ul Lipofectamine 2000 bis 1000 ul Opti-MEM) und mischen durch Pipettieren von oben und unten.
  3. Inkubieren Lipofectamin 2000/Opti-MEM Lösung für 5 min bei Raumtemperatur. Mit 5 ul der verdünnten Lösung Lipofectamin 2000/Opti-MEM einzelnen Vertiefungen 384-Well-Platte, das bereits siRNA. Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 s bei Raumtemperatur.
  4. Inkubiere die Platte für 30 min bei Raumtemperatur.
  5. Plattentest bereit Zellen, wie oben (Abschnitt 2) beschrieben. Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 s bei Raumtemperatur.
  6. Zurück zu Testplatte befeuchteten Inkubator bei 37 ° C (5% CO 2) für 48-96 h, wie für gezielte Gen-knock down (siehe Diskussion) bestimmt.

4. Small Molecule Screening

  1. Verdünnen Sie das Medikament von Interesse (zB. Kleinmolekül-Inhibitoren) in Opti-MEM, um die gewünschten Endkonzentrationen 6X. Serielle Verdünnungen können mit Handpipetten oder ein Liquid-Handling-Station abgeschlossen sein.
  2. Add 2,5 ul / Vertiefung der Testverbindung oder Puffer Fahrzeugs (z. B. DMSO) enthält, an der Seite der Vertiefungen mit einer Mehrkanalpipette.
  3. Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur (Inkubation ist optional).

5. Persistent Agonist-Behandlung

  1. Vorbereitung einer 600 nM (dh. 6-fache der gewünschten Endkonzentration von 100 nM) Lösung von Quinpirol in Opti-MEM.
  2. In 2,5 ul / Vertiefung der 600 nM Quinpirol Lösung an der Seite der Brunnen mit einer Mehrkanalpipette.
  3. Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur und bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 2 Stunden.

6. Die Stimulation der cAMP-Akkumulation

  1. Während der 2-stündigen Inkubation bereiten die stimulatiauf Lösung in Opti-MEM. Die Stimulation Lösung von 40 &mgr; M Forskolin enthielt 2 &mgr; M 3-Isobutyl-1-methyxanthine (IBMX) und 4 &mgr; M Spiperon (alle Konzentrationen in Schritt 6 werden 4-fache der gewünschten Endkonzentration).
  2. Mit 5 &mgr; l / Well der Stimulationslösung auf die Seite der Vertiefungen mit einer Mehrkanalpipette.
  3. Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur, und bei Raumtemperatur für 1 Stunde.

7. Abschrecken und Abschätzung der cAMP-Akkumulation

  1. Produktion von cAMP durch die Zellen unter Verwendung des cAMP dynamischen 2-Kit nach den Anweisungen des Herstellers gemessen. Kurz gesagt, rekonstruieren anti-cAMP-Cryptat und cAMP-d2 in destilliertem Wasser. Einfrieren aliquotiert bei -20 ° C für die kurzfristige Lagerung.
  2. Verdünnen Sie ein Aliquot von anti-cAMP-Cryptat und ein Aliquot der cAMP-D2 separat in der Lyse-Puffer gemäß den Anweisungen des Herstellers, um Arbeitslösungen zu machen.
  3. Add 10 ul / Vertiefung der Anti-cAMP-Cryptat Arbeitslösung und 10 ul / Vertiefung des cAMP-d2 Arbeits Lösung für das 384-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette.
  4. Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur, und bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
  5. Lesen Sie die Platte in einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät (Einstellung für Empfindlichkeit Auto-Skalierung) unter Verwendung einer Anregung von 337 nm und Messung der Emissionen bei 620 nm und 665 nm pro fertigt Anweisungen.
  6. Nehmen ratiometrische Analyse zu beurteilen cAMP-Standardkurve pro fertigt Anweisungen. Mit den sich daraus ergebenden Werte, extrapolieren die geschätzte cAMP-Akkumulation in den Testvertiefungen mit Datenanalyse-Software.

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Ergebnisse

Teil I. Die Entwicklung einer 384er heterologe Sensibilisierung Test zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren mit einem kommerziell erhältlichen Zellmodell.

Um heterologe Sensibilisierung in einem Zellmodell zu untersuchen, haben wir eine Reihe von Verbesserungen, die es uns ermöglicht, den Test in einem "Mix und lesen"-Format zu optimieren. Einige der wichtigsten Änderungen sind unten markiert ist, und werden ausführlicher in der Erörterung beschriebe...

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Diskussion

In einer Bemühung, Studien heterologer Sensibilisierung zu erleichtern, haben wir ausgiebig unseren früheren Methode, die zu einer stromlinienförmigen modifizierten "Mix und lesen"-Format, das änderbare Hochdurchsatz-Screening-und Wirkungsprüfung ist. Die wesentlichen Änderungen in unserem Protokoll kann wie folgt zusammengefasst werden: 1) die Verwendung von kryokonservierten Zellen als "Assay-ready"-Reagenzien, 2) die Miniaturisierung des Assays in 384-Well-Format, und 3) die Verwendung des HTRF-Me...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die Autoren danken Herrn Richard Zink und Todd Wiernicki für methodische Ausbildung und Assay-Führung zu bestätigen. Wir danken auch John Paul Spence für sorgfältiges Lesen und redaktionelle Vorschläge. Diese Arbeit wurde von der National Institute of Health MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation, und Eli Lilly and Company über den Lilly Research Award-Programm (LRAP) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CHO-K1-DRD2L ZellenDiscoveRx930579C2
Ham' s F12 MedienVWRSH30026fs
Fötales RinderserumVWRSH3007003
G418SigmaA1720
HygromycinFisher50-230-5556
Penicillin/StreptomycinLife Technologies15070063
15 cm SchalenBD Falcon353025
DMSOSigmaD2650
ZelldissoziationspufferLife Technologies13150016
Phosphatgepufferte KochsalzlösungLife Technologies10010-049
KryofläschchenFisher976171
Opti-MEMLife Technologies31985070
TC-behandelte 384-Well-PlattenPerkin-Elmer6007688
HTRF cAMP Dynamic 2 KitCisbio Bioassays62AM4PEBhttp://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4BiotekH4MLFPTAD
Prism 6GraphPad SoftwareNA
3-Isobutyl-1-methylxanthinSigmaI5879
(±)QuinpirolSigmaQ111
SpiperonSigmaS7395
ClozapinSigmaC6305
HaloperidolSigmaH1512
S-(-)SulpiridSigmaS112
Lipofectamine 2000 TransfektionsreagenzInvitrogen11668019
TrypanblauLeben TechnologienT10282
Wasser-, DNase- und RNase-freiMP Biomedicals821739
Gas siRNADharmaconcustom siRNA Non-targeting siRNA
control DharmaconD-001206-14-20
siGlo RedDharmaconD-001630-02

Referenzen

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Schlagwörter

Adenylylcyclase SensibilisierungcAMP Akkumulations AssayHigh Throughput Screening384 Well Formatkryokonservierte ZellenHTRF DetektionSmall Molecule ScreeningsiRNA ReverstransfektionD2 Dopamin RezeptorQuinpirol Behandlung
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