Persistent Aktivierung inhibierenden G-Protein-gekoppelten Rezeptoren führt Sensibilisierung von Adenylylcyclase-Signalisierung. Um die wesentlichen molekularen Signalwege zu identifizieren, sind nonbiased Ansätze notwendig, aber diese Strategie erfordert die Entwicklung einer skalierbaren zellbasierten Assay-cAMP-Sensibilisierung. Hier beschreiben wir eine Sensibilisierung Assay für Kleinmolekül-und siRNA-Screening.
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Methodenartikel
Drug-induzierte Sensibilisierung der Adenylatzyklase: Assay Straffung und Miniaturisierung für Small Molecule-und siRNA-Screening-Anwendungen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Sensibilisierung von Adenylylcyclase (AC) Signal wurde in einer Vielzahl von neuropsychiatrischen und neurologischen Störungen, einschließlich Drogen-und Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht. Akute Aktivierung von Gai / o-gebundenen Rezeptoren hemmt AC-Aktivität, während die anhaltende Aktivierung dieser Rezeptoren führt zu heterologe Sensibilisierung von AC-und erhöhten intrazellulären cAMP. Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Verbesserung der AC Ansprechempfindlichkeit sowohl in vitro als auch in vivo nach der chronischen Aktivierung von mehreren Arten von Gai / O-verknüpften Rezeptoren, Dopamin-D 2 und μ-Opioid-Rezeptoren beobachtet. Obwohl heterologe Sensibilisierung AC wurde vor vier Jahrzehnten berichtet, wobei der Mechanismus (en), die dieses Phänomen zugrunde liegen, bleiben weitgehend unbekannt. Der Mangel an mechanistische Daten vermutlich spiegelt die Komplexität, die mit dieser Anpassungsreaktion beteiligt, was darauf hindeutet, dass nonbiased Konzepte könnten helfen, zu identifizierenten die molekularen Signalwege in heterologen Sensibilisierung von AC beteiligt. Frühere Studien haben Kinase und Gbγ Signalisierung als überlappende Komponenten, die die heterologe Sensibilisierung von AC regeln verwickelt. Um einzigartige und zusätzliche Ziele mit überlappenden Sensibilisierung der AC zu identifizieren, ist die Entwicklung und Validierung eines skalierbaren Sensibilisierung cAMP-Assay für mehr Durchsatz benötigt. Bisherige Ansätze zur Sensibilisierung Studium sind in der Regel schwerfällig mit kontinuierlichen Zellkultur-Wartung sowie eine komplexe Methode zur Messung der cAMP-Akkumulation, die mehrere Waschschritte beinhaltet. Somit wäre die Entwicklung eines robusten Test auf Zellbasis, die für Hochdurchsatz-Screening (HTS) in einem 384-Well-Format verwendet werden können zukünftige Studien erleichtern. Mit zwei D 2-Dopaminrezeptor-Zellmodellen (dh. CHO-D 2L und HEK-AC6 / D 2L), haben wir unsere 48-Well-Assay-Sensibilisierung (> 20 Schritte 4-5 Tage) zu einem Fünf-s umgewandelttep, Tag-Assay in 384-Well-Format. Dieses neue Format ist offen für kleine Molekül-Screening, und wir zeigen, dass dieser Assay-Design kann auch leicht für Reverse Transfektion von siRNA in Erwartung von gezielten siRNA-Bibliothek-Screening verwendet werden.
Einleitung
Eine adaptive Adenylatzyklase (AC) Signal Antwort als hetero-oder Super-Sensibilisierung bekannt wurde zuerst im Labor von Nobelpreisträger Dr. Marshall Nirenberg entdeckt. Dr. Nirenberg vorgeschlagen, dass die beobachtete erhöhte AC Reaktionsfähigkeit nach chronischer δ-Opioid-Rezeptor-Aktivierung war ein Mechanismus, bei Opiat-Toleranz und Abhängigkeit 1 beteiligt. Neben chronischen δ-Opioid-Rezeptor-Aktivierung tritt diese neuroadaptive Antwort von AC-Signalisierung auch nach anhaltenden Aktivierung von mehreren anderen Gai / o-gekoppelten Rezeptoren 2. Bemerkenswerterweise sind viele dieser Rezeptoren mit Schmerzen, neuropsychiatrischen und ....
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Protokoll
1. Ausbau und Kryokonservierung von Zellen bereit Assay
- Kultur CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) Zellen auf einer 15 cm 2-Zellkulturschale in Ham-F12-Medium mit 1,0 &mgr; M L-Glutamin, 800 &mgr; g / &mgr; l G418, 300 &mgr; g / &mgr; l Hygromycin, 100 u / ul ergänzt Penicillin, 100 &mgr; g / &mgr; l Streptomycin und 10% fötalem Rinderserum (FBS).
- Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2, bis die Zellen 90-95% konfluent. Waschen der Zellen mit 10 &mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) geerntet und die Zellen durch Zugabe von 3 ul Zelldissoziationspuffer für 5 min bei 37 ° ....
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Ergebnisse
Teil I. Die Entwicklung einer 384er heterologe Sensibilisierung Test zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren mit einem kommerziell erhältlichen Zellmodell.
Um heterologe Sensibilisierung in einem Zellmodell zu untersuchen, haben wir eine Reihe von Verbesserungen, die es uns ermöglicht, den Test in einem "Mix und lesen"-Format zu optimieren. Einige der wichtigsten Änderungen sind unten markiert ist, und werden ausführlicher in der Erörterung beschriebe.......
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Diskussion
In einer Bemühung, Studien heterologer Sensibilisierung zu erleichtern, haben wir ausgiebig unseren früheren Methode, die zu einer stromlinienförmigen modifizierten "Mix und lesen"-Format, das änderbare Hochdurchsatz-Screening-und Wirkungsprüfung ist. Die wesentlichen Änderungen in unserem Protokoll kann wie folgt zusammengefasst werden: 1) die Verwendung von kryokonservierten Zellen als "Assay-ready"-Reagenzien, 2) die Miniaturisierung des Assays in 384-Well-Format, und 3) die Verwendung des HTRF-Me.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren danken Herrn Richard Zink und Todd Wiernicki für methodische Ausbildung und Assay-Führung zu bestätigen. Wir danken auch John Paul Spence für sorgfältiges Lesen und redaktionelle Vorschläge. Diese Arbeit wurde von der National Institute of Health MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation, und Eli Lilly and Company über den Lilly Research Award-Programm (LRAP) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| CHO-K1-DRD2L Zellen | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham' s F12 Medien | VWR | SH30026fs | |
| Fötales Rinderserum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm Schalen | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Zelldissoziationspuffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Life Technologies | 10010-049 | |
| Kryofläschchen | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC-behandelte 384-Well-Platten | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 Kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthin | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirol | Sigma | Q111 | |
| Spiperon | Sigma | S7395 | |
| Clozapin | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpirid | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypanblau | Leben Technologien | T10282 | |
| Wasser-, DNase- und RNase-frei | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA Non-targeting siRNA | |
| control Dharmacon | D-001206-14-20 | ||
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
Referenzen
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by....
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Nachdrucke und Genehmigungen
