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Methodenartikel

Helical Organisation der Blutgerinnungsfaktor VIII auf Lipid-Nanotubes

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⸱

DOI:

10.3791/51254

⸱

3. Juni 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Cell Biology, University of Texas Medical Branch, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas Medical Branch, 3Sealy Center for Structural Biology and Molecular Biophysics, University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine Kombination von Cryo-Elektronenmikroskopie, Lipid Nanotechnologie und Strukturanalyse angewandt, um die Membran-gebundene Struktur von zwei hoch homolog FVIII Formen lösen: Mensch und Schwein. Die in unserem Labor entwickelt, um spiralförmig organisieren die zwei funktionellen rekombinanten FVIII-Formulare auf negativ geladenen Lipid-Nanotubes (LNT)-Methode beschrieben.

Zusammenfassung

Cryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) 1 ist ein leistungsfähiges Konzept für die funktionale Struktur von Proteinen und Komplexen in einem hydratisierten Zustand und 2 Membranumgebung zu untersuchen.

Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) 3 ist ein Multi-Domain-Blutplasma-Glykoprotein. Defekt oder Mangel an FVIII ist die Ursache für Hämophilie Typ A - eine schwere Blutgerinnungsstörung. Nach der proteolytischen Aktivierung bindet FVIII an den Serin-Protease Faktor IXa auf der negativ geladenen Plättchenmembran, die entscheidend für die normale Blutgerinnung 4 ist. Trotz der zentralen Rolle spielt in FVIII-Koagulation, Strukturinformationen für die Membran-gebundenen Zustand ist unvollständig 5. Rekombinanten FVIII-Konzentrat ist das wirksamste Medikament gegen Hämophilie Typ A und im Handel erhältlichen FVIII als menschliche oder Schweine, beide bildende funktionelle Komplexe mit menschlichem Faktor IXa 6,7 ausgedrückt. "> In dieser Studie stellen wir eine Kombination von Cryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), angewandte Nanotechnologie Lipid-und Strukturanalyse, um die Membran-gebundene Struktur von zwei hoch homolog FVIII Formen lösen:. Mensch und Schwein Die in unserem Labor entwickelte Methodik schraubenförmig organisieren die zwei funktionellen rekombinanten FVIII-Formulare auf negativ geladenen Lipid-Nanotubes (LNT) beschrieben. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass unser Ansatz ist empfindlich genug, um die Unterschiede in der Schrauben Organisation zwischen den beiden hoch homolog in Folge (86% Sequenzidentität zu definieren )-Proteine. Detaillierte Protokolle für die Schrauben Organisation Kryo-EM und Elektronentomographie (ET) Datenerfassung werden. Die zweidimensionale (2D angegeben) und dreidimensionale (3D) Struktur-Analyse angewendet, um die 3D-Rekonstruktionen von Mensch und Schwein erhalten FVIII-LNT wird diskutiert. Die vorgestellten Mensch und Schwein FVIII-LNT Strukturen zeigen das Potenzial der vorgeschlagenen Methodik zur kalkulierte die funktionale, membrangebundene Organisation von Blutgerinnungsfaktor VIII bei hoher Auflösung.

Einleitung

Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) ist ein großes Glykoprotein von 2.332 Aminosäuren in sechs Bereiche unterteilt: A1-A2-B-A3-C1-C2-3. Thrombin nach Aktivierung FVIII wirkt als Cofaktor, Faktor IXa in der Membran-gebundenen Tenasekomplex. Die Bindung von FVIII aktiviert (FVIIIa) zu FIXa in einer Membran-je nach Art und Weise verbessert FIXa proteolytischen Effizienz von mehr als 10 5-fache, die entscheidend für die effiziente Blutgerinnung 4 ist. Trotz der wichtigen Rolle FVIII spielt bei der Koagulation und der Tenasekomplexes Bildung, noch die funktionelle Membran-gebundenen FVIII-Struktur gelöst werden.

Um dies zu beheben, haben einzelne Lipid-Doppelschicht-Nanoröhren (LNT) reich an Phosphatidylserin (PS), die zur Bindung FVIII mit hoher Affinität 8, 9 und die aktivierte Thrombozytenoberfläche ähnlich entwickelt worden 10. Aufeinanderfolgende spiralförmigen Organisation von FVIII zu LNT gebunden ist erwiesen, wirkungs zu seinve für die Strukturbestimmung von FVIII-Membran-gebundenen Zustand von Cryo-EM-5. Funktionalisierten LNT sind ein ideales System, um Protein-Protein-und Protein-Membran-Wechselwirkungen von spiralförmig organisierten Membran-assoziierten Proteinen, die durch Kryo-EM 11, 12 zu untersuchen. Kryo-EM hat den Vorteil gegenüber herkömmlichen Konstruktionsverfahren, wie Röntgenkristallographie und NMR, als die Probe in der Nähe des physiologischen Umgebung (Puffer, Membran-pH-Wert) erhalten, ohne Additive und Isotope. Im Fall von FVIII, die Untersuchung der Membran-gebundenen Struktur mit dieser Technik ist noch physiologisch relevant, da die LNT ähneln eng durch Größe, Form und Zusammensetzung der Pseudopodien der aktivierten Thrombozyten, wo die Komplexe Tenase Zusammenbau in vivo.

Mängel und Mangel an FVIII Ursache Hämophilie A, einer Erkrankung, die schwere Blutungen 1 in 5.000 Männern der menschlichen Bevölkerung 4, 6. Die meisten Eirksame Therapie für Hämophilie A ist lebenslange Verabreichung von rekombinantem humanem FVIII (hFVIII). Eine signifikante Komplikation des rekombinanten FVIII-Hämophilie-A-Therapie ist die Entwicklung von inhibitorischen Antikörpern gegen den menschlichen Form, die bei etwa 30% der Patienten mit Hämophilie A 13. In diesem Fall wird Schweine-FVIII (pFVIII) Konzentrat verwendet, wie Schweine-FVIII-Displays geringe Kreuzreaktivität mit inhibitorische Antikörper gegen menschliches FVIII und Formen funktionalen Komplexen mit menschlichen FIXa 7. Gründung der membrangebundene Organisation von sowohl Schweine-und Menschen FVIII Formen ist wichtig, die strukturelle Basis von FVIII-Cofaktor-Funktion und Auswirkungen auf Blut Blutstillung zu verstehen.

In dieser Studie beschreiben wir eine Kombination von Lipid Nanotechnologie, Cryo-EM-und Strukturanalyse entwickelt, um die membrangebundene Organisation von zwei hoch homolog FVIII Formen lösen. Die vorgestellten Cryo-EM-Daten und 3D-Strukturen für spiralförmig organisiert porcine und Menschen FVIII auf negativ geladenen LNT zeigen das Potenzial der vorgeschlagenen Nanotechnologie als Grundlage für die Strukturbestimmung von FVIII und Membran-gebundenen Gerinnungsfaktoren und Komplexe in einer physiologischen Membranumgebung.

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Protokoll

1. Probenvorbereitung

  1. Pufferaustausch menschlichen FVIII-BDD 14 und Schweine-FVIII BDD 15 gegen HBS-Ca-Puffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2, pH = 7,4) und konzentriert, um 1,2 mg / ml. Halten der Proteinlösung bei -80 ° C.
  2. Vorbereitung Lipidnanotubes (LNT) durch Mischen Galactosylceramid (GC) und Phosphatidylserin (PS) bei 1.04 w / w-Verhältnis in Chloroform. Verdampfe das Chloroform unter Argon und Solubilisierung der Lipide in HBS-Puffer auf 1 mg / ml. Halten Sie die LNT-Lösung bei 4 ° C

2. Kryo-Elektronenmikroskopie von FVIII-LNT

  1. Cryo-EM Probenvorbereitung
    1. Glimmentladung das 300 mesh Quantifoil R2 / 2 Kupfergitter (Kohlenstoff Seite nach oben) in einem Gemisch aus O 2 und H 2-Gas für 10 s bei 50 W.
    2. Mischen der FVIII und LNT Lösungen in HBS-Ca-Puffer im Verhältnis 1:1 w / w-Verhältnis und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur.
    3. Geben Sie einen Tropfen 2,5 ulFVIII-LNT Probe auf die hydrophilen Rasterelektronenmikroskopie im Vitrobot Mark IV befeuchteten Kammer (100% Luftfeuchtigkeit).
    4. Blot und Flash einfrieren das Raster (ein Blot für 3,5 sec, tupfen Kraft 1) in flüssiger C 2 H 6, abgekühlt durch flüssige N 2 zu amorphem Eis zu erhalten.
    5. Shop Netze in Lagerboxen unter flüssigem N 2 (LN2).
  2. Cryo-EM Data Collection
    HINWEIS: Die JEM2100-LaB6 (Jahr 2010) wird mit einem TemCon Betriebssystem, bestehend aus einem Computer mit dem Elektronenmikroskop, einem Bildschirm mit Fenstern Lesen der Vakuumanlage, Beleuchtungssystem, HT, Linsenströme und so weiter, und zwei miteinander verbundene ausgestattet Platten: links und rechts, auf beiden Seiten der Säule befindet. Die Strahlverschiebung X-, Y-Knöpfe (SHIFT Y, Y SIFT) und das Multifunktionsgerät (DEF / STIG) Knöpfe sind auf beiden Platten. Auf der linken Seite ist die Beleuchtung (Brigthness) Knopf. Auf der rechten Seite sind: die Vergrößerung (MAG / CAM-Länge) und Fokus (FOCUS) und die drei Knöpfe imaging (MAG1, MAG2, LOWMAG) und ein Beugungs Modi-Tasten (DIFF). Wir erwerben unsere Daten in MAG1 bei alpha 2. Die Mindestdosis Beleuchtungsbedingungen (MDS) für Kryo-EM Datenerfassung erforderlich sind mit F1 bis F6-Tasten, obere Reihe auf der RECHTEN Bedienfeld einstellen. In diesem Protokoll die allgemeinen Einstellungen werden verwendet: F1 - heben / senken Bildschirm, F2 - SEARCH-Modus, F3 - FOCUS Modus F4 - FOTO-Modus F5 - MDS OFF / ON und F6 - BEAM BLANK, verwendet, um die Probe von der Strahlung abschirmen Schäden, die durch Ablenken des Strahls.
    1. Legen Sie die Kryo-Halter in die Kryo-Station und füllen Sie den Dewar des Halters und der Kryo-Station mit LN2. Wenn die Temperatur erreicht -192 ° C, offener Blende am Halter Spitze, Platz vorher eingefroren Cryo-EM Gitter in die vorgesehene Stelle und mit einem Klemmring.
    2. Legen Sie die Kryo-Halter in das Elektronenmikroskop. Füllen Sie den Dewar der Kryo-Halter und dem Anti-contaminator Kammer mit LN2. Warten Sie, bis der Halter für 30-60 min zu stabilisieren. Drücken Sie F6 auf unddrehen Sie den Faden auf. Wenn der Faden gesättigt ist, drücken Sie F6 aus und offener Blende auf Halter, um das Raster zu sehen.
    3. Presse Low Mag / alpha 1 (bei 200X mag eingestellt), und suchen Bereiche mit dünnen Eis auf dem Netz.
    4. Wechseln Sie zu MAG 1/alpha 2 bis Mindestdosis (MDS) eingestellt und Cryo-EM-Daten zu erwerben bei niedrigen Elektronendosen, ohne Beschädigung der Probe.
      1. Drücken Sie F2, um den Suchmodus eingestellt. Stellen Vergrößerung bei 40.000 x. Vergrößern Strahl mit brigtness Knopf, um minimale Elektronendosis ~ 0,04 E - / Å 2 · s. Presse DIFF zu Beugungsmodus zu wechseln. Stellen Sie die Kamera auf 120 cm Länge mit MAG / CAM LÄNGE Knopf. Suchen Flächen auf dem Gitter in den vorgewählten Bereichen in LOWMAG die Lipid-Nanoröhren in den Löchern des Kohlenstofffilms haben.
      2. Drücken Sie F4, Foto-Modus bei 40.000-facher Vergrößerung eingestellt und stellen Sie Beleuchtung mit Helligkeitsknopf in Dosen von 16 bis 25 E - / Å 2 · s. Standard-Fokus-Taste drücken, um den Fokus Bedingungen eingestellt Einstellung der Z-Höheder Probe mit der Z-UP / DOWN-Tasten (rechts-Bedienung). Unschärfe-Set zwischen -1.5 und -2.5 um.
      3. Richten Sie SEARCH und Fotomodus, indem ein Platz in der LIVE-VIEW-Fenster auf dem Digitalkamera-Monitor im Suchmodus entsprechend den in PHOTO-Modus abgebildet werden.
      4. Drücken Sie F3, um Fokusmodus bei 100.000-facher Vergrößerung eingestellt. Fokus Beleuchtung, um die CCD-Chips decken (ca. 4 - 5 cm Radius) und von der Achse, um die Gegend in PHOTO-Modus abgebildet werden nicht bestrahlen. Stellen Defokus auf ~ -1.5 -2.5 und um mit dem FOCUS-Knopf und korrigieren Astigmatismus des Bildes mit DEF / STIG Knöpfe.
    5. Wählen Sie das FVIII-LNT im SEARCH-Modus durch den Erwerb von Live-Bildern in der Liveansicht-Fenster auf dem Digitalkamera-Monitor abgebildet werden. Zentrieren Sie die FVIII-LNT auf dem Platz auf der Live-View-Fenster gezogen.
    6. Nehmen Sie ein digitales Bild auf der CCD-Kamera auf 52.000 X effektive Vergrößerung und 0,5 sec Belichtungs durch Umschalten in den Fotomodus und auf die AcquirE-Taste auf der digitalen Kamera-Aufnahme-Monitor. Die Bildaufnahmebedingungen sind wie die Beam-Blank (TERS) öffnen sich nur, wenn das Bild im Foto-Modus erworben gesetzt.
    7. Prüfen Sie die Qualität und Defokussierung des aufgenommenen Bildes durch Drücken von STRG-F zu erhalten, eine Fast-Fourier-Transformation (FFT).

3. 3D-Rekonstruktion

HINWEIS: Die Bildanalyse-Software für die 2D-und 3D-Analyse verwendet: EMAN2 IHRSR und sind frei verfügbar. EMAN2 aus http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install heruntergeladen werden. Egelman@virginia.edu: Die IHRSR Software kann von Professor Egelman erhalten werden. Die endgültigen IHRSR Weiterbildungen sind auf der Texas Advanced Computing Center laufen Cluster: http://www.tacc.utexas.edu/ an der Universität von Texas, Austin. Die in Fig. 1 dargestellte 3D-Rekonstruktionsalgorithmus besteht aus zwei Schritten: zuerst einen homogenen Satz von helikalen Segmenten (Partikel) mit dem 2D-freien Referenz alignmein EMAN 2 nt (RFA) Algorithmen implementiert, die zweite Erreichen einer 3D-Rekonstruktion auf der Grundlage der Wendel Parameter und Rückprojektionsalgorithmen in IHRSR eingebaut. Der erste Schritt für die Auswahl nutzt die homogene Partikelmengen für die 3D-Rekonstruktion mit Single Particle SPA (Algorithmen), für die EMAN2 wurde speziell entwickelt und vertrieben entwickelten Programme: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Dieser Schritt wurde den Cryo-EM-Daten angepasst. Der zweite Schritt wird mit dem IHRSR Algorithmus, der spezifisch für die Art der Schraubenanordnungen mit den rekombinanten Faktor VIII-Formen erhalten gestaltet erreicht. Dieser Algorithmus ist weitgehend durch die wissenschaftliche Literatur 12 dokumentiert.

  1. Führen 2D-Bildanalyse mit dem EMAN2 wissenschaftliche Bildverarbeitungssuite: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 bis homogene Partikel (Wendelsegment) Sätze für Wendel Rekonstruktion auswählen.
    1. Wählen Cryo-EM mikroskopischen Aufnahmen mit straigmit der Digitalkamera-Software-und Visualisierungstools ht und gut organisierte Wendelrohre.
    2. Umkehren, normalisieren und Filter für Röntgenbildpunkte in der GUI e2workflow.py, Einzelpartikel Rekonstruktion (spr) Option: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
    3. Importieren der invertierten normierten und Röntgen gefilterten Pixelbilder in der e2helixboxer.py GUI. Wählen FVIII-LNT Wendelrohre und Segment bei 256 x 256 Pixel (2,9 Å / pix) mit 90% Überdeckung mit: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
    4. Bewerten Sie die Unschärfe-mikroskopische Aufnahmen von den ursprünglichen und gelten Kontrastübertragungsfunktion (CTF) Korrektur (nur Phasenkorrektur) auf die spiralförmige Segmente aus den gleichen Mikroaufnahmen mit der e2ctf.py Option in der e2workflow.py eingebaut: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
    5. Generieren ersten Partikel (Wendelsegmente) setzt in der e2workflow.py GUI - SPR Option: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
    6. Berechnen 2D-Klasse mit Durchschnittswerten der Referenz e2refine2d.py Algorithmus Anwendung kostenlos k-Mittelwert Klassifizierung für einheitliche Datensätze mit dem gleichen Durchmesser LNT und der Grad der spiralförmigen Ordnung (Abbildung 2) zu wählen, nach dem Skript: "e2refine2d.py - iter = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - Eingang = INPUT.hdf - NCL = 51 - simcmp = dot - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = dot - classraligncmp = Phase - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = Mittelwert - normproj-classkeepsig ', die Änderung der NCL-Wert entsprechend.
      1. Klassifizieren Sie die Anfangsdaten in 150 Klassen NCLs = 151 'über 8 Iterationen mit' classkeep = 0,8 'gesetzt, was bedeutet, dass Partikel mit weniger als 80% Ähnlichkeit zu dem Klassendurchschnitt werden aus der gegebenen Klasse ausgeschlossen. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
      2. Merge-Partikel aus der Klasse Mittelwertemit ausgeprägten spiralförmigen Beugungs in e2display.py Zwischendatensatz zu erstellen.
      3. Klassifizieren Sie die Zwischendaten in 50 Klassen NCLs = 51 'gesetzt, um Klassen mit gleichem Durchmesser und Grad der Ordnung zu unterscheiden.
      4. Merge Partikel aus Klassen mit gleichem Durchmesser und Grad der Ordnung in e2display.py, um die endgültige Datensatz für die dreidimensionale Rekonstruktion zu erstellen: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector.
  2. Führen Sie mit dem spiralförmigen Wiederaufbau Iterative Helical Real Space Wiederaufbau (IHRSR)-Algorithmus, wie in Egelman 17, 18 beschrieben.
    1. Schätzung der Anstieg &Dgr; z (Å) des FVIII-LNT Helix aus dem kombinierten Fourier-Transformation der Teilchen in dem endgültigen Datensatz.
    2. Definieren Sie den Azimutwinkel ΔΦ (º) durch mit einem konstanten Az parallel IHRSR Verfeinerungen, die Erhöhung von 5 ΔΦ76; bis 60 ° in 5 °-Schritten.
    3. Führen Sie 100 aufeinanderfolgenden Zyklen IHRSR für jeweils endgültige Daten mit einer gesichtslosen Zylinder als ein Anfangsvolumen und den ersten Wendel Parameter Az und ΔΦ wie in 3.2.1 definiert ist. und 3.2.2.
    4. Überprüfen Sie die letzten Bände für die Konvergenz der Schraubenparameter und Korrespondenz zwischen Klassendurchschnittswerte aus dem 2D-Klassifizierung des Datenkörpers und die Vorsprünge aus der letzten IHRSR Wiederaufbau.
    5. Symmetrie aufzuerlegen, um den endgültigen 3D-Rekonstruktionen, die der asymmetrischen Einheit in der endgültigen Verteilung asymmetrisch 3D-Volumen beobachtet: 4-fach für den menschlichen FVIII-LNT und 5-fach für Schweine-FVIII LNT. Führen Sie weitere 100 Verfeinerung Zyklen, um eine endgültige symmetrisierten 3D-Rekonstruktion zu erzeugen.
    6. Berechnen Sie die Fourier Shell Correlation-Kurve für beide Mengen, indem man zuerst die entsprechenden Daten in gerade und ungerade gesetzt: "e2proc2d.py - split = 2 '. Dann führen Sie in Folge 100 IHRSR Verfeinerungen wie in 3.2.3 beschrieben. Berechnen Sie die FSC der 3D-Volumen aus den geraden und ungeraden Datensätze erstellt: 'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc.
  3. Visualisieren und Segment die FVIII-LNT Volumen in UCSF Schimäre.
    1. Öffnen Sie die letzten Bände von Schritt 3.2.5. in UCSF Chimera und stellen Sie die Kontur Ebene zu 0,005 in der TOOLS> VOLUME DATA> Volume Viewer-Option.
    2. In TOOLS> VOLUME DATA> SEGMENT MAP, wählen Volumen in SEGMENT Registerkarte MAP und klicken Sie auf Segment zu Segment ist die Lautstärke.
    3. Konzernsegmente, die einer Einheitszelle, indem Sie mit STRG + SHIFT und Klicken-Gruppe.
    4. Farbe der Segmente durch Elementarzelle und Helix mit AKTIONEN> COLOR Option, um die Strukturmerkmale betonen.

4. Elektronentomographie

  1. Negativ gefärbten FVIII-LNT Probenvorbereitung
    1. Bereiten FVIII-LNT Proben wie für die Cryo-EM Experimenten.
    2. Glimmentladungen kohlenstoffbeschichtete 300-Mesh-Kupfergitter (Kohlenstoff Seite nach oben) in einem Gemisch aus O 2 und H 2-Gas für 10 s bei 50 W für Kryo-EM-Experimenten.
    3. Geben Sie einen Tropfen 2,5 ul FVIII-LNT Suspension mit 6-nm kolloidalem Gold-Nanopartikel in das Netz, trocknen Sie die überschüssige Flüssigkeit und negativ, indem 5 ul 1% Uranylacetat-Lösung für 2 min färben. Tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit und Luft trocknen das Raster.
  2. Elektronentomographie Data Collection
    1. Übertragen Sie das Gitter in den einzelnen Kipphalter.
    2. Übertragen des Halters in dem Elektronenmikroskop.
    3. Sammeln Kippserie automatisch mit der Software SerialEM 19 bei 2 °-Schritten in einem Winkelbereich von -60 ° bis +60 ° und die Aufnahme von Bildern mit einer CCD-Kamera auf 52.000 X effektive Vergrößerung, -6 bis -10 um-Unschärfe und Elektronendosis von 150 - 170 electrons / Å 2 · s pro Schnittbild.
  3. Elektronentomographie Rekonstruktion der FVIII-LNT
    Hinweis: Rekonstruieren Sie das pFVIII-LNT LNT-und hFVIII gekippt Serie in 4.2 erworben. mit der Möglichkeit, die Software IMOD ETomo nach dem Tutorial: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html
    1. Mit einem Terminal-Fenster, öffnen Sie das Schnittbild in 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
    2. Bin das Tomogramm von 4 mit dem IMOD BINVOL Befehl, um die Größe des Schnittbildes zu verringern.
    3. Wählen Sie den richtigen Winkel, um den Lipidnanoröhre entlang der Y-Achse in der klassierten Schnittbild mit dem Befehl IMOD ROTATEVOL drehen.
    4. Drehen Sie den vollen Schichtaufnahme mit dem Befehl IMOD ROTATEVOL.
    5. Schneiden Sie das ausgewählte Lipidnanoröhre entlang der Y-Achse mit der CLIP RESIZE Befehl IMOD orientiert.
    6. Öffnen Sie das zugeschnittene Unterschichtbild mit 3DMOD.
    7. Klicken Tomogramms, die Anordnung der Faktor VIII-Moleküle entlang visualisierendie Schichten in Z-Achse und entlang der Y-Achse in der Sub-Tomogramm Volumen.

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Ergebnisse

Rekombinante humane FVIII und Schweine wurden erfolgreich spiralförmig organisiert negativ auf einzelne Doppelschicht LNT erhoben, die aktivierte Thrombozytenoberfläche ähnelt. Die spiralförmige Organisation der Mensch und Schwein FVIII-LNT war konsistent durch die gesammelten digitalen Aufnahmen (Abbildung 2). Die Steuerung und der LNT Mensch und Schwein FVIII-LNT Wendelrohre wurden ausgewählt und mit der GUI und e2helixboxer.py anfänglichen Datensätze mit dem e2workflow.py GUI-, Optio...

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Diskussion

In dieser Arbeit wird eine Methode vorgestellt, um zwischen zwei Membrangebundene von hochhomologen Proteinen unterscheiden: Human-und Schweine-FVIII selbstorganisierten auf den Lipidstoffnanoröhren in die Bedingungen im menschlichen Körper auftreten.

Bei dem beschriebenen Verfahren, Mensch und Schwein FVIII erfolgreich schraubenförmig auf Lipid-Nanoröhren organisiert, was der wichtigste Schritt ist. Der nächste kritische Schritt ist, um die Probe in dünnen amorph...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Konkurrenz finanzielles Interesse und sie können direkt über eine der in dieser Handschrift veröffentlichten Verfahren kontaktiert werden.

Danksagungen

10SDG3500034 und UTMB-NZB-Start-up-Fonds zu SSM: Diese Arbeit wird durch einen Nationalen Entwicklungs Scientist Zuschuss von der American Heart Association unterstützt. Die Autoren erkennen die Cryo-EM und Wissenschaftliches Rechnen Einrichtungen des Sealy Zentrum für Strukturbiologie am UTMB ( www.scsb.utmb.edu ) sowie Drs. Steve Lüdtke und Ed Egelman Hilfe zu den 2D-und 3D-Wendelrekonstruktionsalgorithmen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
JEM2100 mit LaB6JEOL Ltd.JEM-2100betrieben bei 200 kV
mit der TEMCON SoftwareJEOL Ltd.
Gatan626 Kryo-HalterGatan, Inc.626.DHgekühlt auf -175 ° C
mit TemperiergerätGatan, Inc.
Gatan 4K x 4K CCD-KameraGatan, Inc.US40004.096 x 4.096 Pixel bei 15 μ m/Pixel physikalische Auflösung
Solarus Modell 950 PlasmareinigerGatan, Inc.
Vitrobot Mark IVFEI
Carbon-beschichtetes 300-Mesh-KupfergitterTed Pella01821Plasmareinigung für 10 Sekunden auf
Hochleistungs-Quantifoil R2/2 300 MeshElektronenmikroskopie SciencesQ225-CR2Kohlenstoffbeschichtete 300-Mesh-Cu-Gitter mit 2 mm Durchmesser Löcher 
Uranylacetat-DihydratTed Pella194811%ige Lösung, gefiltertes
Galactosyl-CeramidAvanti Polar Lipids Inc.
Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serinAvanti Polar Lipids Inc.
EM-Software Digital MicrographGatan, Inc.http://www.gatan.com/DM/
EM Software EMANkostenloser Downloadhttp://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ 
EM Software Spiderkostenloser Downloadhttp://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM Software IHRSRkostenloser DownloadVon Edward H. Egelman verfügbare http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM Software (IMOD)kostenloser Downloadhttp://bio3d.colorado.edu/imod/ 
EM Software (SerialEM)kostenloser Downloadftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimerakostenloser Downloadhttp://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html
860546840035

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