Die Beurteilung Phagozytische Clearance von Cell Death in Experimental Stroke ligierbaren von Fluoreszenzsonden

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein neues Fluoreszenz-Technik für die selektive in situ-Markierung der aktiven Fresszellen, die klar aus Zell Leichen in der Schlaganfall. Der Ansatz ist wichtig für die Beurteilung Gehirn Reaktion auf Ischämie, da nur ein kleiner Teil der in ischämischen Gehirn vorhanden Phagozyten in der Clearance des Zelltodes beteiligt.

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine neue histochemische Ansatz zur Visualisierung von phagocytic Spiel in Brenn Gehirn Ischämie. Der Ansatz ermöglicht die Untersuchung der Beseitigung der toten Zellen in der Schlaganfall durch Entsorgungs Phagozyten von jedem Mobilfunk Linie. Obwohl zahlreiche Zellen unterschiedlicher Herkunft, die in der Lage sind Phagozytose in ischämischen Hirn vorhanden sind, nur ein Teil von ihnen aktiv zu verschlingen und verdauen Zelle Leichen. Die selektive Visualisierung, Quantifizierung und Analyse solcher aktiven phagocytic Abfallwirtschaft sind hilfreich bei der Beurteilung Gehirn Reaktion auf Ischämie. Effiziente Zelltod Freiheit ist wichtig für Gehirn-Erholung von ischämischen Schädigung, da es öffnet den Weg für die nachfolgenden Regenerationsprozesse. Das Versäumnis, die Leichen zu reinigen würde in einer toxischen Reaktion durch nicht abgebaute DNA und Proteinen verursacht werden. Das beschriebene Verfahren nutzt fluoreszierende Sonden selektiv durch eine Virus Topoisomerase zu charakteristischen DNA-Brüche in allen Fresszellen während Einwirkung hergestellt ligiertund Verdauung von Zellen irreversibel durch Ischämie beschädigt. Das Verfahren ist ein neues Werkzeug für die Untersuchung der Gehirnreaktion ischämischer Verletzung.

Einleitung

Der ischämische Schlaganfall induziert tiefgreifenden Veränderungen in der betroffenen Hirngewebe. Sie initiiert massiven Zelltod, was zu der schnellen Aktivierung von Fresszellen Wohnsitz von Mikroglia-Herkunft führt. Es legt auch abseits Infiltration von ischämischen Hirn durch verschiedene Arten von Blut abgeleitete professionellen Phagozyten einschließlich Neutrophile, Makrophagen, dendritischen und Mastzellen ^1,2.

Es wird noch diskutiert, ob diese Reaktion auf ischämische Verletzung spielt eine positive oder eine negative Rolle. Obwohl Phagozytose nach Schlaganfall kann von Vorteil sein, weil es tote Zellen löscht und unte....

Protokoll

Das Verfahren ist geeignet für Formaldehyd-fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten. Die Technik wird hier in ihrer Anwendung auf experimentellem Schlaganfall bei Ratten nachgewiesen.

1. Vorbereiten Komponenten für Tyramid Signalverstärkung (TSA) System

Obwohl die TSA-basierte Verstärkung in der Endstufe der Markierung verwendet, die Vorbereitung für diese Reaktion kann mehr als 1 Stunde dauern. Daher ist es bequem, die TSA Reagenzien vor dem Start der Etikettierung zu machen.

1. Machen Fluorophor Tyramid Stammlösung. Verwenden Sie das Fluorophor Tyramid Reagenz in einzelnen Fläschchen mit ....

Ergebnisse

Das Prinzip der Technik zur Markierung von aktiven Entsorgungsfresszellen ist in Abbildung 1 dargestellt. Die schematische zeigt, dass die Erkennung erfolgt in drei Schritten. Der erste Schritt umfasst die Aktivierung Sonde (Fig. 1A); im zweiten Schritt die Sonde aktiviert wird, um spezifische DNA-Brüche in Gewebeschnitten (Fig. 1C) ligiert; der dritte Schritt Fluoreszenzsignalverstärkung (Fig. 1D). In der näheren Erläuterung, geht wie folgt die Erkennu.......

Diskussion

In diesem Video zeigen wir, im Gewebeschnitt-Format, wie man aktive Phagozyten Label, das klar den Zelltod in der Brenn Gehirn Ischämie. Die vorgestellte Technik ist der erste Ansatz, die speziell markiert nur die Abfallmanagement-Zellen, die verschlungen haben und aktiv verdauen zellulären Leichen. Dies macht es vorteilhaft gegenüber anderen bestehenden Methoden zur Markierung von phagozytischen Zellen, die nicht über diese Fähigkeit.

Das Verfahren verwendet eine allgemeine und selektive DN.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Xylol	JT Baker	9490-22
Ethanol
Proteinase K	Roche	3115879001
PBS Puffer	Invitrogen	AM9624
Vaccinia Topoisomerase I	Vivid Technologies		5 pmol/μ l Bestand
12-Basen-Überhang Suizid-Oligonukleotid	IDT DNA		5'-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3'; B – Biotin-dT; 100 pmol/μ l Lagerbestand in ddH2O
Adapter Oligonukleotid	IDT DNA		5'-TAG AAT CGT ATC-3'; 100 pmol/μ l Lager in ddH2O
1 M Tris-HCl, PH 7.4	Lonza	51237
TSA, Fluorescein-System	PerkinElmer
1 M NaCl
DMSO	Sigma
Tween-20	Sigma	P9416-50ML
Vectashield mit DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Deckgläser			22 x 22 mm oder 22 x 40 mm Glas- oder Kunststoffdeckgläser. Deckgläser aus Kunststoff sind während der Reaktion vorzuziehen, da sie sich leichter von der Sektion entfernen lassen.
		des Rattenhirns	Das Gehirn der Ratte wurde 48 Stunden nach der Reproduktion eines ischämischen Schlaganfalls entnommen, wie in Didenko et al11. 5-6 μ M-dicke Schnitte, die aus paraformaldehyd-fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeblöcken geschnitten wurden. Verwenden Sie geladene und vorgereinigte Objektträger.
Inverses Mikroskop	Olympus
Digitale Videokamera und Software	Micromax
Software	Metamorph