Wir präsentieren ein neues Fluoreszenz-Technik für die selektive in situ-Markierung der aktiven Fresszellen, die klar aus Zell Leichen in der Schlaganfall. Der Ansatz ist wichtig für die Beurteilung Gehirn Reaktion auf Ischämie, da nur ein kleiner Teil der in ischämischen Gehirn vorhanden Phagozyten in der Clearance des Zelltodes beteiligt.
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Methodenartikel
Die Beurteilung Phagozytische Clearance von Cell Death in Experimental Stroke ligierbaren von Fluoreszenzsonden
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wir beschreiben eine neue histochemische Ansatz zur Visualisierung von phagocytic Spiel in Brenn Gehirn Ischämie. Der Ansatz ermöglicht die Untersuchung der Beseitigung der toten Zellen in der Schlaganfall durch Entsorgungs Phagozyten von jedem Mobilfunk Linie. Obwohl zahlreiche Zellen unterschiedlicher Herkunft, die in der Lage sind Phagozytose in ischämischen Hirn vorhanden sind, nur ein Teil von ihnen aktiv zu verschlingen und verdauen Zelle Leichen. Die selektive Visualisierung, Quantifizierung und Analyse solcher aktiven phagocytic Abfallwirtschaft sind hilfreich bei der Beurteilung Gehirn Reaktion auf Ischämie. Effiziente Zelltod Freiheit ist wichtig für Gehirn-Erholung von ischämischen Schädigung, da es öffnet den Weg für die nachfolgenden Regenerationsprozesse. Das Versäumnis, die Leichen zu reinigen würde in einer toxischen Reaktion durch nicht abgebaute DNA und Proteinen verursacht werden. Das beschriebene Verfahren nutzt fluoreszierende Sonden selektiv durch eine Virus Topoisomerase zu charakteristischen DNA-Brüche in allen Fresszellen während Einwirkung hergestellt ligiertund Verdauung von Zellen irreversibel durch Ischämie beschädigt. Das Verfahren ist ein neues Werkzeug für die Untersuchung der Gehirnreaktion ischämischer Verletzung.
Einleitung
Der ischämische Schlaganfall induziert tiefgreifenden Veränderungen in der betroffenen Hirngewebe. Sie initiiert massiven Zelltod, was zu der schnellen Aktivierung von Fresszellen Wohnsitz von Mikroglia-Herkunft führt. Es legt auch abseits Infiltration von ischämischen Hirn durch verschiedene Arten von Blut abgeleitete professionellen Phagozyten einschließlich Neutrophile, Makrophagen, dendritischen und Mastzellen 1,2.
Es wird noch diskutiert, ob diese Reaktion auf ischämische Verletzung spielt eine positive oder eine negative Rolle. Obwohl Phagozytose nach Schlaganfall kann von Vorteil sein, weil es tote Zellen löscht und unterdrückt Entzündungen, erzeugt es auch giftig reaktive Sauerstoffspezies beeinflussen neuronale Überleben und verschärft Gewebeschäden 5.1.
Während mehrere Arten von Fresszellen infiltrieren ischämischen Gehirn, nicht alle von ihnen in Abfallwirtschaft teilnehmen werden durch Aufnahme Zelle Leichen und den Weg für regenerative Prozesse 3.1. Diese creates eine Voraussetzung für die selektive Identifizierung von Abfallmanagement-Zellen, durchführen phagocytic Clearance von Zelltod bei Schlaganfall. Bei der Abbildung solcher aktiven Abfallmanagement-Zellen, ist es auch wichtig, die Frage, wie effizient sie die Leichen versenkt Zelle abbauen zu beantworten. Die effektive und vollständige Abbau der DNA des sterbenden Zelle in Phagozytose ist wichtig, weil es Selbstimmunisierung und die Freisetzung von pathologischen Kernmaterial 6 verhindert.
Hier präsentieren wir neue Sonden, die spezifische DNA-Brüche verwenden als Marker der aktiven Fresszellen. Diese Unterschrift Umbrüche werden ausschließlich während Aufschlüsselung verschlungen Kerne im Inneren Funktionsabfallmanagement-Zellen produziert. Daher selektiv die Sonden kennzeichnen nur die Phagozyten, die verschlingen und verdauen aktiv zelluläre Leichen. Sie ermöglichen auch die Beobachtung der Intensität und der Fertigstellung der DNA-Aufschlüsselung nach der Einwirkung. Die Sonden sind hilfreich bei der Bewertung der Intensität und effizienparenz phagozytischer Freiheit.
Die neuen Sonden beruhen auf einem Nicht-Protein-basierten Marker und können daher in Studien von Schlaganfall, ischämische Schädigung, wo umfangreiche zelluläre Morphologie stören oder Abbau Marker auf Proteinbasis, insbesondere in der Kernzone ischämischen besonders vorteilhaft sein.
Das Prinzip des Verfahrens ist in Fig. 1 dargestellt. Die Figur zeigt haarnadelförmigen Oligonukleotidsonden durch die Vaccinia-Topoisomerase-Enzym (VACC TOPO) ligiert 5'-OH-Enden, um DNA durch lysosomale DNase II während der DNA-Verdauung 7 erzeugt.
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Protokoll
Das Verfahren ist geeignet für Formaldehyd-fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten. Die Technik wird hier in ihrer Anwendung auf experimentellem Schlaganfall bei Ratten nachgewiesen.
1. Vorbereiten Komponenten für Tyramid Signalverstärkung (TSA) System
Obwohl die TSA-basierte Verstärkung in der Endstufe der Markierung verwendet, die Vorbereitung für diese Reaktion kann mehr als 1 Stunde dauern. Daher ist es bequem, die TSA Reagenzien vor dem Start der Etikettierung zu machen.
- Machen Fluorophor Tyramid Stammlösung. Verwenden Sie das Fluorophor Tyramid Reagenz in einzelnen Fläschchen mit dem TSA Labeling Kit geliefert. In 300 ul DMSO auf die Tyramid Reagenzfläschchen. Fluorophore Tyramid Stammlösung ist für mindestens 3 Monate stabil bei 4 ° C gelagert
- Machen TNT Waschpuffer, enthaltend 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,15 M NaCl; 0,05% Tween-20. Bei Bedarf 0,3% Triton X-100 kann für die 0,05% Tween-20 ersetzt werden. Alternatively PBS als Waschpuffer verwendet werden.
- Machen TNB Blockierungspuffer: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,15 M NaCl; 0,5% Blocking Reagenz (mit-Kit im Lieferumfang enthalten). Um die Blockierung Reagenz vollständig gelöst, es in kleinen Schritten langsam auf den Puffer unter Rühren. Heizen diese Lösung allmählich auf 55 ° C unter kontinuierlichem Rühren. Dies kann 30-60 min dauern. Die Lösung wird milchig erscheinen. Auf Raumtemperatur bringen, bevor Sie. Aliquotieren und bei -20 ° C für die langfristige Nutzung.
2. Vorbereitung der § §
Verwenden Sie Folien mit montierten 5 um dicke Schnitte von Formalin-fixierten Gewebe zu schneiden.
- Gönnen Abschnitte mit Xylol für 15 min.
- Rehydrate Abschnitte wie folgt: Bad in 96% EtOH 2x für je 5 min; Bad in 80% EtOH für 5 min; waschen mit Wasser 2x 5 min je.
- Machen Proteinase K Arbeitslösung durch Verdünnen Proteinase K-Stammlösung auf 50 ug / ml in PBS.
- Proteinase hinzufügenK Arbeitslösung, um Abschnitte. Inkubieren 15 min bei 23 ° C. Das Volumen der Lösung und die Zeit des Verdaus müssen in Abhängigkeit von der Größe der Abschnitte und Gewebetypen angepasst werden. Für einen Abschnitt kleinen (weniger als 5 mm im Durchmesser), 50 &mgr; l Proteinase-Lösung ausreichend wäre. Abschnitt für eine mittlere Größe (~ 10 mm Durchmesser), 100 l Proteinase-K-Lösung. Für sehr große Abschnitte das Volumen der Lösung kann skaliert werden. In allen Fällen darauf achten, overdigestion von Abschnitten, die zum Verlust des Signals führt zu vervollständigen und zerstört Gewebemorphologie zu verhindern. Dies geschieht häufig, wenn die Inkubationszeit 25 Minuten überschreitet.
- Waschen Sie Abschnitte in destilliertem Wasser 2x für je 5 min. Bereiten Sie das Markierungsmischung mit aktiven Sonde während Abschnitte sind in Wasser.
3. VACC TOPO-basierte Färbung
- Bereiten Sie die aktiven Sondenlösung durch die Kombination der folgenden:
Wasser - 11.75 ul
1 M Tris-HCl, pH 7,4 bis 1,25 μl
100 pmol eines 12-Basen-Überhang Selbstmord Oligonukleotid - 1 ul
100 pmol Oligonukleotid-Adapter - 1 ul
50 pmol VACC TOPO - 10 ul - Vorsichtig mischen. Inkubieren bei Raumtemperatur (23 ° C) für 15 min bis zum Sonden Aktivierung ermöglichen.
- Nehmen Abschnitte aus Wasch Glas und saugen Sie den verbleibenden Wasser. Dann gelten die in Schritt 3.1 (25 ul pro ~ 10 x 10 mm-Bereich) vorbereitet aktiv Sonde Lösung.
- Deckglas die Abschnitte und Inkubation für 15 min bei 23 ° C Dip Slides in Wasser vorsichtig den Deckgläsern. In Wasser 3x Waschen für jeweils 5 min.
4. TSA Signal Enhancement
- Bedeckung Gewebeschnitte mit TNB Blockierungspuffer früher hergestellt und inkubieren Objektträger in einer feuchten Kammer für 30 Minuten bei Raumtemperatur (23 ° C).
- Bereiten Sie eine Verdünnung von 1:100 Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugate (SA-HRP) in TNB Blockierungspuffer. Saugen TNBBlocking-Puffer und gelten SA-HRP-Lösung. Die Objektträger mit SA-HRP für 30 min bei Raumtemperatur. Für ausreichende Reagenz Volumen, um die Gewebeschnitt, in der Regel 100 ul pro Abschnitt zu decken.
- Wasch gleitet 3x für jeweils 5 Minuten in Waschpuffer TNT (oder PBS) bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie eine 1:50-Verdünnung von Fluorophor Tyramid Lager in 1x Verstärkung Verdünnungsmittel aus dem Kit. Pipettieren Sie die Fluorophor Tyramid Arbeitslösung auf jeder Folie. Verwenden Sie genug Arbeitslösung, um die Gewebeschnitt, in der Regel 100 ul pro Abschnitt vollständig zu bedecken. Machen Fluorophor Tyramid Arbeitslösung unmittelbar vor jeder Etikettierung. Die Lösung kann nicht wiederverwendet werden, so entsorgen Sie unbenutzte Teil davon nach der Markierung.
- Die Folien Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 bis 10 min. Überwachung der Fluoreszenzanstieg unter dem Mikroskop, bis die ersten Andeutungen von Strukturen gesehen werden kann. Schnell fahren Sie mit Schritt waschen.
- Wasch gleitet 3x für jeweils 5 Minuten in Waschpuffer TNT (oder PBS) bei Raum temperatur unter Rühren.
- Fügen Sie die Antifading-Lösung mit DAPI und Deckglas. Beobachten unter dem Fluoreszenzmikroskop. Zur Visualisierung DAPI und FITC-Fluoreszenz mit einem Bandpassfilter-Set:
FITC Anregungs D490/40, Emission 520/10; DAPI-Anregungs D360/40, Emission 460/20, oder ähnliches.
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Ergebnisse
Das Prinzip der Technik zur Markierung von aktiven Entsorgungsfresszellen ist in Abbildung 1 dargestellt. Die schematische zeigt, dass die Erkennung erfolgt in drei Schritten. Der erste Schritt umfasst die Aktivierung Sonde (Fig. 1A); im zweiten Schritt die Sonde aktiviert wird, um spezifische DNA-Brüche in Gewebeschnitten (Fig. 1C) ligiert; der dritte Schritt Fluoreszenzsignalverstärkung (Fig. 1D). In der näheren Erläuterung, geht wie folgt die Erkennu...
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Diskussion
In diesem Video zeigen wir, im Gewebeschnitt-Format, wie man aktive Phagozyten Label, das klar den Zelltod in der Brenn Gehirn Ischämie. Die vorgestellte Technik ist der erste Ansatz, die speziell markiert nur die Abfallmanagement-Zellen, die verschlungen haben und aktiv verdauen zellulären Leichen. Dies macht es vorteilhaft gegenüber anderen bestehenden Methoden zur Markierung von phagozytischen Zellen, die nicht über diese Fähigkeit.
Das Verfahren verwendet eine allgemeine und selektive DN...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Danksagungen
Diese Forschung wurde durch Gewährung R01NS062842 aus dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health (VVD) und durch Zuschüsse R21 NS064403 aus dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health durch ARRA (VVD) und R21 unterstützt EB006301 National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health (VVD).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Xylol | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Puffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μ l Bestand | |
| 12-Basen-Überhang Suizid-Oligonukleotid | IDT DNA | 5'-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3'; B – Biotin-dT; 100 pmol/μ l Lagerbestand in ddH2O | |
| Adapter Oligonukleotid | IDT DNA | 5'-TAG AAT CGT ATC-3'; 100 pmol/μ l Lager in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein-System | PerkinElmer | ||
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield mit DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Deckgläser | 22 x 22 mm oder 22 x 40 mm Glas- oder Kunststoffdeckgläser. Deckgläser aus Kunststoff sind während der Reaktion vorzuziehen, da sie sich leichter von der Sektion entfernen lassen. | ||
| des Rattenhirns | Das Gehirn der Ratte wurde 48 Stunden nach der Reproduktion eines ischämischen Schlaganfalls entnommen, wie in Didenko et al11. 5-6 μ M-dicke Schnitte, die aus paraformaldehyd-fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeblöcken geschnitten wurden. Verwenden Sie geladene und vorgereinigte Objektträger. | ||
| Inverses Mikroskop | Olympus | ||
| Digitale Videokamera und Software | Micromax | ||
| Software | Metamorph |
Referenzen
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
- Thored, P. Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke. Glia. 57 (8), 835-849 (2009).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).
- Shuman, S. Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase. Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).
- TSA Fluorescence Systems. , Available from: http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-73609man_TSAFluorescenceSystems.pdf Forthcoming.
- Barcia, C., et al. ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo. Sci. Rep. . 2, 809(2012).
- Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks. Mol. Med. 8, 818-823 (2002).
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Nachdrucke und Genehmigungen
