Die Tauchdruck der Zellen auf eine modifizierte Oberfläche mit einem Continuous Flow Microspotter

Summary

Diese 3D-Mikrofluidik-Drucktechnologie druckt Arrays von Zellen auf untergetauchte Oberflächen. Wir beschreiben, wie Arrays von Zellen mikrofluidisch in 3D-Durchflusszellen auf untergetauchte Oberflächen gebracht werden. Durch das Bedrucken von submersen Oberflächen wurden Zell-Microarrays hergestellt, die ein Wirkstoffscreening und die Beurteilung der Zytotoxizität in einer Vielzahl von Bereichen ermöglichen.

Abstract

Das Drucken von Zellen für Microarray-Anwendungen birgt erhebliche Herausforderungen, einschließlich des Problems der Aufrechterhaltung des physiologisch relevanten Zellphänotyps nach dem Drucken, der schlechten Organisation und Verteilung der gewünschten Zellen und der Unfähigkeit, Medikamente und/oder Nährstoffe an die Zielbereiche im Array zu liefern. Unsere mikrofluidische 3D-Drucktechnologie ist in der Lage, Arrays von Zellen automatisiert und gemultiplext auf untergetauchte Oberflächen zu versiegeln und zu drucken. Das Design der 3D-Fluidik des Microfluidic Cell Array (MFCA) ermöglicht es, die Druckkopfspitze in eine mit Flüssigkeit gefüllte Vertiefung oder Schale abzusenken und gegen eine Oberfläche zu drücken, um eine Dichtung zu bilden. Die weiche Silikonspitze des Druckkopfes verhält sich wie eine Dichtung und ist in der Lage, durch Druck oder Rückzug eine reversible Abdichtung zu bilden. Andere Zellendrucktechnologien, wie z. B. Pin- oder Tintenstrahldrucker, sind nicht in der Lage, in getauchten Anwendungen zu drucken. Der Druck unter getauchter Oberfläche ist unerlässlich, um Phänotypen von Zellen zu erhalten und diese Zellen auf einer Oberfläche zu überwachen, ohne die Eigenschaften der Materialoberfläche zu beeinträchtigen. Durch das Bedrucken von Unterwasseroberflächen werden Zell-Microarrays hergestellt, die ein Wirkstoffscreening und eine Bewertung der Zytotoxizität in einer Vielzahl von Bereichen ermöglichen, darunter Krebs, Diabetes, Entzündungen, Infektionen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen.

Introduction

Jüngste Fortschritte in der Pharmaindustrie haben zu einem verstärkten Interesse im Umgang mit zellulären Mikroarrays in der Arzneimittelforschung für Wirkstoff-Screening und Analyse cytotoxicological ^1,2,3 geführt. Die Entwicklung von in-vitro-Assays mit hohem Durchsatz und Screening-Methoden unter Verwendung von Zellmikroarrays würde die schnelle und kostengünstige Entwicklung von Wirkstoffkandidaten sowie Voraus die grundlegenden Verständnis der Zelle ^1,4 erleichtern. Der traditionelle Ansatz für Screening mit Zellen verwendet herkömmliche Well-Platte-Plattformen; jedoch ist dieser Ansatz aufgrund der hohen Kosten, begrenzte Durchsatz und begrenzte Fähigkeit zur quantitativen Informationen über Zell-Funktion ^1,5 begrenzt. Aufgrund dieser Einschränkungen ist die Forschung in der Zell-Microarray-Technologien aufkeimenden für molekularbiologische Charakterisierung, Tissue Engineering und Drug-Screening ^1,6. Die Vorteile der zellulären Mikroarrays sind kleinere Proben Nutzung, minimale Effekte vonzellulären Phänotyps Heterogenität Maskierungsinformationen, und vor allem die Fähigkeit, mehr Tests für Anwendungen mit hohem Durchsatz ^1,7,8 automatisieren.

Die Pharmaindustrie nutzt derzeit Hochdurchsatz-zellbasierten Screening-Assays mit 2D-Zellmonolayer-Kulturen für Wirkstoff-Screening in Mikrotitervertiefung Platten ^9. Multiplex-Zellen in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten bietet das Potential für höhere Durch mit einzigartigen Experimentiermöglichkeiten. Ferner können die aktuellen Technologien für Mobilmicroarrays um die Zellen zu trocknen, die den Phänotyp der Zellen drastisch verändern können aus in vivo ^10,11. Um diese Probleme zu überwinden, die MFCA wurde entwickelt und ist in Fig. 1 gezeigt. Das Design der Fluidik MFCA 3D ermöglicht die Druckkopfspitze in Fig. 1 in ein Bad abgesenkt und gegen die Oberfläche zusammengedrückt, um eine Dichtung zu bilden. Die weiche Silikonspitze des Druckkopfes verhält sich wie einDichtung und einen reversiblen Dichtung bildet. Die MFCA Technologie ist einzigartig geeignet, mit untergetauchten Oberflächen, die für beide Zellkulturen und Gewebeschnitt Systeme erforderlich Schnittstelle, und es ist schwierig oder unmöglich mit den meisten anderen Ansätzen. Pins oder Tintenstrahldruck wird nicht funktionieren, und 2D-Mikrofluid-Geräte sind nicht für die Abscheidung oder Schnittstellen mit großen Arrays von diskreten Stellen geeignet. Ferner werden durch die Miniaturisierung und die Lokalisierung des Experiments - der zellulären Mikroarray - der MFCA windet die große Probleme mit der Hochdurchsatz-zellbasierten Screening-Assays verbunden.

Die CFM verwendet 3D-Kanal-Netzwerke zu Zyklus kleines Volumen Flüssigkeitsproben über mikroskopische Ort Stellen auf einer Oberfläche ^12,13. Durch das Drucken mit Durchfluss sind Biomoleküle, Zellen und anderen Reagenzien in einer flüssigen Umgebung während des gesamten Druckprozesses beibehalten, so dass der Druck von empfindlichen Biomoleküle und Zellen ohne Kontakt mit Luft, die die aktuelle Zelle Drucktechniken behindert. Es ist auch möglich, direkt aus rohem Material, wie Hybridom-Überständen oder sofern ein Erfassungsmechanismus auf der Array-Oberfläche zu drucken. Das Ziel dieser Handschrift ist es, im Detail die untergetauchten Druck von beiden Zelltypen auf eine Oberfläche zu erklären.

Protocol

1. Zellkultur Vorbereitung

1. Bewahren NIH/3T3 Zelle Aktien in flüssigem Stickstoff bis zur Verwendung.
2. Vorbereitung komplette Medien NIH/3T3-Zellen mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum, 10 mM HEPES-Puffer, 50 Einheiten / ml Penicillin und 50 &mgr; g / ml Streptomycin ergänzt.
3. Auftauen Zellen für 2-3 min in einem Schüttelwasserbad bei 37 ° C
4. Die Zellen in 5 ml Vollmedium und Zentrifugation bei 1.500 × g für 3 min.
5. Entfernen Sie den Zellüberstand, ohne das Zellpellet zu stören.
6. Resuspendieren der Zellen in 5 ml Medium und zählen Zellen mit einer Zählkammer.
   1. Entfernen Sie 10 ul der Zellsuspension und in ein 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   2. Werden 10 ul Trypanblau zu der Zellsuspension zugegeben und mit der Spitze der Pipette.
   3. Je 10 ul der gefärbten Zellen in einer Zählkammer Kammer.
   4. Zählen von Zellen in Hämozytometers bei 10-facherVergrößerung.
      1. Zählen Sie die lebenden Zellen (kleine, weiße Kugeln) für 4 der 9 großen Quadraten. Nur zählen die lebenden Zellen, die dunkelblau von der Trypanblau-Färbung nicht angezeigt.
      2. Berechnen der Anzahl der Zellen pro Quadrat großen, was die Anzahl der Zellen x 10 ⁴ Zellen / ml in der ursprünglichen Zellsuspension.
      3. Samenzellen in einer Dichte von 1 × 10 ⁵ Zellen / ml mit insgesamt 5 ml in jeden Kolben T25.
   5. Kulturzellen um 70% bis 80% Konfluenz vor Beginn der Experimente. Aktualisieren Medien alle 2-3 Tage oder nach Bedarf.

2. Printing Oberflächenvorbereitung

1. Mark ein Rechteck mit Marker auf dem Boden einer Gewebekultur-behandelt Polystyrol (TCTPS) 12-Well-Platte die Größe der Druckkopf (7 mm x 19 mm).
2. Je 50 ul fetales Rinderserum in die rechteckige Fläche und breitete sie über den gesamten Bereich mit der Spitze.
3. Verlassen Sie die Petrischalein einem sterilen Biosicherheit Kapuze O / N, damit das Serum vor Ort vollständig trocknen. Diese Platten sollten bereit nicht mehr als 2 Tage vor benutzen können.

3. Tauchdruck

1. Spülen Sie den Druckkopf mit destilliertem Wasser.
   1. Füllen Sie eine 60 mm Petrischale mit destilliertem Wasser und docken Sie den Druckkopf auf die Oberfläche.
   2. Fließen destilliertem Wasser durch jede der Leitungen für 2 min bei 150 ul / min unter Verwendung einer Luftpumpe.
   3. Entsorgen Sie das Wasser aus der Petrischale und füllen Sie es mit sauberem Wasser.
   4. Bewegen Sie den Druckkopf nach oben und unten im Wasser 3-mal.
2. Docken Sie den Druckkopf über das Zentrum Serum beschichteten Stelle in der vorbereiteten 12-Well-Platte.
3. Minister der Druckkopf mit vorgewärmter komplette Medien-, 300 ul pro Kanal.
4. Druck suspendierten Zellen bei einer Konzentration von 50.000 Zellen / ml auf die Oberfläche und 60 &mgr; l / min, 100 &mgr; l pro Kanal.
5. Setzen Sie den Druckkopf, links gegen die angedocktFläche und der Verteiler in einem Zellkulturbrutschrank mit 5% CO ₂ und 37 ° C für 2 h eingestellt.
6. Nach 2 h Inkubation, entfernen Sie den Druckkopf und legen Sie den Deckel auf der Kulturschale. Der Zeitpunkt, zu dem der Druckkopf entfernt wird als der Zeitpunkt 0 Stunden.

4. Standard-Zellkultur

1. 1 ml vorgewärmtes Medium einem Serum-spotted TCTPS 12-Well-Platte in Schritt 2 hergestellt.
2. Nehmen Sie 1 ml der restlichen Zellsuspension aus Schritt 2 und Pipette in einer einzigen Vertiefung einer 12-Well-Platte TCTPS. Dies wird eine Kultur, die 50.000 Zellen in der Schale zu produzieren.
3. Platzieren der Zellkulturplatte in einem Inkubator bei 37 ° C für 2 Stunden.
4. Nach dem 2-stündigen Inkubation beginnen Timing; Konsistenz zwischen gedruckten und Aussaat Proben, wird dies als der Zeitpunkt 0 Stunden.

5. Kultur Visualisierung

1. Nach 0, 2, 24 und 48 h Aufnahmezellen von jeder der beiden Methoden doben und Bild escribed mit einem Standard-Umkehrmikroskop.
   1. Färben die Zellen mit Propidiumiodid, einen roten Fluoreszenzfarbstoff, der nur in den Zellkern von toten Zellen aufgenommen.
      1. Vorsichtig spülen die Zellen 3-mal mit 1 ml Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Calcium und Magnesium (PBS + +), um alle Ablagerungen zu entfernen.
      2. 1 ml vorgewärmtes PBS + + jedem Kulturgefäß.
      3. 1 &mgr; l Propidiumjodid-Stammlösung (1 mg / ml) zu jeder Kulturgefäß.
      4. Inkubieren der Zellen mit Propidiumiodid gefärbt bei 37 ° C für 10 min.
   2. Bild die Zellen mit einem inversen Mikroskop mit 10-facher und 40-facher Vergrößerung.
2. Entsorgen Sie die Zellen in einem geeigneten Behälter für biologischen.

Results

Die Fibroblasten-Zelllinie NIH/3T3-Zellen wurden gedruckt oder auf eine eingetauchte Oberfläche ausgesät. Die Zellen wurden in einer Dichte von 5 × 10 ⁴ Zellen pro ml gezüchtet. Zellen wurden mit herkömmlichen Zellkulturtechniken angeimpft. Zellen wurden unter Verwendung eines großformatigen, zwölf Druckkopf-Durchflusszelle, wo die Kanäle sind größer (~ 500 &mgr; m) als die CFM für Proteine ​​und andere Biomoleküle gedruckt. Die Zellen wurden aufgedruckt oder auf eine beschichtete Oberfläche Serum ausgesä...

Discussion

Die hier beschriebene 3D-Mikrofluid-Drucktechnologie ist einzigartig in der Lage, Druck mikrofluidisch Arrays von Zellen in einer Flüssigkeit gut gefüllt, dh ein unter Wasser Oberfläche. Durch Bedrucken untergetauchten Oberflächen können Zellmikroarrays erzeugt werden, die die physiologisch relevanten zellularen Phänotyps von Zellen als auch die Fähigkeit, Zellen in den Boden einer einzelnen Vertiefung 4 multiplexen aufrechtzuerhalten. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass mikrofluidisch Dr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kontinuierlicher Durchfluss-Microspotter	Wasatch Microfluidics
NIH/3T3-Zellen	ATCC	CRL-1658
Dubbleco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092	Basismedien für Zellen
HEPES-Puffer	Invitrogen	15630-080	Zellmedienadditiv (pH-Wert kontrollieren)
Natriumpyruvat	Invitrogen	11360-070	Zusatzstoff für Zellmedien
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen		Additiv für Zellmedien
Trypanblau	Invitrogen	15250-061	Färben von Zellen zum Zählen
Hämozytometer	Fisher	267110	Zellkammer zum Zählen von Zellen
Nikon Eclipse TS100	Nikon		Zur Überprüfung von Zellen
Nikon Eclipse TE2000-U	Nikon		Zum Sammeln von Bildern
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (mit Calcium und Magnesium)	Invitrogen	14040-133	Spülen der Zellen vor dem Passieren und vor der Färbung mit PI
TrypLE Express	Invitrogen	A12177-01	Zur Entfernung von Zellen von der Oberfläche