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Verwenden von Label-freien optischen Biosensoren zur Modulation von Kaliumkanälen durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren erkennen

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DOI:

10.3791/51307

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10. Februar 2014

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Yale School of Medicine, 2Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 3X-BODY Biosciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Optische Biosensor-Techniken können Massenänderungen in der Nähe der Plasmamembran in lebenden Zellen erkennen und erlauben es, zelluläre Reaktionen in beiden Einzelzellen und Zellpopulationen zu folgen. Dieses Protokoll wird die Detektion der Modulation von Kaliumkanälen durch G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in intakten Zellen unter Verwendung dieses Ansatzes zu beschreiben.

Zusammenfassung

Ionenkanäle steuern die elektrischen Eigenschaften von Neuronen und anderen Zelltypen erregbar durch selektives lonen durch die Plasmamembran 1 zu fließen. Neuronale Erregbarkeit Regelung sind die biophysikalischen Eigenschaften von Ionenkanälen von Signalproteinen und Moleküle, die häufig zu den Kanälen selbst binden, um einen heteromeren Komplex 2,3 Kanal bilden modifiziert. Traditionellen Tests die Wechselwirkungen zwischen den Kanälen und regulatorische Proteine ​​erfordern exogene Markierungen, die möglicherweise das Verhalten des Proteins zu verändern und eine Verringerung der physiologischen Relevanz der Ziel können, während sie nur wenig Informationen über den Zeitverlauf von Interaktionen in lebenden Zellen. Optische Biosensoren, wie der X-BODY BIND Biosciences Scanner-System, verwenden Sie eine neue Label-freie Technologie, Resonanzwellenlänge Gitter (RWG) optische Biosensoren, um Änderungen in der Resonanz erkennen reflektierte Licht in der Nähe des Biosensors. Dieser Assay ermöglicht die Detektion der relativenMassenänderung in dem Bodenabschnitt des lebenden Zellen anhaftend an der Biosensoroberfläche aus Ligand induzierte Veränderungen in der Zelladhäsion und Ausbreitung, Toxizität, Proliferation und Änderungen bei Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Nähe der Plasmamembran resultiert. RWG optische Biosensoren verwendet worden, um Änderungen in der Masse in der Nähe der Plasmamembran von Zellen nachzuweisen folgenden Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), Rezeptor-Tyrosinkinasen und andere Zelloberflächenrezeptoren. Ligand-induzierten Änderungen der Ionenkanal-Protein-Wechselwirkungen können auch in diesem Test untersucht werden. In diesem Aufsatz werden wir die experimentelle Verfahren verwendet, um die Modulation der Slack-B Natrium-aktivierten Kalium (K Na) Kanäle durch GPCRs erkennen beschreiben.

Einleitung

Untersuchung lebender Zellen in ihre physiologisch relevanten Kontext ist entscheidend für das Verständnis der biologischen Funktionen des zellulären Targets. Jedoch Assays die Wechselwirkungen zwischen den Kanälen und regulatorischen cytoplasmatischen Proteine, wie Coimmunpräzipitation Assays Allgemeinen bieten wenig Informationen über den Zeitverlauf von Interaktionen in lebenden Zellen. Die Mehrheit der derzeitigen Assays auf Zellbasis bei einem spezifischen zellulären Ereignis, wie die Translokation eines fluoreszenzmarkierten Proteins von Interesse. Diese Assays erfordern Modifikationen der Proteine ​​von Interesse, die möglicherweise das Verhalten des Proteins zu verändern, und eine Verringerung der physiologischen Relevanz der Ziel kann. Nichtinvasiven zellbasierte Tests, die nicht erfordern Manipulation des Systems, eine kontinuierliche Messung der Zellaktivität und damit Untersuchungen von Zellen in ihrer physiologisch relevanten Zustand 4.

Optische Biosensoren sind entworfen, um zu produziereneine meßbare Veränderung einer Eigenschaft des Lichts, das auf die Sensoroberfläche gekoppelt ist. Optische Biosensoren, die evaneszente Wellen verwenden, die Oberflächenplasmonresonanz (SPR) und die Resonanzwellenlänge Gitter (RWG) Techniken umfassen, sind in erster Linie verwendet, um die Affinität und Kinetik der Bindung an Moleküle, deren biologische Rezeptoren auf der Sensorfläche immobilisiert zu erfassen. In jüngerer Zeit, im Handel erhältlich RWG Biosensoren entwickelt worden, um die Erfassung der relativen Masseänderung in dem unteren Abschnitt der Zellen anhaftend an der Sensoroberfläche mit hoher räumlicher Auflösung (bis zu 3,75 &mgr; m / Pixel) 5 ermöglichen. Diese Biosensoren können Änderungen in der Masse in der Nähe der Plasmamembran lebender Zellen, die aus der Stimulation führen, wie z. B. die Zelladhäsion und Ausbreitung, Toxizität, Proliferation und Signalwegen von einer Vielzahl von Zelloberflächenrezeptoren, einschließlich G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) ausgelöst detektieren 6 . RWG Biosensoren erkennen die relative chanGE im Brechungsindex als Funktion der relativen Masseänderung innerhalb von 150 nm des Biosensors 7. Wenn Zellen auf die Biosensor zogen, diese Änderung in dem Brechungsindex spiegelt die Änderung der Masse in der Nähe der Plasmamembran der Zelle, die aus einer Änderung in der zellulären Anhaftung an den Biosensor ergibt. Dieses Protokoll ermöglicht den Nachweis von Kanal-Protein-Wechselwirkungen mit RWG Biosensoren diskutieren.

RWG Datenerfassungssysteme bestehen aus mehreren Komponenten. Da der X-BODY BIND Biosciences Scanner wurde für diese Experimente verwendet, sind wir auf die Komponenten für dieses besondere System, das aus einem Plattenlesegerät, verbunden Biosensoren, BIND Scan-Erfassungssoftware und Analyse-Software BIND anzeigen 8 besteht beziehen. Der photonische Kristall Biosensoren, die als optische Biosensoren bezeichnet, sind aus einer periodischen Anordnung aus einem dielektrischen Material und in 2 oder 3 Dimensionen, die die Ausbreitung von Licht in bestimmten verhindertWellenlängen und Richtungen. Photonische Kristallstrukturen sind auf einem Phänomen, das als Holz-Anomalie basiert. Zuerst von Holz 1902 entdeckt, diese Anomalien im Spektrum des Lichtes von optischen Beugungsgittern, wo schnelle Veränderungen in der Intensität eines bestimmten Beugungsordnungen unter bestimmten schmalen Frequenzbändern reflektiert beobachteten Effekte auftreten. Im Jahr 1962 Hessel und Oliner präsentiert eine neue Theorie der Wood-Anomalien in dem begrenzten Zeitraum Gitter erzeugt eine stehende Resonanzwellenlänge 9. In den hier beschriebenen optischen Biosensoren sind Wood-Anomalien verwendet, um einen Biosensor RWG erzeugen, wenn sie mit weißem Licht angeregt reflektiert nur sehr schmalen Band von Wellenlängen (in der Regel zwischen 850 bis 855 nm).

Individuelle Biosensoren bestehen aus einem niedrigen Brechungsindex Kunststoff mit einer periodischen Oberflächenstruktur, die mit einer dünnen Schicht des hochbrechenden dielektrischen Material, Titandioxid (TiO 2) beschichtet ist. Wenn die Biosensoder mit einem breiten Wellenlängenlichtquelle, das optische Gitter von photonischen Kristallen reflektiert einen engen Bereich von Wellenlängen von Licht, das mit einem Spektrophotometer in der BIND-Scanner gemessen wird, beleuchtet. Die Peak-Intensität der reflektierten Wellenlängen (Maximum-Wellenlänge Wert oder PWV) wird dann aus dem Signal berechnet. Die PWV Licht Verschiebungen bei einer Änderung des Brechungsindex infolge einer Erhöhung oder Verringerung der Masse in der Nähe (~ 150 nm) der Biosensoroberfläche. Optische Biosensoren werden in einem Standard-Gesellschaft für biomolekulare Wissenschaften (SBS) 384-Well-Mikroplatte für die in diesen Versuchen verwendeten Tests einbezogen.

RWV Biosensoren verwendet werden, um Änderungen bei der Zugabe von exogener Signale in lebenden Zellen 10 zu erfassen. Die Zellen werden direkt auf die Oberfläche eines RWG Biosensor kultiviert und die Änderung in der lokalen Brechungsindex ist bei der Behandlung mit spezifischen Stimuli überwacht. Die Richtung der Änderung der Masse an dem Biosensor kannbestimmt, da eine Erhöhung in der örtlichen Brechungsindex ergibt sich aus einer Zunahme der Masse in der Nähe des Biosensors und wird als Zunahme der PWV gemessen. Umgekehrt eine Abnahme der Masse zu einer Senkung des PWV. Die Änderung erfasst PWV können aus zahlreichen zellulären Ereignissen, einschließlich Änderungen bei der Zelladhäsion, Protein-Rekrutierung / release, Endozytose und Recycling, Exozytose, Apoptose und Zytoskelett-Umlagerung führen. Beispielsweise kann der Assay Änderungen Kanal-Protein-Wechselwirkungen zwischen Kaliumkanälen und anderen zytoplasmatischen oder Zytoskelett-Komponenten zu erfassen. Das Ereignis muß jedoch innerhalb des ~ 150 nm Detektionszone in der Nähe des Biosensors auf, und in dem Fall einer Zelle befestigt, in der Nähe der Plasmamembran. Akquisition von zellulären Antworten mit BIND Scan-Software durchgeführt, und eine Bilddarstellung von jeder der Vertiefungen 384 in dem SBS-Platte erzeugt wird. Dieses System hat eine Auflösung von bis zu 3,75 um / Pixel, was die Detektion von Ereignissen in einzelnen Zellen undentweder mit Zelllinien (wie HEK293 oder CHO-Zellen) oder mit physiologisch relevanten Primärzellen verwendet werden. Bildanalyse-Software BIND Ansicht erlaubt den Nachweis von zellulären Reaktionen in Einzel-und Zellpopulationen. Wie die Biosensoren sind in Standard-SBS 384-Well-Mikroplatten eingearbeitet, ist das System leicht an Hochdurchsatz-Screening (HTS).

Resonanz-Wellenlängengitter optische Biosensoren sind zuvor verwendet worden, um Änderungen in der Masse in der Nähe der Plasmamembran von Zellen nachzuweisen nach Aktivierung von GPCRs 11. Unser Labor hat zwei Natrium-aktiviert (K Na) Kaliumkanäle, Slack-B und Slick 12 geklont. Die Aktivität beider Slack-B-Kanäle und Slick hat sich gezeigt, sehr stark durch direkte Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) 13 beeinflusst werden. Aktivierung von G &agr; q-Protein-gekoppelten Rezeptoren, wie die Muscarin M1 Rezeptors und der mGluR1 metabotropen Glutamat receptor, potent regelt Kanalaktivität durch PKC-Aktivierung. Diese K-Na-Kanäle, um neuronale Anpassung beitragen bei anhaltender Stimulation und regulieren die Genauigkeit der Zeitpunkt der Aktionspotentiale 14. Slack Kanäle sind dafür bekannt, mit einer Vielzahl von Zytoplasma-Signalmoleküle, einschließlich FMRP, der Fragile X Mental Retardation Protein 15,16 interagieren. Mutationen in Slack Ergebnis in Multiple Migration Partielle Anfälle von Kindheit (MMPSI), ein frühes Einsetzen Form der Epilepsie, die zu schweren Entwicklungsverzögerung 17 führt.

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Protokoll

1. Zellkultur (von Fleming und Kaczmarek 18 Angepasst)

  1. Kulturzellen in geeigneten Medien für mehr als 2 und weniger als 10 Durchgänge vor der Verwendung in diesem Test. Nicht transfizierten HEK-293-Zellen und HEK-293-Zellen, die stabil Ratte Slack-B-Protein exprimieren, werden in einer Halb Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium und eine Hälfte Leibovitz L-15-Medium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und Antibiotika, gezüchtet. 500 ug / ml Geneticin (G418) in HEK-293-Zellen stabil exprimiert Slack-B, um die Expression des Gestänges Kanal auszuwählen aufgenommen. Passage-Zellen bei 70-90% Konfluenz durch die Dissoziation von Gerichten mit 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung.

2. Extrazellulären Matrix (ECM) Beschichtung der TiO 2-384-Well-Platte mit optischen Biosensor Fibronektin und Ovalbumin

  1. Vorbereitung der Fibronektin ECM Mischung und Ovalbumin Blockierungslösung
    1. Bereiten Sie eine Arbeitslösung fibronectin in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit einer Endkonzentration von 5 ug / ml Fibronektin in 20,0 ml PBS. Von einer 1,0 mg / ml Stammkonzentration, werden 100 ul auf 20,0 ml PBS für einen 200-fachen Verdünnung. Die Arbeitslösung von Fibronektin können aliquotiert und bei -20 ° C gelagert werden, nach der Herstellung.
    2. Eine 5% ige Stammlösung von hitzeinaktiviertem Ovalbumin in sterilem Wasser. Verdünnen Ovalbumin in sterilen Gewebekultur-Wasser für eine 5% ige Lösung und Wärme-Inaktivierung für 30 min bei 60 ° C Die Lösung wird auf Raumtemperatur und Sterilfilter die Lösung. Aliquot von 5% Ovalbumin-Lösung und bei 4 ° C
    3. Bereiten Sie eine 2% Arbeitslösung von Ovalbumin durch Verdünnen der 5% Stammlösung in PBS. Fügen Sie beispielsweise 12,0 ml 5% Ovalbumin-Stammlösung auf 18,0 ml PBS für ein Gesamtvolumen von 30,0 ml.
  2. 384er-optischen Biosensor Plattenbeschichtung
    1. Hydrat der TiO 2-Platte mit 20,0 ul /steriler Gewebekultur-Wasser für 15 min. Die folgenden Schritte sollten mit einem 16-Kanal-Pipette durchgeführt werden.
    2. Waschen Sie Platte 1x mit 50,0 ul PBS pro Vertiefung.
    3. In 20,0 ul der Fibronektin-Arbeitslösung in jede Vertiefung und Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur, um die ECM erstellen.
    4. Waschen Sie Platte 1x mit 50,0 ul PBS pro Vertiefung.
    5. In 40,0 ul der Ovalbumin Arbeitslösung in jede Vertiefung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C, um die Platte zu blockieren.
    6. Waschen Platte 3x mit 50,0 ul PBS pro Vertiefung. ECM-beschichtete Platten können bei 4 ° C für bis zu 48 Stunden gelagert werden.

3. Seeding der Zellen auf die 384-Well-Platte Optical Biosensor

  1. Entfernen Wachstumsmedium von den Zellen und fügen Trypsin, um die Zellen von der Platte zu entfernen. Sammeln Sie die Zellen und Zentrifugieren bei 1000 g für 1 min. Nehmen Sie die Medien Trypsin und resuspendieren Zellen in Wachstumsmedium.
  2. Mit einer Zählkammer oder eine automatisierteZellzählers, bestimmen die Konzentration der Zellen.
  3. Um die Wirkungen der Verdampfung während der Inkubation zu minimieren, werden 50,0 &mgr; l Wachstumsmedium pro Vertiefung eingesetzt werden. Zellen zu verdünnen, um die gewünschte Anzahl von Zellen pro Vertiefung in einem Volumen von 50,0 &mgr; l Wachstumsmedium zu erreichen. Für diese Experimente wurden 1000 Zellen / Vertiefung auf die Biosensor plattiert.
  4. Ermöglichen, dass die angesiedelten Zellen über Nacht in Wachstumsmedium bei 37 ° C unter Luft / 5% CO 2 inkubiert.

4. Vorbereitung der Biosensor-und Compound-Platten für die RWG optische Biosensor-Assay

  1. Die Platte aus dem Inkubator und entfernen Wachstumsmedium von den Zellen. Waschen Sie die Zellen 1x mit Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). In 25,0 ul HBSS in jede Vertiefung.
  2. Legen Sie die Platte auf dem Biosensor BIND Scanner und damit die Zellen auf Raumtemperatur für 1-2 Stunden ins Gleichgewicht.
  3. Bereiten Sie eine separate Verbindung Platte, von der Liganden von Interesse sein wird adauf den Biosensor Platte während des Assays ded. Für diese Tests wurden 25,0 ul einer Lösung, die Verbindung wurde in jede Vertiefung auf dem Biosensor Platte mit einem Gesamtvolumen von 50,0 ul zugesetzt. Als solche wurden die Verbindungen in Lösung in 2x die gewünschte endgültige Konzentration.

5. Führen Sie die RWG optische Biosensor-Assay

  1. Nehmen Sie eine Baseline-Messung mit dem Scannersystem für Brunnen A1-P12 (die Hälfte des SBS 384-Well-Platte) mit einer maximalen Auflösung von 3,75 um / Pixel für die zentralen 1,5 mm von jedem gut mit der Scan-Software BIND. Das Baseline-Untersuchung dauert etwa 30 Minuten dauern.
  2. In 25,0 ul der Verbindung Lösungen in jede Vertiefung für Brunnen A1-P12.
  3. Nehmen Sie eine Baseline-Messung von Brunnen A13-P24.
  4. In 25,0 ul der Verbindung Lösungen in jede Vertiefung für Brunnen A13-P24.
  5. Nehmen Sie einen Beitrag Verbindung zusätzlich Mess für Brunnen A1-P12, und wiederholen Sie für Brunnen A13-P24.

6. Analyse von Assay-Daten mit BIND anzeigen

  1. Öffnen Sie die BIND-Assay-Daten für die Baseline-Messung in Windows, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Raster-Editor", um Zellenauswahl zu ermöglichen. Die Software-Metriken von Interesse durch den Benutzer definiert zu berechnen.
  2. Öffnen Sie die "Plug-Ins", die den "Cell Finder"-Funktion und "Baseliner" enthalten. Satz Parameter in "Cell Finder", so dass die Zellen vom Hintergrund des Biosensors sind.
  3. Exportieren Sie die Zelle Map-Datei, die die Daten "Cell Finder" für die Baseline-Messung enthält.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 6,1-6,2 für Post-Verbindung zusätzlich Daten.
  5. Öffnen Sie die "Baseliner"-Plug-in und importieren Sie die Zelle Karte aus der Bestandsmessung. Die Software wird die Verschiebung in PWV zwischen den Hintergrund-und Post-Verbindung Daten zu berechnen.
  6. Option "Δ Zell Mittlere" für den Ausgang der Mittelwertverschiebung in PWV für Zellen. Die Daten können dann auf Microsoft Exc exportiert werdenel für die weitere Analyse.

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Ergebnisse

Slack-B stabil transfizierten HEK-293-Zellen und steuern nicht transfizierten HEK-293-Zellen wurden bei 1.000 Zellen / Well auf 384-Well-, ECM-beschichteten RWG Biosensor-Platten ausgesät. Bilder von der zentralen 1,5 mm 2 des Biosensors bei einer Auflösung von 3,75 &mgr; m / Pixel (Fig. 1) aufgezeichnet. Dichte Gradienten Karten von Massen erzeugt wurden vor und 30 min nach Zugabe der Verbindung mit der Scan-Software BIND. Die BIND-View-Software wurde verwendet, um die Verschiebung der P...

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Diskussion

Die Z prime (Z ')-Faktor ist ein gemeinsame statistische Methode, um die Qualität eines Hochdurchsatz-Screening-Assay 20 quantifizieren und da die Abschirmung der GPCR-Agonisten in diesem Assay erfolgte in einem SBS-kompatiblen 384-Well-Assay bietet eine hervorragende Maß für die Robustheit und Gültigkeit dieser Assay 21. AZ "-Wert von 1 bedeutet eine theoretisch ideale Test mit einer unendlichen Anzahl von Datenpunkten mit nicht vorhandenen Standardabweichungen. AZ "-Wert zwischen 0,...

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Offenlegungen

Steven M. Shamah ist Mitarbeiter von X-BODY Biosciences.

Danksagungen

Die Autoren danken Herrn Dr. Yangyang Yan im Labor von Dr. Fred Sigworth an der Yale University für die großzügige Spende von HEK293-Zellen, die stabil Ratte Slack-B-Protein exprimieren. Zusätzlich werden die Autoren danken Dr. Sigworth für Kryo-Elektronenmikroskopie Homologiemodell von Slack in dem Video Einführung angezeigt. Diese Forschung wurde von NIH Grants DH067517 und NS073943 zu LKK unterstützt

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEM, High GlucoseLife Technologies11965-092
Leibovitz's L-15 MediumLife Technologies11415-064
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Life Technologies15140-122
Geneticin G-418 SulfatAmerican BioanalyticalAB05057
HBSSLife Technologies14025-092
Fibronektin aus menschlichem PlasmaSigma-AldrichF0895
Albumin aus HühnereiweißSigma-AldrichA5378
DPBSLife Technologies14190-144
Hausser Bright-Line Phase HämozytometerFisher Scientific02-671-6
CarbamoylcholinchloridSigma-AldrichC4382
SFLLR-NH2 TrifluoracetatsalzSigma-AldrichS8701
Finnpipette (5-50 µ l)Thermo Scientific4662090
BIND Scanner SystemX-BODY BiosciencesN/A
384-Well TiO2 beschichtete PlattenX-BODY BiosciencesTiO-96-CM

Referenzen

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GPCR Kaliumkan leResonanzwellenl ngengitterSlack B Kan leHEK 293 ZellenProtein Protein InteraktionenMassenverschiebungsdetektionEchtzeit SignalisierungZelladh sions nderungenHigh Throughput Screening

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