Optische Biosensor-Techniken können Massenänderungen in der Nähe der Plasmamembran in lebenden Zellen erkennen und erlauben es, zelluläre Reaktionen in beiden Einzelzellen und Zellpopulationen zu folgen. Dieses Protokoll wird die Detektion der Modulation von Kaliumkanälen durch G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in intakten Zellen unter Verwendung dieses Ansatzes zu beschreiben.
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Methodenartikel
Verwenden von Label-freien optischen Biosensoren zur Modulation von Kaliumkanälen durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren erkennen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ionenkanäle steuern die elektrischen Eigenschaften von Neuronen und anderen Zelltypen erregbar durch selektives lonen durch die Plasmamembran 1 zu fließen. Neuronale Erregbarkeit Regelung sind die biophysikalischen Eigenschaften von Ionenkanälen von Signalproteinen und Moleküle, die häufig zu den Kanälen selbst binden, um einen heteromeren Komplex 2,3 Kanal bilden modifiziert. Traditionellen Tests die Wechselwirkungen zwischen den Kanälen und regulatorische Proteine erfordern exogene Markierungen, die möglicherweise das Verhalten des Proteins zu verändern und eine Verringerung der physiologischen Relevanz der Ziel können, während sie nur wenig Informationen über den Zeitverlauf von Interaktionen in lebenden Zellen. Optische Biosensoren, wie der X-BODY BIND Biosciences Scanner-System, verwenden Sie eine neue Label-freie Technologie, Resonanzwellenlänge Gitter (RWG) optische Biosensoren, um Änderungen in der Resonanz erkennen reflektierte Licht in der Nähe des Biosensors. Dieser Assay ermöglicht die Detektion der relativenMassenänderung in dem Bodenabschnitt des lebenden Zellen anhaftend an der Biosensoroberfläche aus Ligand induzierte Veränderungen in der Zelladhäsion und Ausbreitung, Toxizität, Proliferation und Änderungen bei Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Nähe der Plasmamembran resultiert. RWG optische Biosensoren verwendet worden, um Änderungen in der Masse in der Nähe der Plasmamembran von Zellen nachzuweisen folgenden Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), Rezeptor-Tyrosinkinasen und andere Zelloberflächenrezeptoren. Ligand-induzierten Änderungen der Ionenkanal-Protein-Wechselwirkungen können auch in diesem Test untersucht werden. In diesem Aufsatz werden wir die experimentelle Verfahren verwendet, um die Modulation der Slack-B Natrium-aktivierten Kalium (K Na) Kanäle durch GPCRs erkennen beschreiben.
Einleitung
Untersuchung lebender Zellen in ihre physiologisch relevanten Kontext ist entscheidend für das Verständnis der biologischen Funktionen des zellulären Targets. Jedoch Assays die Wechselwirkungen zwischen den Kanälen und regulatorischen cytoplasmatischen Proteine, wie Coimmunpräzipitation Assays Allgemeinen bieten wenig Informationen über den Zeitverlauf von Interaktionen in lebenden Zellen. Die Mehrheit der derzeitigen Assays auf Zellbasis bei einem spezifischen zellulären Ereignis, wie die Translokation eines fluoreszenzmarkierten Proteins von Interesse. Diese Assays erfordern Modifikationen der Proteine von Interesse, die möglicherweise das Verhalten des Proteins ....
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Protokoll
1. Zellkultur (von Fleming und Kaczmarek 18 Angepasst)
- Kulturzellen in geeigneten Medien für mehr als 2 und weniger als 10 Durchgänge vor der Verwendung in diesem Test. Nicht transfizierten HEK-293-Zellen und HEK-293-Zellen, die stabil Ratte Slack-B-Protein exprimieren, werden in einer Halb Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium und eine Hälfte Leibovitz L-15-Medium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und Antibiotika, gezüchtet. 500 ug / ml Geneticin (G418) in HEK-293-Zellen stabil exprimiert Slack-B, um die Expression des Gestänges Kanal auszuwählen aufgenommen. Passage-Zellen bei 70-90% Konfluenz durch die Dissoziation von Ger....
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Ergebnisse
Slack-B stabil transfizierten HEK-293-Zellen und steuern nicht transfizierten HEK-293-Zellen wurden bei 1.000 Zellen / Well auf 384-Well-, ECM-beschichteten RWG Biosensor-Platten ausgesät. Bilder von der zentralen 1,5 mm 2 des Biosensors bei einer Auflösung von 3,75 &mgr; m / Pixel (Fig. 1) aufgezeichnet. Dichte Gradienten Karten von Massen erzeugt wurden vor und 30 min nach Zugabe der Verbindung mit der Scan-Software BIND. Die BIND-View-Software wurde verwendet, um die Verschiebung der P.......
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Diskussion
Die Z prime (Z ')-Faktor ist ein gemeinsame statistische Methode, um die Qualität eines Hochdurchsatz-Screening-Assay 20 quantifizieren und da die Abschirmung der GPCR-Agonisten in diesem Assay erfolgte in einem SBS-kompatiblen 384-Well-Assay bietet eine hervorragende Maß für die Robustheit und Gültigkeit dieser Assay 21. AZ "-Wert von 1 bedeutet eine theoretisch ideale Test mit einer unendlichen Anzahl von Datenpunkten mit nicht vorhandenen Standardabweichungen. AZ "-Wert zwischen 0,.......
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Offenlegungen
Steven M. Shamah ist Mitarbeiter von X-BODY Biosciences.
Danksagungen
Die Autoren danken Herrn Dr. Yangyang Yan im Labor von Dr. Fred Sigworth an der Yale University für die großzügige Spende von HEK293-Zellen, die stabil Ratte Slack-B-Protein exprimieren. Zusätzlich werden die Autoren danken Dr. Sigworth für Kryo-Elektronenmikroskopie Homologiemodell von Slack in dem Video Einführung angezeigt. Diese Forschung wurde von NIH Grants DH067517 und NS073943 zu LKK unterstützt
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfat | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| Fibronektin aus menschlichem Plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Albumin aus Hühnereiweiß | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hämozytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholinchlorid | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 Trifluoracetatsalz | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette (5-50 µ l) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384-Well TiO2 beschichtete Platten | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
Referenzen
- Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates. (1992).
- Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
- Levitan, I. B.
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Nachdrucke und Genehmigungen
