Methodenartikel

Neonatal Pial Oberflächen Elektroporation

DOI:

10.3791/51319

⸱

7. Mai 2014

 ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Sciences, Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Pia-Oberfläche ist eine einzigartige Vorläuferzone im ZNS, die Aufnahme wird immer mehr Aufmerksamkeit. Hier erläutern wir ein Verfahren für schnelle genetische Manipulation dieser Vorläuferzone unter Verwendung einer modifizierten Methode der Elektroporation. Dieses Verfahren kann für zelluläre und molekulare Untersuchungen der Zelllinien und Signalwegen in der Zelldifferenzierung beteiligt sind, verwendet werden, um das Schicksal und die Eigenschaften von Tochterzellen zu erklären.

Zusammenfassung

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In den vergangenen Jahren ist der Pia-Oberfläche wurde als Keim Nische von Bedeutung bei der Embryonalentwicklung, perinatale und Erwachsenen Neuro-und Gliogenese identifiziert worden, darunter nach der Verletzung. Allerdings Verfahren zur genetischen Abfrage diese Vorläufer Bevölkerung und die Verfolgung ihrer Abstammungslinien beschränkt hatte aufgrund einer mangelnden Spezifität oder zeitaufwendig Produktion von Viren. So hat die Fortschritte in diesem Bereich mit nur einer Handvoll von Untersuchungen dieser Lage relativ langsam. Elektroporation ist seit über einem Jahrzehnt in der postnatalen Gehirn eingesetzt, um neurale Stammzelleigenschaften im Embryo zu studieren, und in jüngerer Zeit. Hier beschreiben wir eine effiziente, schnelle und einfache Technik für die genetische Manipulation von Pia-Oberfläche Vorläuferzellen auf Basis eines angepassten Ansatz Elektroporation. Pia-Oberfläche Elektroporation ermöglicht einfache genetische Kennzeichnung und Manipulation dieser Vorläuferzellen und damit zu einer zeitsparende und wirtschaftliche Lösung für das Studium dieser Zellen.

Einleitung

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Neuralen Stamm-und Vorläuferzellen sind in der gesamten Säugetier-ZNS-1, 2. Art und Eigenschaften der embryonalen und adulten Keimzonen um die ventrikulären Regionen des Gehirns und des Rückenmarks sind ausführlich in den letzten zehn Jahren 1-3 dokumentiert. Zum großen Teil ist dies auf die Entwicklung von immer präzise genetische Werkzeuge, wie das Nervensystem spezifische Cre Rekombination von floxed Allele oder retroviral-Linie 4 Verfolgung gewesen. Allerdings ist eine Vorläuferregion-Pia-Oberfläche der Vorläufer-Zone hat erst vor kurzem im Detail 7.5 beschrieben und erwartet umfassende Untersuchung.

Der Pia-Oberfläche des Gehirns wird als die Schnittstelle zwischen der Oberfläche des Gehirns und der Hirnhaut umgebenden 8 definiert. Während der Entwicklung neuroepithelialen und später radiale Gliazellen Ende Füßen befestigen zu dieser Fläche 9,10. Einige der Tannest Neuronen im Gehirn und viele neuronale Mitosen in diesem Bereich 11 beobachtet. Später, während der embryonalen Neurogenese, kortikale Inter sind bekannt, die Pia-Region durchqueren, zusätzlich zu ihren Migrationsrouten in der Zwischenzone und Subventrikularzone 12-14. Während dieser Zeit können Stammzellen aus diesem Bereich kultiviert werden, und es scheint eine aktive Stelle des Neuro-und Gliogenese 5 sein. Im erwachsenen Gehirn, wurde berichtet, dass Inter kann von Pia-Oberfläche Vorfahren folgenden hypoxischen Herausforderung 7 geboren werden. Allerdings ist die Beteiligung der Region an, um seine während der embryonalen und postnatalen Entwicklung genensis hat obskuren Teil auf die Schwierigkeit, die speziell der Untersuchung dieser Region 6 geblieben. In den Colliculus superior und in der Großhirnrinde kann oberflächlich (oder Schicht I in der Rinde) Inter den Schaltungsausgang der zugrunde liegenden erregenden Neuronenpopulationen zu modulieren und damit beitragen significantly der Funktion dieser Strukturen. Insbesondere sind Schicht ein Inter in bester Lage, das Feuern von Neuronen in den oberen Schichten der Hirnrinde angesichts ihrer umfangreichen Konnektivität zu den oberflächlichen und tiefen Schichten der kortikalen Säulen 15,16 regulieren. In ähnlicher Weise erhalten horizontalen Inter erregenden Input von kortikalen und Netzhautfasern, Projekt über einen relativ weiten Bereich und spekuliert auf die Hemmung der neuronalen Populationen Reaktion auf visuelle Reize Fern 17,18 vermitteln. Auch ist ihre Morphologie gut geeignet, um eine mögliche Rolle in der strukturierten Wellenaktivität in den Entwicklungs visuelle System 19 spielen. Interessanterweise Intern Entwicklung und Reifung geschieht zu einem großen Teil postnatal. Ferner kann dieser Reifungsprozess wurde festgestellt, durch neuronale Aktivität reguliert werden und ist somit ein Substrat der Plastizität mit lebenslangen Folgen für Schaltungsfunktion 20,21. Insbesondere no Promotoren beschrieben, die gezielt können diese Zellen transgen. Die Aufteilung Vorfahren mit Retrovirus 7 richtet werden, aber die Virusproduktion ist zeitaufwendig und erfordert Geschick, um die hohe Titer für die Zellübertragung notwendig ergeben.

Elektroporation hat zu einer Renaissance in der Studie der Entwicklung des Nervensystems geführt, wie es ermöglicht eine schnelle und effiziente Abfrage der genetischen Signalwege in neuronalen Vorläuferzellen 4, 22, 23. Die Elektroporation umfasst die Injektion von Plasmid-DNA, gefolgt von der Abgabe von elektrischen Impulsen an die Außenseite des Kopfes, um in einer Richtung in die proliferierenden Vorläuferzellen umgibt die Kammern 4, 22, 23 treiben die DNA. Elektroporation scheint Transitzellen durch M-Phase des Zellzyklus für die Expression von Transgenen Plasmid 24 erforderlich. Insbesondere wurde gefunden, dass nurZellen, die durch M-Phase innerhalb von 8 Stunden der Elektroporation von Plasmiden wird Transgene trotz ihrer wirksamen Zustellung an alle Zellen innerhalb von ~ 160 um der Kammerwand 24 zum Ausdruck bringen. Es wird spekuliert, dass dies in Berücksichtigung Kern Zugang der episomalen Plasmiden aufgrund der Notwendigkeit für die Kernhülle Bruch, Chemikalien verursacht Kern Permeabilisierung kann die Expression von Plasmiden, die in der Post mitotischen Zellen 25 zu induzieren. Ursprünglich in der Embryo-22 verwendet, Elektroporation wurde für den Einsatz in der postnatalen Gehirn viel später 26, 27 angepasst. Kürzlich haben wir Elektroporation zur Verwendung bei der genetischen Manipulation von Pia-Oberfläche Vorläufer 6 angepasst. Weitere, mit diesem Ansatz haben wir gezeigt, dass es offenbar zwei verschiedene Linien der Vorfahren in dieser Region und Astrozyten-intern 6. Dieses Protokoll Details eine einfache, schnelle und leistungsfähige Methode, um diese Zellen für die Abfrage Zielder Mechanismen, die Entwicklung dieser Zellen.

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Protokoll

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Dieses Verfahren ist in Übereinstimmung mit Cedars-Sinai IACUC Anforderungen. Die Ermittler sollten institutionelle IACUC Einhaltung zu gewährleisten, bevor Sie fortfahren. Alle Werkzeuge und Reagenzien sollten vor der Verwendung sterilisiert werden.

1. Vorbereitung der Werkzeuge, Lösungen und DNA-Gemisch

  1. Legen Sie 100-mm feuerpolierte Borosilikatglas Kapillaren in einer Mikropipette Puller. Stellen Heizung für Standard-gewichtete Pull ermöglichen Pipettenspitze von ca. 17,5 mm bilden. Schneiden mit scharfen Spitzen chirurgische Schere in einem Abstand etwa 8-9 mm von Anfang an der Spitze auf rund ein Mikrometer Durchmesser Öffnung 100 erstellen.
  2. Es wird in eine Aktien 1% w / v schnelle grüne Lösung durch Mischen gefiltert Nuklease-freies Wasser (unter Verwendung eines 20-um-Spritzenfilter) mit trockenem schnell grün.
  3. Isolieren gereinigtes Endotoxin-freiem Plasmid-DNA, die hoch konzentriert ist (dh> 3 ug / ul), in Tris-EDTA (TE)-Puffer verdünnt. In gewünschten Mengen Plasmid-Mischung, um in TE-Puffer verdünnt und fügen eine 1:10-Verhältnis der 1% schnell grün-Lösung (Herstellung einer 0,1% w / v Endkonzentration von schnell grün). Verwenden Sie ein 0,5-2,0 ug / ul Endkonzentration von Plasmid für die Expression von Transgenen robust.

2. Tier Anästhesie, Pipette Laden und Pia-Oberfläche Plasmid-Injection

  1. Induzieren Hypothermie Narkose auf 1-2 Tage postnatalen Mäusen, indem sie auf einer Petrischale, die auf Eis für 5-8 min (Zeit abhängig vom Alter Welpe / Gewicht) platziert wird. Sobald Hypothermie wird durch Mangel an Bewegung von den Zehen-Quetsch-und / oder Schwanzreflex bestätigt, sind die Mäuse bereit, eingespritzt werden. Zeigen Tiere zurück auf dem Eis, wenn Schmerzen Reflexe sind offensichtlich. Der Einspritzverfahren und Elektroporation in weniger als 2-3 Minuten insgesamt so Zeit die Hypothermie, Injektion und Elektroporation Verfahren entsprechend geeignete Anästhesie zu halten.
  2. Während der Narkose, mit einem Standard-Pipette vorsichtig Pipette gewünschte Menge plasmid mischen, um auf ein Stück Paraffinwachs Film als Referenz eingespritzt werden (0,5-2 ul). Hier wird ein Gesamtvolumen von 0,5 ul Plasmid Mischung injiziert. Als nächstes mit einem Mikro-Injektor, sorgfältig zusammengebaut einfügen Glaskapillare Pipette in Röhrchen mit Plasmid-Gemisch. Nehmen Sie zusätzliche Vorsichtsmaßnahme, um die Spitze zu brechen, indem sie verhindern, dass es nicht die Ränder der Röhre berühren. Saugen Sie die Lösung in die Pipette langsam durch die Übertragung der Wahl zurück Zifferblatt. Sobald ein ausreichendes Volumen hat, in die Pipette eingelegt wurde, wählen vorne, bis der Druck wieder in die Neutralposition von 0 hPa.
  3. Mit 300 bis 450 hPa Druck zur Injektion geeignete Druck für gleichmäßige Befüllung des Pia-Oberfläche / meningealen Raum zu gewährleisten, stellen Sie die Spitze in der Nähe des pipettierte Paraffinwachs Film Bezugseinspritzung (ab 2.2) und verwenden Sie das Pedal von der Mikro-Injektor, um ein Auswerfen Volumens auf den Paraffinfilm. Stellen Sie den Druck entsprechend, bis die Menge ausgestoßenen entspricht der zuvor pipettiert referencE Lautstärke.
  4. Sobald die Spitze wurde ins Gleichgewicht gebracht und Anästhesie wurde bestätigt, sind die Welpen bereit, eingespritzt werden.
  5. Das Ziel des Versuchs ist es, die Plasmid-Mischung unter dem Schädel und oberhalb der Pia-Oberfläche zu injizieren, um für die Elektroporation von DNA nach unten in die Pia-Oberfläche Vorläuferzellen (1A) zu erlauben. Für Kortex Injektionen, halten Sie den Welpen nach unten mit dem Daumen und Zeigefinger der weniger dominanten Hand. Die kortikalen Hemisphären und andere Oberflächenstrukturen wie beispielsweise die überlegene colliculi zwischen P0 und P2 sichtbar, so dass für einfache Ausrichtung dieser Strukturen (Abbildung 1B). Mit der dominanten Hand und Ziel gewünschten Bereich des Kortex (dh Motor, somatosensorischen, etc.), legen Pipette an der Haut und Schädel wobei darauf zu Hirnarterien zu vermeiden. Sicherstellen, dass ein weiteres Eindringen der Spitze an der Schädel (was durch das Fehlen von weiteren Widerstand nur nach Durchstechen des Schädels angedeutet ist) zu verhindern.
  6. Inject PlasmaID-Lösung unter Verwendung des Fußpedals der Mikro-Injektor und sicherzustellen, dass es gleichmäßig verteilt über das Gewebe (Abbildung 2A).
    Hinweis: Es ist sehr wichtig, um einen Ansatz, der Plasmid-Lieferung maximiert, während die Vermeidung Hämatom aufgrund des Flüssigkeitsdrucks empirisch zu bestimmen. Dies kann durch Einstellen der Dauer der Einspritzung, wobei der Winkel, der Lautstärke und der genaue Zielort Gefäßstörungen zu vermeiden erfolgen.
  7. Seien Sie sicher, dass Sie versuchen, und halten Sie die Spitze vor dem Austrocknen in zwischen den Injektionen indem Sie die Spitze im Testtröpfchen von Injektionen zuvor auf Wachs-Papier-oder Kunststoffparaffinfilm. Dies ist erforderlich, um Spitzen Akkumulation verdampft und kristallisiert DNA-Lösung, die die Verstopfung der Spitze und inkonsistent Liefermengen führen können, zu verhindern.

3. Elektroporation

  1. Stellen Sie die Electroporator auf 135-150 V für fünf Impulse, dauerhafte 50 ms, 950 ms mit Abständen zwischen jedem Puls. Um Leitfähigkeit zu erhöhen undverhindern, Brennen der Haut, bedecken 3-mm-Platin tweezertrodes Elektroporation mit Gel. Check für toe-Quetsch-und Heck Reflexe an dieser Stelle auf die Anästhesie zu gewährleisten. Wenn anspricht, setzen auf Eis für einige Minuten zu betäuben.
  2. Für Kortex (und Colliculus superior) Injektionen, verwenden eine 3-mm-Elektrode (2B), um die Lebensfähigkeit der Jungtiere zu erhöhen (im Vergleich mit der 7 - und 10-mm-Elektroden, die für ventrikuläre Zone Elektroporation verwendet werden). Platzieren der negativ geladene Sonde der Elektrode über der Injektionsstelle und dem positiv geladenen Sonde auf der kontralateralen Bereich unterhalb des Auges, so daß die Elektrodenausrichtung bei einem 45-60 °-Winkel relativ zu der Mittellinie (Fig. 2C).
  3. Verwenden Sie das Fußpedal der Elektroporator auslösen Strom und halten tweezertrodes in Platz für 3-5 Impulse, je nach Alter und Gewicht Welpe, effektiv Targeting-DNA in Zellen zugrunde liegenden Pia-Oberfläche bei der Bilanzierung von Krümmungder Halbkugeln.
    Hinweis: Der negative Pol auf die Injektionsbereich zwischen den Impulsen oder eine größere Elektrode eingesetzt, um den Bereich zu erhöhen Elektroporation werden gekehrt werden.
  4. Unmittelbar nach der Elektroporation, sorgfältig säubern Gel aus Welpen und sie unter einer Wärmelampe für ca. 5 min.
  5. Pups wird akut verlieren ihre natürliche rötlich-rosa Farbton in den Minuten nach der Elektroporation durch Zyanose. Beachten Sie die Welpen für die Wiederherstellung der natürlichen Farbe und der Einleitung der normalen Bewegung, bevor sie dann wieder in ihre Käfige.
  6. Stellen Sie sicher, Resozialisierung mit der Mutter durch die Beobachtung, ob sie bringt die Welpen zurück ins Nest und beginnt, sie zu pflegen. Wenn sie aggressiv wird, stellen Sie sicher, dass Welpen nicht haben Reste von Gel und bebrüten sie mit einigen der Bettwäsche, den Geruch, um die Welpen übertragen.

4. Modifikationen für Targeting der Superior-Colliculi

Targeting:

  1. Inject der Colliculus superior in der gleichen Weise wie die Rinde, aber beachten Sie, dass der Zielbereich liegt nur posterior und lateral Lambda und etwa an der Mittellinie (3A und 3B). Mit der erfolgreichen Injektionen, die Plasmid-Mix natürlich füllt die Konturen des Colliculus superior. Sobald Injektionen wurden erfolgreich gemacht, sind Tiere, bereit für die Elektroporation.

Elektroporation:

  1. In einer sehr ähnlichen Weise für Colliculus superior Injektionen, platzieren Sie den negativ geladenen Sonde der Elektrode über der Injektionsstelle und dem positiv geladenen Sonde um das Auge, Schnauze oder Kinn, Fahr DNA in den oberflächlichen Regionen des Colliculus superior (3C) . In diesem Fall ist die Elektrodenausrichtung bei einer 25-40 °-Winkel relativ zu der Mittellinie.

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Ergebnisse

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Pia-Oberfläche Elektroporation führt zur Expression von Plasmid-DNA in Zellen-Vorläufer-meist an oder nahe der Pia-Oberfläche 6. Genauer gesagt, ist die Orientierung der Elektroden kritisch diktiert die Richtung der Bewegung Plasmid und anschließende Expression. Somit wird in Doppelelektrodenkonfigurationen, das Plasmid in etwa einer geraden Vektor zwischen dem negativen und positiven Elektrode gerichtet. Deshalb, wenn der negative Pol wird über die Injektionsstelle gelegt und der positive Pol ventral mit dem...

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Diskussion

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Der wichtigste Aspekt für die erfolgreiche Elektroporation von Pia-Oberfläche Vorläufer sind: 1) Targeting-Plasmid Mischung der Pia-Oberfläche; 2) Verhinderung der Entstehung von Hämatomen an der Injektionsstelle; und 3) die Vermeidung von Sterblichkeit, die mit Mittelhirn Elektroporation verbunden.

Geeigneter Ausrichtung der Pia-Oberfläche wird gemessen und sorgfältige Punktierung des Schädels erreicht, um das Eindringen der Pia-Oberfläche zu vermeiden. 1) Verschiebung der schnellen grünen ...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

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Die Autoren möchten die Unterstützung der Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute Cancer Research Forum Award sowie Mittel aus dem Institut für Regenerative Medizin Cedars-Sinai und der Guerin Familie anzuerkennen. Das beschriebene Projekt wurde in Form einer CTSI Core-Gutschein vom National Center for Research Resources, Grant UL1RR033176 finanziert unterstützt und ist jetzt in der National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Feuerpolierte BorosilikatrohreWorld Precision Instruments, Inc.1B100F-4
MikropipettenabzieherSutter Instruments CompanyP-30
Fast Green FCFSigma Aldrich, Inc.F7528
XenoWorks Digitaler MikroinjektorSutter Instruments Unternehmen
ECM 830 GeneratorHarvard Apparat, BTX Instrument Div45-0052
3-mm-PlatinpinzetteHarvard Apparat, BTX Instrument Div45-0487
SignaGel ElektrodengelCardinal Health70315-025
Tris-EDTA Puffer, pH 8,0Integrated DNA Technologies, Inc.11-01-02-05
Infrarot-WärmelampeVWR36547-009
Feine Schere ScharfeFeine WissenschaftWerkzeuge 14060-09

Referenzen

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Neonatales GehirnGenetische ManipulationPlasmidinjektionElektroporationstechnikNeurale ProgenitorzellenMeningealraumGlaspipetteMikroinjektorPlatinpinzette

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