Methodenartikel

Neonatal Pial Oberflächen Elektroporation

DOI:

10.3791/51319

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7. Mai 2014

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1Department of Neurosurgery, Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Sciences, Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Pia-Oberfläche ist eine einzigartige Vorläuferzone im ZNS, die Aufnahme wird immer mehr Aufmerksamkeit. Hier erläutern wir ein Verfahren für schnelle genetische Manipulation dieser Vorläuferzone unter Verwendung einer modifizierten Methode der Elektroporation. Dieses Verfahren kann für zelluläre und molekulare Untersuchungen der Zelllinien und Signalwegen in der Zelldifferenzierung beteiligt sind, verwendet werden, um das Schicksal und die Eigenschaften von Tochterzellen zu erklären.

Zusammenfassung

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In den vergangenen Jahren ist der Pia-Oberfläche wurde als Keim Nische von Bedeutung bei der Embryonalentwicklung, perinatale und Erwachsenen Neuro-und Gliogenese identifiziert worden, darunter nach der Verletzung. Allerdings Verfahren zur genetischen Abfrage diese Vorläufer Bevölkerung und die Verfolgung ihrer Abstammungslinien beschränkt hatte aufgrund einer mangelnden Spezifität oder zeitaufwendig Produktion von Viren. So hat die Fortschritte in diesem Bereich mit nur einer Handvoll von Untersuchungen dieser Lage relativ langsam. Elektroporation ist seit über einem Jahrzehnt in der postnatalen Gehirn eingesetzt, um neurale Stammzelleigenschaften im Embryo zu studieren, und in jüngerer Zeit. Hier beschreiben wir eine effiziente, schnelle und einfache Technik für die genetische Manipulation von Pia-Oberfläche Vorläuferzellen auf Basis eines angepassten Ansatz Elektroporation. Pia-Oberfläche Elektroporation ermöglicht einfache genetische Kennzeichnung und Manipulation dieser Vorläuferzellen und damit zu einer zeitsparende und wirtschaftliche Lösung für das Studium dieser Zellen.

Einleitung

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Neuralen Stamm-und Vorläuferzellen sind in der gesamten Säugetier-ZNS-1, 2. Art und Eigenschaften der embryonalen und adulten Keimzonen um die ventrikulären Regionen des Gehirns und des Rückenmarks sind ausführlich in den letzten zehn Jahren 1-3 dokumentiert. Zum großen Teil ist dies auf die Entwicklung von immer präzise genetische Werkzeuge, wie das Nervensystem spezifische Cre Rekombination von floxed Allele oder retroviral-Linie 4 Verfolgung gewesen. Allerdings ist eine Vorläuferregion-Pia-Oberfläche der Vorläufer-Zone hat erst vor kurzem im Detail 7.5 beschrieben und erwartet umfassende Untersuchung.

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Protokoll

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Dieses Verfahren ist in Übereinstimmung mit Cedars-Sinai IACUC Anforderungen. Die Ermittler sollten institutionelle IACUC Einhaltung zu gewährleisten, bevor Sie fortfahren. Alle Werkzeuge und Reagenzien sollten vor der Verwendung sterilisiert werden.

1. Vorbereitung der Werkzeuge, Lösungen und DNA-Gemisch

  1. Legen Sie 100-mm feuerpolierte Borosilikatglas Kapillaren in einer Mikropipette Puller. Stellen Heizung für Standard-gewichtete Pull ermöglichen Pipettenspitze von ca. 17,5 mm bilden. Schneiden mit scharfen Spitzen chirurgische Schere in einem Abstand etwa 8-9 mm von Anfang an der Spitze auf rund ein Mikrometer Durchmesser Öff....

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Ergebnisse

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Pia-Oberfläche Elektroporation führt zur Expression von Plasmid-DNA in Zellen-Vorläufer-meist an oder nahe der Pia-Oberfläche 6. Genauer gesagt, ist die Orientierung der Elektroden kritisch diktiert die Richtung der Bewegung Plasmid und anschließende Expression. Somit wird in Doppelelektrodenkonfigurationen, das Plasmid in etwa einer geraden Vektor zwischen dem negativen und positiven Elektrode gerichtet. Deshalb, wenn der negative Pol wird über die Injektionsstelle gelegt und der positive Pol ventral mit dem.......

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Diskussion

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Der wichtigste Aspekt für die erfolgreiche Elektroporation von Pia-Oberfläche Vorläufer sind: 1) Targeting-Plasmid Mischung der Pia-Oberfläche; 2) Verhinderung der Entstehung von Hämatomen an der Injektionsstelle; und 3) die Vermeidung von Sterblichkeit, die mit Mittelhirn Elektroporation verbunden.

Geeigneter Ausrichtung der Pia-Oberfläche wird gemessen und sorgfältige Punktierung des Schädels erreicht, um das Eindringen der Pia-Oberfläche zu vermeiden. 1) Verschiebung der schnellen grünen .......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

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Die Autoren möchten die Unterstützung der Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute Cancer Research Forum Award sowie Mittel aus dem Institut für Regenerative Medizin Cedars-Sinai und der Guerin Familie anzuerkennen. Das beschriebene Projekt wurde in Form einer CTSI Core-Gutschein vom National Center for Research Resources, Grant UL1RR033176 finanziert unterstützt und ist jetzt in der National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Feuerpolierte BorosilikatrohreWorld Precision Instruments, Inc.1B100F-4
MikropipettenabzieherSutter Instruments CompanyP-30
Fast Green FCFSigma Aldrich, Inc.F7528
XenoWorks Digitaler MikroinjektorSutter Instruments Unternehmen
ECM 830 GeneratorHarvard Apparat, BTX Instrument Div45-0052
3-mm-PlatinpinzetteHarvard Apparat, BTX Instrument Div45-0487
SignaGel ElektrodengelCardinal Health70315-025
Tris-EDTA Puffer, pH 8,0Integrated DNA Technologies, Inc.11-01-02-05
Infrarot-WärmelampeVWR36547-009
Feine Schere ScharfeFeine WissenschaftWerkzeuge 14060-09

Referenzen

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  1. Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
  2. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A.

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Schlagwörter

Neonatales GehirnGenetische ManipulationPlasmidinjektionElektroporationstechnikNeurale ProgenitorzellenMeningealraumGlaspipetteMikroinjektorPlatinpinzette

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