Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Zusammenfassung

Bildung von Protein-Komplexen in vivo kann durch bimolekulare Fluoreszenzkomplementation visualisiert werden. Interaktionspartnern sind, um komplementäre Teile Fluoreszenz-Markierungen geschmolzen und transient in Tabakblättern exprimiert, was zu einem wiederFluoreszenzSignal auf enger Nähe der beiden Proteine.

Zusammenfassung

Viele Proteine ​​interagieren transient mit anderen Proteinen oder in Multiproteinkomplexe integriert, um ihre biologische Funktion ausüben. Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC) ist eine in vivo-Methode, um solche Interaktionen in Pflanzenzellen zu überwachen. Im dargestellten Protokoll untersuchten Kandidatenproteine ​​sind, um komplementäre Hälften der fluoreszierenden Proteinen fusioniert und die jeweiligen Konstrukte sind über Agrobacterium-vermittelte Transformation in die Pflanzenzellen eingeführt. Anschließend werden die Proteine ​​in Tabakblättern transient exprimiert und die restaurierten Fluoreszenzsignale können mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop in den intakten Zellen nachgewiesen werden. Dies ermöglicht nicht nur die Visualisierung der Interaktion selbst, sondern auch die subzelluläre Lokalisation der Proteinkomplexe bestimmt werden. Zu diesem Zweck kann Markergene, die eine fluoreszierende Markierung zusammen mit den Konstrukten BiFC koexprimiert werden, wodurch die Visualisierung Zellstrukturen wie ter endoplasmatischen Retikulum, Mitochondrien, dem Golgi-Apparat oder der Plasmamembran. Das Fluoreszenzsignal kann entweder direkt in Blatt-Epidermiszellen oder in einzelnen Protoplasten, die sich leicht aus den transformierten Tabakblättern isoliert werden, können überwacht werden. BIFC ist ideal geeignet, um Protein-Protein-Interaktionen in ihrer natürlichen Umgebung in der lebenden Zelle zu untersuchen. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass der Ausdruck von starken Promotoren gesteuert werden, und dass die Interaktionspartner werden durch Fusion der relativ großen Fluoreszenz-Tags, die mit der Wechselwirkungsmechanismus stören könnte modifiziert werden. Dennoch ist eine ausgezeichnete BIFC ergänzenden Ansatz zu anderen häufig angewendeten Methoden der Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen, wie Coimmunpräzipitation, in vitro Pulldown-Assays oder Hefe-Zwei-Hybrid-Experimenten.

Einleitung

Studieren die Bildung von Proteinkomplexen und ihre Lokalisation in Pflanzenzellen in vivo ist wichtig, Mobilfunknetze zu untersuchen, Signal-und Stoffwechselprozesse. BIFC ermöglicht die Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen in ihrer natürlichen Umgebung direkt in der lebenden Pflanzenzelle ^5.1.

Im BiFC Ansatz der Komplementierung von zwei nicht-fluoreszierenden N-und C-terminale Fragmente eines fluoreszierenden Proteins führen zu einem fluoreszierenden Protein rekonstituiert. Fragmente von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen verwendet worden, um Protein-Wechselwirkungen zu detektieren, z. B. das grün fluoreszierende Protein (GFP), von denen das Chromophor chemisch durch drei unterschiedliche Reste ⁶ gebildet. Fluoreszierende Proteine ​​können in einer Schleife oder ß-Strang in den beiden nicht-fluoreszierenden Fragmente, die beiden Proteine ​​von Interesse fusioniert werden kann führen zu halbieren. Der Test kann verwendet werden, um Wechselwirkungen in jedem Fach vier subzellulärer erkennennt in jedem aerob wachsenden Organismus oder Zellen, die genetisch modifiziert werden können, um die Fusionsproteine ​​zu exprimieren. Wenn die beiden Proteine ​​in enge Nähe innerhalb der Zelle zu kommen, wird die Fluoreszenz wieder hergestellt und kann durch Mikroskopie ohne Zugabe von exogenen Fluorophoren oder Farbstoffe ³ überwacht werden.

Tabak (Nicotiana benthamiana) hat sich als praktisch Modellorganismus, um die Wechselwirkung von Pflanzenproteinen zu visualisieren, da Proteine ​​kann leicht durch die Verwendung von Agrobacterium-vermittelten Transformation von Tabakblättern mit den generierten Konstrukte exprimiert werden. Agrobakterien mit einem sogenannten Ti-Plasmid (Tumor-induzierend) für Enzyme, die die Transduktion des Gens in Pflanzenzellen vermitteln Codierung. BiFC ist auch anwendbar für lösliche als auch für Membranproteine ​​in allen zellulären Kompartimenten und wurde erfolgreich in den letzten Jahren verwendet, um interagierende Proteine ​​identifizieren, die in vivo als auch Interaktionsstellen zu analysiereninnerhalb der Proteine ^​​7-9. Nach der Expression der eingeführten Gene, kann die Wechselwirkung der fluoreszierenden Proteine ​​direkt in den Blättern sichtbar gemacht werden, was für größere Zellstrukturen, wie dem endoplasmatischen Retikulum (ER), die Plasmamembran oder Chloroplasten. Um aber die Lokalisation in feiner Strukturen zu überwachen, zum Beispiel die Chloroplasten-Umschlag, ist es ratsam, die Fluoreszenz-in-Protoplasten aus transformierten Tabakblättern getrennt visualisieren. Eine Reihe von Vektoren, die BiFC entweder eine C-terminale oder N-terminale fluoreszierende Markierung hat, um die Pflanzen in BiFC Ansatz ¹⁰ verwendet werden. Die im Folgenden beschriebenen Protokoll wurde verwendet, um die Interaktion von cytosolischen Hitzeschockprotein 90 (HSP90) mit der Tetratricopeptid repeat (TPR)-Domäne Docking Proteine ​​Toc64 und AtTPR7 Wohnsitz in der Chloroplasten-Außenhülle und dem endoplasmatischen Retikulum, jeweils ^{von 11 bis 13} enthält, zu studieren. Zu diesem Zweck wurde auf die HSP90 Ct verschmolzenerminal Teil SCFP (SCFP ^C). Das Tag war N-terminal an das Chaperon fusioniert, um die Zugänglichkeit von der C-terminalen MEEVD Bindungsmotiv von HSP90 TPR-Domänen-Klemme zu gewährleisten. Parallel dazu ist der N-terminale Teil von Venus (Venus ^N) an die zytosolische Domäne des TPR-Domäne Andocken Proteine ​​Toc64 und AtTPR7 jeweils enthaltend fusioniert wurde. Als Negativkontrolle klonierten wir das lösliche C-terminalen Teil des ^C SCFP ausschließlich die im Cytosol befindet, und ist daher eine geeignete Steuerung.

Die fluoreszierenden Markierungen der untersuchten Proteine ​​haben den gleichen Zellabteil zugewandt Nähe und dadurch Auflösen des Fluoreszenzsignals zu ermöglichen. Um die Lokalisierung des rekonstituierten Fluoreszenzsignal ein Markerprotein an eine andere fluoreszierende Markierung fusioniert ist cotransformiert die subzelluläre Lokalisation der Wechselwirkung nachzuweisen bestimmen. Ein ER-Markerproteins fusioniert mCherrry wurde gleichzeitig in den transformiertenBei der ER AtTPR7 ¹⁴ angeordnet. Die Autofluoreszenz des Chlorophylls diente als Chloroplasten-Marker bei Toc64. Dadurch nicht nur die in vivo Interaktion von Toc64 AtTPR7 und jeweils mit der cytosolischen Chaperone HSP90 in den Tabakblättern direkt überwacht werden, sondern auch die subzelluläre Lokalisation der Wechselwirkung untersucht werden.

BIFC ist als Ergänzung zu den anderen Methoden Studium von Protein-Protein-Interaktionen geeignet. Im Vergleich zu Coimmunpräzipitation oder in vitro Pull-down-Experimente, zum Beispiel, haben keine spezifischen Antikörper gegen die Proteine ​​von Interesse vorhanden sein, und die Proteine ​​müssen nicht rekombinant in vitro exprimiert werden, was schwierig sein kann, insbesondere für Membranproteine. Außerdem können auch transiente Interaktionen mit BiFC überwacht werden, da die Proteine ​​durch die Wechselwirkung der kondensierten Fluoreszenzmarkierungen ¹⁵ eingefangen.

Protokoll

1. Transformation von Agrobakterien in BIFC Konstruiert

1. Klonierung der Konstrukte BIFC
   1. Amplify das Gen von Interesse aus einer entsprechenden Vorlage mit Oligonukleotiden, die flankierenden attB-Websites. Führen Sie eine PCR unter Verwendung eines Korrekturlesen-Polymerase. Anpassung der Länge der Wärmebehandlungsschritt, um die Primer-Kombination ausgebildet und die Länge des Verlängerungsschritt gemäß der Fragmentgröße. Überprüfen Sie die PCR-Produkts durch Agarose-Gelelektrophorese und Reinigung durch Verwendung eines PCR Clean-up Kit.
   2. Führen Sie die BP-Reaktion mit dem erhaltenen Fragment und den Eintrag mit einem Vektor-BP-Rekombinase. Mischen Sie 15 bis 150 ng der attB-PCR-Produkt mit 150 ng des Eintrags Vektor, fügen Sie 2 ul der BP-Rekombinase und füllen sich mit TE-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 8 ul. Inkubieren der Reaktion für 1 h bei RT und Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 2 &mgr; l Proteinase K für 10 Minuten bei 37 ° C.
   3. Transformieren Sie die gesamte Reaktions in kompetente E. coli DH5a; Zellen und Screening der erhaltenen Kolonien durch Kolonie-PCR für die korrekte Insertion des DNA-Fragments in den Vektor. DNA-Sequenzierung der positiven Plasmiden durchgeführt, um die Abwesenheit von Mutationen zu überprüfen.
   4. Verwenden Sie die erhaltenen Entry-Klon für LR Rekombination mit dem entsprechenden Ziel-Vektor mit einem LR-Rekombinase. Mischen Sie 50 bis 150 ng des Eintrags Vektor mit 150 ng des Zielvektor, fügen 1 ul LR-Rekombinase und füllen sich mit TE-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 5 ul. Inkubieren der Reaktion für 1 h bei RT und Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 1 &mgr; l Proteinase K für 10 Minuten bei 37 ° C.
   5. Transformieren Sie die gesamte Reaktions in kompetente E. coli DH5a Zellen und Bildschirm durch Kolonie-PCR für die korrekte Einführung des DNA-Fragments in den Vektor erhaltenen Kolonien. DNA-Sequenzierung ist in diesem Schritt nicht erforderlich.
   6. Isolierung von Plasmid-DNA mit einem Plasmid Mini Kit, um eine hohe Reinheit zu gewährleisten.
2. Herstellung von chemisch kompetente Agrobakterien (Stamm AGL1, Rifampicin und Carbenicillin-Resistenz)
   1. Streak aus Agrobakterien aus einer Stammkultur wachsen und für 24 Stunden bei 28 ° C.
   2. Impfen 5 ml LB-Medium mit einer Einzelkolonie beimpft und über Nacht bei 28 ° C
   3. Beimpfen von 50 ml LB-Medium mit 2 ml der Übernacht-Kultur wachsen und für etwa 4 h bei 28 ° C bis zu einer OD ₆₀₀ von 1,0.
   4. Zentrifugieren der Zellen bei 3000 × g für 15 min bei 4 ° C und das Pellet in 1 ml sterilisiertem eiskaltem CaCl ₂ (10 mM). Halten Zellen auf Eis nach diesem Schritt.
   5. Aliquots (100 ul) der Zellen, sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 ° C
3. Transformation von chemisch kompetente Agrobakterien
   1. Tauwetter ein Aliquot der zuständigen AGL1 Zellen auf Eis. Hinzufügen 1-2 ug Plasmid-DNA in die Zellen. Inkubation für 5 Minuten auf Eis, 5 min in flüssigem Stickstoff und 5 min bei 37 ° C. Add 600 ul LB-Medium zu den Zellen und sSeehecht bei 650 Upm für 4 Stunden bei 28 ° C.
   2. Zentrifugieren Sie die Zellen für 1 min bei 8.000 xg und den Überstand verwerfen. Das Pellet in 50 &mgr; l der verbleibenden LB-Medium und Platte auf LB-Platten mit den entsprechenden Antibiotika. Verschließen Sie die Platten und Inkubation für 2 Tage bei 28 ° C. Bildschirm Kolonien auf das Vorhandensein des Plasmids durch Kolonie-PCR.
   3. Impfen eine positive Kolonie in 5 ml LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika und Inkubation bei 28 ° C über Nacht. Mischungs 500 ul der Übernacht-Kultur mit 500 &mgr; l 50% Glycerin sterilisiert und gefrier bei -80 ° C.
   4. Impfen die Agrobakterien in LB-Medium die entsprechenden Antibiotika enthaltend direkt aus dem Glycerin Lager für transiente Transformation von Tabakblättern.

2. Transient Transformation von Tabakblättern

1. Agrobakterien Wachstum
   1. Die folgenden Stammlösungen: Acetosyringon (150 mM, lösen sich in 70% EtOH), speichern als Aliquots bei -20 ° C. MES / KOH (0,1 M) pH 5,7, Lagerung bei 4 ° C (Sterilfilter durch einen 0,2 um Filter, um das Bakterienwachstum bei längerer Lagerung zu verhindern), MgCl ₂ (1 M) Lager, Lagerung bei RT.
   2. Beimpfen von 10 ml LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika mit 50 ul der AGL1 Glycerin-Stammkultur, die das Plasmid von Interesse in einer sterilen 50 ml-Röhrchen und Inkubation bei 28 ° C für mindestens 24 Stunden unter Schütteln bei 190 rpm, bis eine OD ₆₀₀ zwischen 1,0 -2.0 erreicht.
   3. Zentrifuge Bakterien bei 3.000 × g für 15 min. Das Pellet in frisch gemacht Infiltrationsmedium [MgCl ₂ (10 mM), MES / KOH (10 mM) pH 5,7, Acetosyringon (150 uM)] und stellen Sie die Suspension bis zu einer OD ₆₀₀ von 1,0.
   4. Die Agrobakterien-Zellen Inkubation in einem Überkopfschüttler für 2 Stunden in der Dunkelheit. Die Zellen können dann zur Infiltration verwendet werden.
2. Infiltration von Tabakblättern
   1. Verwenden Sie dreiWochen alten Tabak (Nicotiana benthamiana) Pflanzen. Wählen Sie mehrere ältere Blätter für Infiltration.
   2. Mix gleiche Volumina der Agrobakterien Durchführung der Konstrukte von Interesse (jeweils 3 ml). Nehmen Sie eine 5-ml-Spritze ohne Nadel zur Infiltration. Infiltrieren die Zellsuspension vorsichtig in den Tabakblättern durch Betätigen der Spritze auf der Unterseite der Blätter in mehreren Stellen.
   3. Gießen Sie die Pflanzen und lassen sie in der Dunkelheit für zwei Tage.

3. Protoplasten Vorbereitung

Protoplasten Herstellung von Tabakblättern wurde von Koop et al. ¹⁶ angepasst und leicht modifiziert.

1. Buffer Vorbereitung
   1. Vorbereitung F-PCN Medium: Macro-Salze [KNO ₃ (1012 &mgr; g / ml), CaCl ₂ • 2H ₂ O (440 &mgr; g / ml), MgSO ₄ • 7H ₂ O (370 &mgr; g / ml), KH ₂ PO ₄ ( 170 pg / ml), NH _4-Succinat [(20 mM, bereiten eine 2 M Lager Solution (Succinat (236 ug / ml) und NH ₄ Cl (106 &mgr; g / ml) auf pH 5,8 einstellen zu lösen)], Mikro-Salzen [EDTA-Fe (III) x Na-Salz (40 ug / ml), KJ (0,75 ug / ml), H ₃ BO ₃ (3 &mgr; g / ml), MnSO ₄ • H ₂ O (10 &mgr; g / ml), ZnSO ₄ • 7 H ₂ O (2 ug / ml), Na ₂ MoO ₄ • 7H ₂ O (0,25 g / ml), CuSO ₄ • 5 H ₂ O (0,025 g / ml), CoCl ₂ • 6H ₂ O (0,025 g / ml)], MES (390 &mgr; g / ml), Glukose (etwa 80 ug / ml) Osmolarität 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Shop bei -20 ° C
   2. Vorbereitung F-PIN Medium: Alle Inhaltsstoffe wie F-PCN aber anstelle von Glucose Verwendung Saccharose (etwa 110 ug / ml), Osmolarität 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Shop bei -20 ° C
   3. Vorbereitung W5-Medium: 150 mM NaCl, 125 mM CaCl _2, 5 mM KCl, 2 mM MES, Osmolarität 550-580 mOsm, pH 5,7 (KOH). Lagerung bei 4 °, C (steril durch einen 0,2 &mgr; m-Filter, um das Bakterienwachstum bei längerer Lagerung zu verhindern).
   4. Bereiten frischer Enzymlösung für Protoplastenisolierung (0,1 g Cellulase, 0,03 g macerozym in 10 ml F-PIN). Inkubation der Lösung bei 55 ° C für 10 min und Abkühlen auf RT. Füge 100 &mgr; l 10% BSA auf 10 ml Lösung.
2. Isolation von Protoplasten
   1. Legen Sie ein Blatt infiltriert in eine Petrischale, und fügen Sie die frische Enzymlösung. Verwenden Sie eine neue Rasierklinge, das Blatt in ca. 0,5 cm ² große Stücke geschnitten. Übertragen Sie die Blattstücke mit der Enzymlösung in ein Vakuum-Infiltration-Kolben-und Vakuum infiltrieren für ca. 20 Sekunden, bis die Luftblasen entstehen aus den Blättern (Release-Vakuum sehr vorsichtig).
   2. Der Kolben wird 90 min bei 40 UpM im Dunkeln.
   3. Lassen Protoplasten durch Schütteln für 1 min bei 90 Umdrehungen pro Minute. Die Lösung wird durch Gaze (100 uM) in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen (Rundboden).
   4. Lagern die Protoplastenlösung mit 2 ml F-PCN-Puffer und Zentrifuge für 10 min bei 70 · g (langsame Beschleunigung und Verlangsamung) bei RT.
   5. Intakten Protoplasten sammeln sich an der Grenzfläche der Enzymlösung und F-PCN. Nehmen Sie eine große Öffnung 1 ml Pipettenspitze auf die intakten Protoplasten in ein frisches Zentrifugenröhrchen übertragen und füllen sich mit W5-Puffer. Zentrifugieren für 2 min bei 100 xg (langsame Beschleunigung und Verzögerung), um die Protoplasten zu pelletieren.
   6. Den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und Pellet in ungefähr 200 &mgr; l W5-Puffer, je nach der Menge von Protoplasten.
   7. Immer breite Öffnung Tipps, Aufbrechen der intakten Protoplasten zu verhindern.

4. Laser-Scanning-Mikroskopie

1. Probenvorbereitung
   1. Fügen Sie zwei kleine Streifen von Dichtungsmasse um einen Objektträger (2 cm Abstand). Zeigen 20 ul der Protoplastenlösung zwischen den Streifen und vorsichtig ein Deckglasan der Spitze. Die Dichtstreifen um sicherzustellen, dass die Protoplasten nicht durch das Deckglas gequetscht.
   2. Für Gesamtblattproben schneiden Sie ein Stück von 1 cm aus dem Blatt und legen Sie es auf einen Objektträger mit der unteren Seite des Blattes nach oben. In etwa 30 ul H ₂ O, ein Deckglas auf und befestigen Sie sie fest mit Klebeband auf beiden Seiten.
2. Die konfokale Bildgebung und Mikroskopeinstellungen
   1. TCS SP5: Imaging mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop von Leica, Typ durchgeführt. Zur Vergrößerung verwendet eine Objektivlinse (HCX PL APO CS) mit einer Stärke von 63X mit Glycerin als Abbildungsmedium. Stellen Sie die numerische Apertur bis 1,3. Verwenden Sie die Leica Application Suite / Advanced Fluoreszenz-Software für die Auswertung (siehe Zusatzdaten S1).
   2. Stellen Sie den Argon-Laser bis 30% und die Laserleistung bei 488 nm auf eine Intensität von 18%, um die wiederhergestellten BIFC Signal bei 515 nm zu überwachen und setzen ein PMT-Detektor Emissionsbandbreite von 495 bis 550.
   3. Um Chlorophyll Autofluoreszenz überwachen eine zweite PMT-Detektor Emissionsbandbreite von 650 bis 705.
   4. Zur Überwachung mCherry Signal zu verwenden, die He-Ne-Laser 561, stellen Sie die Intensität des Laser 561-18% und der Emissionsbandbreite eines dritten PMT-Detektor 587-610.
   5. Stellen Sie sicher, dass die Bilder aller PMT Detektorkanäle sind mit den gleichen Verstärkungseinstellungen (Gewinn sollte zwischen 800-900 sein, um Hintergrundsignale ausschließen) übernommen.
   6. Nehmen Sie Bilder in einem Format Breite / Höhe von 1024 x 1024 Pixel mit einer Scangeschwindigkeit von 100 Hz.
   7. Für Z-Tape verwenden einen maximalen Abstand von 0,5 um zwischen jedem Stapel.

Ergebnisse

In diesem Beispiel verwendeten wir die BiFC Methode, um die Interaktion des zytosolischen Chaperon Hsp90 mit den Membranproteinen Docking AtTPR7 und Toc64 überwachen. AtTPR7 ist Teil der Sec Translokons und interagiert mit zytosolischen Chaperone, die möglicherweise liefern sekretorischen Präproteinen für post-translationalen Translokation an der ER-Membran. Ebenso Toc64 an der Außenhülle wirkt Chloroplasten in post-translationalen Import durch den Empfang HSP90 assoziiert Chloroplasten Präproteinen. Beide Proteine ​​en...

Diskussion

Bei der Planung einer BIFC Experiment mehrere Punkte berücksichtigt werden. Obwohl keine strukturelle Informationen über die Proteine ​​von Interesse erforderlich ist, hat der Topologie bekannt sein, wenn mit der Membran überspannenden Proteinen. Die fluoreszierenden Proteine ​​in der gleichen subzellulären Kompartiment befinden oder in die gleiche Seite einer Membran, um die Interaktion zu ermöglichen. Natürlich, wenn die Analyse-Proteine, die eine N-terminale Targeting-Sequenz erforderlich ist, kann nur ein C-terminal...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3',5'-Dimethoxy-4'-Hydroxyacetophenon	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringon
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	aus Trichoderma viridae
Macerozym R-10	Serva	28302	von Rhizopus sp.
GATEWAY, BP Clonase II, Enzym Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzym Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel und PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE	Invitrogen		Gateway-Klonierung
pDEST-VYNE(R)GW	Invitrogen		Gateway-Klonierung
pDEST-SCYCE(R)GW	Invitrogen		Gateway-Klonierung