Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen

Oxidativer Stress ist speziell als eine Bedingung, die aus einem unsymmetrischen zellulären Redox-Zustand ergibt definiert. Die komplexen Redox-Reaktionen, die routinemäßig in den Zellen auftreten, bestimmen die zellulären Redox-Zustand. Redox-Reaktionen umfassen alle chemischen Reaktionen, die in der Übertragung von Elektronen zwischen den Atomen von biologischen Molekülen Herstellung Reduktion und Oxidation von Molekülen (dh Redoxreaktionen) bestehen. Diese Reaktionen werden durch elektronisch aktivierten Spezies (dh pro-oxidativen Spezies), die durch eine extreme strukturelle Instabilität und spontane Aktivierung von unsymmetrischen Elektronen, die mit den Nachbar Biomolekülen auszutauschen gekennzeichnet katalysiert. Diese Reaktionen führen in unregelmäßigen DNA-Schäden, Protein Carboxylierung und Lipidoxidation, und schließlich zum Zelltod führen ^1. Erhöhten oxidativen Stress mit dem Altern und dem Fortschreiten von verschiedenen pathologischen Zuständen ² verbunden. Oxidativer Stress hatberichtet für Gefäßveränderungen bei Diabetes und Herzkreislauferkrankungen ^3,4 verantwortlich zu sein. Es spielt auch eine kritische Rolle bei der neuronalen Degeneration bei Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit ^5. Außerdem hat oxidativen Stress als kritischer Faktor bei der Steuerung der Tumorprogression und metastatischen Ereignisse ^6,7 nachgewiesen. Darüber hinaus können Entzündungen und Immunreaktionen auslösen und weitere Unterstützung oxidativen Stress ^8.

Oder Stickstoff (RNS; reaktive Stickstoffspezies) in lebenden Zellen sind pro-oxidativen Spezies von Sauerstoff (reaktiver Sauerstoffspezies, ROS) abgeleitet. ROS sind das Hydroxyl-Radikal, das Superoxid-Anion ^(OH.) (O ₂ ^-) und Wasserstoffperoxid (H ₂ O _2). Der primäre RNS ist Stickoxid ^(NO).. Eine Reihe von sekundären reaktiven Spezies können durch spontane Wechselwirkung zwische erzeugt werdenn ROS und RNS oder freien Metallen Ionen ^9. Beispielsweise reagiert das Superoxid-Anion mit Lachgas zu Peroxynitrat (ONOO ^-) zu bilden, während H ₂ O _2-Reaktion mit Fe ^{2 +} Hydroxylradikale erzeugt. ROS und RNS, die aufgrund ihrer Fähigkeit, mit verschiedenen Biomolekülen reagieren, werden als gefährliche Bedrohung für die Aufrechterhaltung der physiologischen Redox-Zustand ^10. Zur Aufrechterhaltung der Redox-Zustand-Zellen werden mit einer Reihe von entgiftende Anti-Oxidationsmittel-Molekülen und Enzymen ausgestattet. Die Superoxid-Dismutase (SOD), Katalase, Glutathion-Peroxidase und Peroxiredoxine bilden im Wesentlichen die Anti-Oxidationsmittel enzymatisch-Arsenal, das Zellschutz bietet von pro-oxidative Arten, darunter H ₂ O _2, OH und OONO ^{-. 11.} Auch Anti-Oxidationsmittel-Moleküle wie Vitamin C und E, Polyphenole und CoenzymeQ10 (CoQ10) sind von entscheidender Bedeutung für ROS und ihre gefährlichen de löschenDerivate ^12,13. Verschiebt sich jedoch eine übermäßige Produktion von ROS und RNS oder einer Funktionsstörung in dem Antioxidationsmittel-System, das zelluläre Redox-Zustand zu oxidativem Stress ^14.

Neben ihren negativen Beigeschmack, können ROS verschiedenen physiologischen Rollen in Zellen verschiedener Herkunft zu spielen. Die Zellen produzieren normalerweise ROS als Signalmoleküle in den normalen biologischen Ereignisse wie der Wirtsabwehr und Wundheilung ^15-17 vermitteln. Reaktiven Spezies werden normalerweise in Zellen durch intrazelluläre Enzyme, wie NOX (NADPH Oxidase) und XO (Xanthin-Oxidase) in Reaktion auf Signalfaktoren, Wachstumsfaktoren und intrazelluläre Calciumspiegel Schwankungen ^18,19 hergestellt. Es wurde berichtet, dass ROS differentiell moduliert die Aktivität wichtig Kernfaktoren wie p53 oder zellulären Komponenten, wie das ATM-Kinase, ein Hauptregulator der Antwort auf DNA-Schädigung ^20. Analog ROS stark beeinflussen zelluläre Signal durch Vermittlung thE-Oxidation und Inaktivierung von Protein-Tyrosin-Phosphatasen (PTPs), die als kritische Regulatoren der Signaltransduktion ²¹ etabliert sind. Außerdem zeigen Proteom Methodik, dass RNS auch für spezifische Protein Modifikationen und Änderungen der molekularen Signal verantwortlich. RNS reagieren mit den Cystein-Thiolgruppen modifiziert sie in S-nitrothiols (SNO) und Trigger molekularen Signalwege gleichzeitig mit pathologischen Zuständen, wie entzündliche und Autoimmunerkrankungen ^22,23.

Da Zellkulturexperimenten die Vielzahl der in-vivo-wirkende Faktoren nur teilweise zu reproduzieren, von großem Interesse ist es Redox-Studien in Tiermodellen ^24,25 durchzuführen. Um dies zu erreichen, hat der Zebrafisch wurde als geeignete Wirbeltiermodell für oxidativen Stress Dynamik ²⁶ studieren. Der Zebrafisch ist ein neues Modell, das System mehrere Vorteile, zellulären und genetischen Ereignisse während Wirbel dev Stipendienelopment und Krankheit. Große Cluster von Embryonen erzeugt und verfügbar werden wöchentlich für experimentellen Anforderungen. Darüber hinaus ist die außergewöhnliche optische Klarheit der Zebrafisch-Embryonen sowie ihrer geringen Größe ermöglicht die Einzelzell-Imaging und dynamische Tracking in einem ganzen Organismen ^27. In den letzten zehn Jahren eine beträchtliche Anzahl von Zebrafisch-Mutanten wurden erzeugt, um menschlichen Krankheitszuständen wie Krebs und genetischen Krankheiten ^28-31 modellieren. Am wichtigsten ist, eine Vielzahl von transgenen Linien wurde erstellt, um umfangreiche Möglichkeiten der genetischen und biologischen Manipulationen ³² zu ermöglichen. Zum Beispiel sind transgene Zebrafisch gewebespezifische Leitungen regelmäßig auf in-vivo-Studien verwendet. Diese Linien exprimieren ein Fluoreszenzprotein unter der Kontrolle eines ausgewählten Promotors und bietet die Möglichkeit, Einzelzellen in vivo zu identifizieren, sowie die anatomische Struktur, die sie umfassen.

Mehrere toxikologischen Studien haben bereits verwendet ter Zebrafisch, um die in vivo Wirkung von Chemikalien auf Redox-Homöostase zu bewerten, was die Eignung dieser Wirbel als Tiermodell für den Bereich der Arzneimittelforschung und oxidativen Stress ^33-35. Auch wenn einige fluoreszierende Sonden wurden getestet, um oxidativen Stress in Zebrafisch-Larven ^36,37 zu überwachen, gibt es keine eindeutigen Tests zu erkennen und zu messen, die Niveaus von oxidativem Stress in Zebrafisch-Gewebe und lebenden Zellen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur in vivo Quantifizierung von oxidativem Stress in lebenden Zellen von Zebrafischembryonen. Imaging-Tools, FACS-Sortierung, fluoreszierende Sonden und pro-oxidative Bedingungen kombiniert, um eine einfache Test für den Nachweis und die Quantifizierung von oxidativen Spezies in Zebrafischembryos und Geweben zu erzeugen.

1. Vorbereitung der Instrumente und Arbeitslösungen

1. Bereiten Sie die Fisch-Wasser-Lösung. Machen Sie eine Stammlösung durch Lösen von 2 g Meersalz "Instant Ocean" in 50 ml destilliertem Wasser. 1,5 ml der Stockfisch Wasser auf 1 L destilliertem Wasser zur Vorbereitung bereit, Fisch Wasser (60 ug / ml Meersalze Endkonzentration) zu verwenden. Autoklavieren bereit, Fisch Wasser vor Gebrauch zu verwenden. Diese Lösung wird als Zebrafischembryo Medium verwendet.
2. Bereiten Methylcellulose für die Embryo-Montage. Lösen Sie 1,5 g Methylcellulose in 50 ml sterilem Wasser Fisch. Erleichtern Sie die Auflösung mit Hilfe eines Magneten auf einer Rührplatte. Die vollständige Auflösung des Pulvers benötigt mehrere Stunden. Überprüfen Sie die Lösung für Klarheit und Teilmenge in kleine Röhrchen. Lagerung bei -20 ° C für Monate und auftauen Aliquots bei Gebrauch. Zentrifugieren Sie die Methylcellulose bei 950 xg für 5 min vor der Anwendung. Vermeiden Frost-Tau-Zyklen von Teilmengen.
3. Bereiten Sie 50 ml Tricaine / Ethyl-3-m Aminobenzoatethansulfonat Salz (Stammlösung) durch Lösen von 200 mg Tricaine in 100 ml Wasser und pH-Wert auf 7,0 mit Tris-HCl 1 M (pH 9). Bewahren Sie die Lager bei 4 ° C für nicht mehr als 30 Tage. ACHTUNG: Tricaine ist giftig. Verwenden Sie nach geeigneten Verarbeitungsrichtlinien.
4. Induktion oxidativen Stress in Zebrafischembryonen
   1. Bereiten Sie ein Oxidationsmittel-Lösung für generische oxidativen Stress Induktion: Stellen 50 ml Oxidationslösung durch Zugabe von H ₂ O _{2-Stammlösung} (Wasserstoffperoxid; 100 mM) um Fische zu Wasser. Mit H ₂ O ₂ zu einer Endkonzentration von 2 mM bzw. 100 uM. Diese Lösung kurz vor Gebrauch. Die Oxidationsmittel-Lösung kann sowohl whole mount ROS-Erkennung und Einzelzellen-ROS-Nachweisverfahren angewendet werden. Sie diese Lösung lagern. ACHTUNG: H ₂ O ₂ ist gefährlich und gesundheitsschädlich beim Einatmen und Verschlucken. Berührung mit brennbaren Stoffen besteht Feuergefahr. Griff unter einer Abzugshaube und tragen Sie geeignete personal Schutzausrüstung.
   2. Bereiten Sie ein Oxidationsmittel-Lösung für Mitochondrien-abgeleiteten oxidativen Stress Induktion: Machen Sie eine Oxidationsmittel-Stammlösung (5 mM) durch Auflösen von 3,9 mg Rotenon in 2 ml Dimethylsulfoxid (DMSO). Diese Lösung wird bei Raumtemperatur in der Dunkelheit.
      1. Lösen Rotenon Stammlösung zu 10 ml Wasser pro Fisch gebrauchsfertige Lösung zu machen. Verwenden Rotenon in einer Konzentration zwischen 5-50 uM. Verwenden Sie keine Rotenon in Konzentrationen von mehr als 100 uM. In geeigneten Konzentrationen kann dieser Oxidationslösung sowohl whole mount ROS-Erkennung und Einzelzellen-ROS-Nachweisverfahren angewendet werden. ACHTUNG: Rotenon ist giftig und gefährlich. Handhabung entsprechend geeignete Sicherheitshinweise.
   3. Induzieren oxidativen Stress durch Gen-Knock-down: Super-Sonder nrf2a Genexpression im Zebrafisch-Embryonen, die durch Mikroinjektion Morpholino, wie zuvor von Timme-Laragy A. et al, 2012, ³⁸ berichtet..
   4. Induzieren oxidAtive Stress nach Gewebeschäden: erzeugen ein Wundrand an der Schwanzflosse von Zebrafischembryonen bei 72 hpf, wie zuvor von Niethammer et al, 2009, ³⁹ beschrieben..
5. Bereiten 5 ml ROS-Detection-Lösung für einzelne Zelle ROS-Nachweisverfahren:
   1. Lösung für allgemeine ROS-Erkennung: Lösen Sie das generische ROS-sensitive molekulare Sonde in HBSS (Hanks Balanced Salt Solution), um eine funktionierende Lösung (Konzentrationsbereich: 2,5 bis 10 uM) vorzubereiten. Diese Lösung muss kurz vor Gebrauch hergestellt werden.
   2. Lösung für den spezifischen Nachweis von ROS induzierte Mitochondrien: Kurz vor Gebrauch auflösen eine mitochondriale ROS-empfindliche Sonde mit DMSO, einen 5 mM Stammlösung. Lösen Stammlösung in HBSS, um eine Arbeitslösung (Konzentrationsbereich: 2,5 bis 10 uM) vorzubereiten.
      HINWEIS: Vermeiden Sie Licht und Sauerstoff Exposition von ROS-Erkennung Arbeitslösungen und ihre jeweiligen Stammlösungen. Schützen Sie den Schlauch von Licht mit Hilfeeine Aluminiumfolie. Bewahren Sie keine oder Wiederverwendung Sonden in HBSS gelöst. Bewahren Sie die Stammlösungen bei -20 ° C für einen Monat.
      VORSICHT: Gehen molekulare Sonden und DMSO unter einer Abzugshaube in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien.
6. Bereiten 5 ml ROS-Detection-Lösung für die gesamte Halterung ROS-Nachweismethode: Lösen Sie die generische ROS-empfindliche Sonde Stammlösung (in DMSO stabilisiert) in HBSS, um eine Arbeitslösung (Konzentrationsbereich: 2,5-5 uM) vorzubereiten. Licht-und Sauerstoffeinwirkung vermeiden. Schützen Sie den Schlauch vom Licht. Diese Lösung vor dem Gebrauch. Bewahren Sie keine oder verwenden Sie wieder diese Lösung. VORSICHT: Gehen molekulare Sonden unter einer Abzugshaube in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien.
7. Machen 25 ml Stopplösung durch Zugabe von 10 ml fötales Rinderserum und 15 ml 1x PBS. Halten Lösung steril. Bewahren Sie die Lösung bei 4 ° C ROS Nachweisverfahren - nur für einzelne Zelle Diese Lösung benötigt.
8. Stellen Sie den Zebrafisch-Luft-Inkubator bei 28 &# 176; C
9. Stellen Sie die Zentrifuge bei 4 ° C für die einzelne Zelle ROS-Erfassungsverfahren.

2. Paarung von Adult Fische und Auswahl von Zebrafischembryonen

1. Set-up erwachsenen Zebrafisch Paar kreuzt nach Standardprotokollen ^40. Wählen Sie die entsprechende transgene Linie nach bestimmten experimentellen Anforderungen.
2. Eier sammeln und sie in einer 90-mm-Schale mit Fisch Wasser / Embryo Medium. Halten Sie Eier bei 28 ° C bis Embryonen entwickeln und wachsen, um die gewünschte Entwicklungsstufe (zB 48 hpf, 72 hpf; hpf: Stunden nach der Befruchtung).
3. Bildschirm für die Entwicklung von Embryonen. Ausschließen aller unbefruchtete Eier oder Embryonen unterentwickelt.
4. Anesthetize Embryonen, die durch Zugabe von 1 ml Tricaine (Stammlösung) in 50 ml Fischwasser.
5. Wählen Tg fluoreszierende Embryonen unter einem Stereomikroskop.

3. Behandlung der Embryonen mit Oxydationsmittel-Agenten

1. Verwenden Sie mindestens 30 Embryonen zwischen 48 hpf und 72 pro HPF unterschiedlichen Zustand. Zweimal waschen Embryonen mit frischem Fisch Wasser, um Tricaine entfernen.
2. Split fluoreszierende Embryonen in drei Gerichte. Legen Sie nicht mehr als 30 Embryonen / Schale.
3. Entfernen Sie die Waschlösung und 10 ml der Oxidationsmittellösung oder 10 ml Fischwasser als Steuerungslösung.
4. Embryonen für 10 min bis 1 h Inkubation bei 28 ° C. Die Inkubationszeit hängt von dem Niveau von oxidativem Stress in spezifischen Geweben induziert werden. Kurze Perioden sind die besten als Zellen durch oxidativen Stress beeinflusst zunehmend Zelltod.
5. Transfer-Embryonen in eine neue Schale mit HBSS und Wasch Embryonen durch Verwirbelung. Pre-warmen HBSS bei 28 ° C

4. Ganze Berge ROS Erkennungsmethode

1. Sammeln Embryonen nach Oxidationsbehandlung und setzen nicht mehr als 10 Embryonen in einer kleinen Röhre. Spülen mit HBSS so viel wie möglich. Schützen Sie den Schlauch von Licht mit Aluminiumfolie.
2. 1 ml der ROS-Nachweislösung fürjedes Rohr.
3. Embryonen im Dunkeln für 15 min Inkubation bei 28 ° C bis Lichtexposition zu vermeiden.
4. Während der Inkubationszeit bereiten einen Glasobjektträger für ganze Embryo-Analyse. Setzen Sie 300 ul von Methylcellulose auf einer "Depression" Glasobjektträger und breitete sie auf der Glasoberfläche mit einer Pipettenspitze. Vermeiden Sie Luftblasen beim Loslassen der Methylcellulose.
5. Am Ende der Inkubationszeit, sofort den ROS-Detection-Lösung und zweimal waschen mit 2 ml HBSS. Waschen Embryonen durch Umdrehen des Röhrchens mehrmals. Pipettieren, oder Wirbel.
6. Saugen Embryonen in eine Glaspasteurpipette. Embryonen Position nahe der Öffnung der Pipette und sanft ausgeworfen sie in die Methylcellulose. Richten Sie die Embryonen entsprechend mit einem feinen Nylon-Linie.
7. Vergleichen Sie die Fluoreszenz der Steuer Embryonen mit behandelten Embryonen. Alternativ fixieren Parameter der Fluoreszenz-Stereomikroskop oder konfokalen Mikroskop, so dass alle Embryonen werden unter Verwendung der gleichen abgebildetenBildeinstellungen.

5. Single Cell ROS-Nachweisverfahren

1. Beginnen Sie ab Schritt: 3.5. Achten Sie darauf, mindestens 35 Embryonen für jede Bedingung.
2. Übertragen Embryonen in eine neue Schüssel. Entfernen Fisch Wasser so weit wie möglich. 10 ml eiskaltem PBS und 1x 400 ul von Protease-Inhibitoren-Cocktail. Manuelles dechorionate Embryonen mit einer Pinzette und entfernen Sie den Dottersack mit einer feinen Nadel. Hinweis: Das Entfernen Dottersack sorgt für saubere Proben für die folgenden FACS-Analyse. Dieser Schritt kann nach FACS-Gerät vermieden werden.
3. Über de-yolked Embryonen in eine 24-Well-Multiwell-Platte (15 Embryonen / well) und entfernen Sie alle Fische Wasser.
4. In 300 ul HBSS, 30 ul Collagenase P, 50 ul Trypsin-EDTA in jedem gut.
5. Homogenisieren Embryonen durch leichtes Auf-und Abpipettieren mit einem engen Pipettenspitze (1.000 ul).
6. Inkubieren bei 28 ° C für 20 min und homogenisieren Proben durch Pipettieren alle 5 min.
7. Überprüfen Gewebe disruption durch die Beobachtung eines aliquoten Homogenat bei der Verbindung Mikroskop. Erleichterung Einzelzellsuspension pipettiert. Embryonen inkubiert Sie nicht mehr als 30 min.
8. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 200 ul Stopplösung. Mischen durch Pipettieren vorsichtig.
9. Übertragen Zellsuspension in eine vorgekühlte Röhrchen mit dichten Boden. Halten Röhrchen auf Eis und vermeiden Belichtung.
10. Zentrifugieren für 5 min bei 250 × g bei 4 ° C.
11. Entfernen Sie die obere Phase und wieder aussetzen Zellen mit eiskaltem HBSS durch vorsichtiges Pipettieren.
12. Zählen von Zellen und stellen Sie sicher, dass Sie die gleiche Anzahl von Zellen in der alle Ihre Proben. Verwenden Sie nicht weniger als 2 x 10 ⁶ Zellen.
13. Zentrifuge Zellen 5 min bei 250 × g bei 4 ° C.
14. Überstand entfernen und die Aussetzung der Pellet mit 1 ml HBSS Eis gekühlt, das die ROS-empfindliche Sonde.
15. Das Röhrchen bei Raumtemperatur für 3 min in der Dunkelheit. Inkubationszeit variieren entsprechend dem Niveau von oxidativem Stress und ter Empfindlichkeit der Sonde.
16. Übertragungszellen zu einer FACS-Röhrchen. Halten Röhrchen auf Eis und vermeiden Belichtung vor der FACS-Analyse.
17. Sortieren Zellen mit einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS). Satz Wellenlängen in Übereinstimmung mit Tg Gewebefluoreszenz (z. B. GFP) und der Erreger / Emissionsspektren der molekularen Sonde für ROS Erkennung (z. B. spezifische mitochondriale ROS-empfindlichen Sonden, generische ROS empfindlichen Sonden) verwendet.
18. Für jede Bedingung messen alle Proben in der gleichen Versuchs Sitzung durch die Anwendung der gleichen FACS-Einstellungen. Der prozentuale Anteil der fluoreszierenden Zellen als Mittelwert der unterschiedlichen biologischen Replikaten. Analysieren Sie mindestens zwei Wiederholungen für jede Bedingung.

Durch die Anwendung der hier beschriebenen Verfahren können wir leicht erkennen, messen und oxidativen Stress (und ROS) im Zebrafisch embryonalen Geweben. Nach der Überquerung erwachsenen Zebrafisch, werden die Eier gesammelt und bei 28 ° C bis 72 Stunden nach der Befruchtung (hpf) zu entwickeln. Um oxidativen Stress zu induzieren, schlagen wir zwei verschiedene Ansätze: 1) die Behandlung der Embryonen mit starken pro-oxidative Reagenzien oder 2) Förderung der ROS-Bildung nach Gewebeverletzung.

Im ersten Ansatz, verwendet man zwei verschiedene Reagenzien nach den spezifischen Bedürfnissen: Wasserstoffperoxid (H 2 O 2), als Ober zellulären ROS bildendes Mittel und Rotenon, als die spezifische mitochondriale ROS-Treiber. Rotenon ist ein Inhibitor der Komplex I der ETC, die Deregulierungen sind ursächlich für oxidativen Stress 41.

Im zweiten Ansatz, induzierten wir Akkumulation von ROS durch die Schaffung einer Wunde an der Schwanzflosse eines Zebrafisch-Embryos39. Alternativ oxidativem Stress in Zebrafisch-Gewebe, indem man den mit Morpholino-Injektion den Nrf2 antioxidative Reaktionsweg, der die primäre zelluläre Abwehr gegen die zytotoxische Wirkung von oxidativem Stress 38 gefördert werden.

Sobald der oxidative Stress in Zebrafischembryonen induziert, kann die Anhäufung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch Verwendung von generischen oder spezifischen mitochondrialen ROS-empfindlichen Sonden, die bei Aktivierung fluoreszierend (z. B. Oxidation) zu messen.

Behandelten Embryonen können mit dem gesamten Montage ROS-Detektionsverfahren oder durch Auftragen der einzelnen Zelle ROS-Detektionsverfahren, wie in Fig. 1 zusammengefaßt analysiert werden. Die Auswahl zwischen den Verfahren beruht auf der Notwendigkeit, die qualitative oder quantitative Bestimmung von oxidativem Stress führen. Repräsentative Ergebnisse beider Methoden sind in Figur 2 dargestellt Abbildung 3.

Ganze Berge ROS-Nachweisverfahren

Figur 2 zeigt die Anwendung der ganze Berg ROS-Erfassungsverfahren für die in vivo-Bildgebung des oxidativen Stress. Insbesondere wurde diese Methode angewendet, um sowohl "starke" oxidative durch exogene prooxidative Behandlungen sowie durch mehr physiologischen Bedingungen wie Wundverletzungen oder Gen-Deletion erzeugt "low" oxidativen Stress erzeugt Stress zu folgen.

Physiologische Ebenen der oxidativen Spezies werden durch die Erzeugung eines Mikro Verletzung oder eine große Wunde an der Schwanzflosse eines Live-Zebrafischembryo bei 72 hpf induziert. Es hat sich gezeigt, daß nach einer Verletzung, H 2 O 2 sammelt sich am Wundrand 20 min nach der Wunde 39. Um die Akkumulation von oxidativem Stress bei dem Wundrand visualisieren, wurden die Embryos mit einem generischen inkubiertROS-sensitive Sonde und bei 20 min nach der Verwundung 39 abgebildet. Durch Vergleich mit intakten Heckflossen verletzt Schwänzen ist es möglich, eine Ansammlung des fluoreszierenden Sonde am Wundrand (2A) zu unterscheiden. Nicht-spezifische schwachen Fluoreszenzsignal wird rund um die Schwanzflosse Gewebe in beiden Bedingungen erkannt.

Um die spezifische Anreicherung des ROS-empfindlichen Sonde am Wundrand, die H 2 O 2-Niveaus an der Wunde zu validieren sind durch eine pharmakologische Ansatz gesenkt. Denn es hat sich gezeigt, dass die Wundrand H 2 O 2-Anreicherung ist extrem empfindlich auf die DUOX-Inhibitor VAS2870 39 Embryonen wurden mit diesem Inhibitor vorbehandelt vor der Verwundung. Vergleich der Fluoreszenz des ROS-empfindliche Sonde von VAS vorbehandelten Embryonen und entsprechenden Steuerelementen anzeigt, dass das Signal in Abhängigkeit von ROS Akkumulation (dh H 2 O 2 ist) (2B).

Darüber hinaus haben wir einen hohen oxidativen Spezies in Zebrafisch-Gewebe durch die Behandlung mit Rotenon Zebrafischembryonen. Rotenon-behandelten Embryonen und Kontrollen wurden mit einem generischen ROS-sensitive Sonde an ROS Arten spezifisch nachzuweisen inkubiert. Danach wurde die Sonde ausgewaschen und die Embryonen wurden unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop abgebildet. Der oxidative Stress in den ganzen Körper des Embryos (Fig. 2C) detektiert. Hohe Vergrößerung Bilder zeigen anatomische Regionen, in denen die Sonde erfolgreich metabolisiert (Abb. 2D). Hellfeld-Bilder (obere Felder) zu unterscheiden anatomischen Strukturen, während die Fluoreszenzbilder (untere Felder) zeigen ROS-positiven Zellen. Die Ergebnisse sind hauptsächlich eine qualitative Bericht von oxidativem Stress Erkennung, die durch den Vergleich mit Kontrolle behandelten Embryonen erzielt wird, wie durch die Fluoreszenzbilder gezeigt.

Single Cell-ROS Erkennungsmethode

Abbildung 3 Berichte repräsentative FACS Plots und Quantifizierung von oxidativem Stress durch die Anwendung der einzelnen Zelle ROS Nachweisverfahren. Diese Methode wurde angepasst, um oxidativen Stress in Zebrafisch-Zellen, die pro-oxidative Bedingungen ausgesetzt wurden, wie im Protokoll angegeben und in Abbildung Legenden detaillierte messen. Wie beschrieben, ist der oxidative Stress durch Inkubation von Gewebe mit einem Zebrafisch-ROS-empfindliche molekulare Sonde in Einzelzellen dissoziiert gemessen. Da die Dissoziation Verfahren und die FACS selbst kann Zellschäden verursachen, die Analyse von Proben erfordert, dass nur "lebende Zellen" werden für oxidativen Stress Quantifizierung berücksichtigt. Dementsprechend werden dissoziierten Zellen durch Auswahl der Fraktion von Zellen, die "lebenden Zellen" physikalische Parameter (3A) und ohne toten Zellen (3B) analysiert. Somit werden die Proben quantifiziertoxidativem Stress nach der Fluoreszenz des ROS-empfindlichen Sonde und zum Zeigen eines endogenen Fluoreszenz wie der Positivität für GFP (Fig. 3C). Eine negative Kontrollprobe für das ROS-empfindliche Sonde sollte, um den oxidativen Stress durch die Handhabung und technischen Verfahren induziert bewerten aufgenommen werden (3C; Platte: Steuerung -). Relative Quantifizierung FACS-Plot demonstriert in Histogramme, die Messungen der verschiedenen biologischen Replikate (3D-E).

Neben oxidativen Stress Ebene Quantifizierung auf Wasserstoffperoxid-Behandlungen, wurde diese Methode angewendet, um oxidativen Stress innerhalb der physiologischen Bedingungen, wie uns in nrf2a morphants und entsprechende Kontrollen (3F) zu quantifizieren.

Darüber hinaus wird durch die Kombination der Einzelzell ROS Nachweisverfahren mit spezifischen ROS-sensitive Sonden, wie uns die mitochondriale ROS-empfindliche Sonden ist es auch möglich, den oxidativen Stress in Zusammenhang mit speziellen Mitochondrien ziel prooxidative Behandlungen (Fig. 3G) zu messen.

Bild 1. Schematische Abbildung der Methode zur Messung ROS in Zebrafischembryonen. Zebrafisch Erwachsene werden in den entsprechenden Zuchtbecken gekreuzt. Befruchtete Eier werden dann in Schalen gesammelt und bei 28 ° C gelagert, um zu ermöglichen Embryo vollständig zu entwickeln. Induktion des oxidativen Stresses kann auf verschiedene Weise entweder durch pharmazeutischen Behandlungen oder durch genetische oder physikalische Beleidigungen erreicht werden. Alternativ, falls eine genetische Mutante analysiert wird, ist es möglich, dieses Inkubation überspringen und sich zu bewegen. An dieser Stelle ist es möglich, gehen Sie nach zwei verschiedenen Methoden. Laut der "ganzen mount ROS-detection "-Verfahren (links), werden Zebrafischembryos sofort mit einem fluoreszierenden ROS-empfindliche Sonde (1) und dann mit Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskop (2) analysiert inkubiert. In der "einzigen Zelle ROS-Erkennung"-Methode (rechts), sind Zebrafischembryonen in einzelne Zellen dissoziiert (1), mit einem fluoreszierenden ROS-sensitive Sonde (2) inkubiert und durch FACS für Fluoreszenz-Detektion und Quantifizierung (3) analysiert. Während die "ganze Berg-ROS-Erkennung"-Methode ermöglicht oxidativen Stress Detektion in lebenden Embryonen in erster Linie als qualitative Test, "Single-Cell-based"-Methode Zuschüsse sowohl qualitative als auch quantitative Messungen von oxidativem Stress.

Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse der ganze Berg ROS-Nachweisverfahren. A) Zebrafisch-Embryonen bei 72 hpf unterzogen wurdenzu verwunden, wie zuvor von Niethammer et al., 2009, 39. Repräsentative konfokale Bilder zeigen pro-oxidativen Spezies (ROS) Akkumulation (Pfeilspitze) in der Wundrand der Verwundeten Schwanzflosse. Oxidative Spezies wurden mit dem generischen ROS Sonde nachgewiesen (CellROX, 2,5 uM) 20 min nach der Wunde vorgenommen wurde. Maßstabsbalken 20 um. B) Repräsentative konfokale Bilder zeigen Wundrand der Zebrafisch-Embryonen bei 72 hpf. Embryonen wurden mit VAS2870 (20 &mgr; M) oder DMSO für 90 min vorbehandelt, bevor die Wunde vorgenommen wurde. 20 Minuten nach der Wunde; ROS haben mit einer generischen ROS-empfindliche Sonde (2,5 uM CellROX) festgestellt worden. Maßstabsbalken 20 um. C) Die Ganzkörper-Bild, das Rotenon-induzierten oxidativen Stress in Zebrafischembryonen. Oxidativer Stress ist stark in der Schwanzregion der Embryonen wie in Panel D gezeigt) erfasst. Rotenon ist ein potenter Inhibitor der mitochondrialen ETC, die hauptsächlich skelet al Muskelzellen im Zebrafisch. Maßstabsbalken, 180 um.

Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse der einzelnen Zellen ROS-Nachweisverfahren. A) Repräsentative FACS-Plot, der eine typische Probe von Zebrafischembryonen dissoziiert, um einzelne Zellen. Lebende Zellen sind in Region R1 nach FSC-H und SSC-H-Parameter verknüpft. SSC-H: 539 (Voltage), 1,0 (AmpGain), Modus: linear; FSC-H:. E00 (Spannung), 2.1 (AmpGain) B) Repräsentative FACS-Plot, der eine typische Probe von Zebrafischembryonen dissoziiert, um einzelne Zellen. Vor der FACS-Analyse wurde die Probe mit Propidiumiodid inkubiert wurde (PI, 1 ug / ml) für 5 min. Tote Zellen werden auf R2 nach Region mit PI-Fluoreszenz (FL2-H-Kanal) verknüpft. FSC-H: E00 (Spannung), 2.1 (AmpGain), Modus: linear, SSC-H: 539 (Voltage), 1,0 (AmpGain), Modus: liin der Nähe. Spannung Kanäle: FL-2:. 613 Log C) Repräsentative FACS-Diagramme, die dissoziiert Zebrafischembryonen zu pro-oxidative Behandlung (H 2 O 2) und den jeweiligen Kontrollen unterzogen. Endothelzellen sind durch GFP Kanal visualisiert. FACS Plots repräsentieren alle Zellen durch oxidativen Stress (ROS) auf UL und UR betroffen. Negative Zellen werden auf unteren Quadranten (LL und LR) aufgetragen. Tg (Kdrl: GFP) S843 Zebrafischembryos bei 48hpf wurden mit H 2 O 2 (2 mM) oder H 2 O als Kontrolle für 10 min inkubiert. Vor der FACS-Analyse werden die Embryos wie in dem Protokoll beschrieben verarbeitet. Zellen, die durch oxidativen Stress beeinflusst werden, indem allgemeine ROS-empfindlichen Fluoreszenzsonde (, 2,5 uM CellROX) detektiert. Eine Probe nicht mit der ROS-sensitive Sonde inkubiert wurde als Negativkontrolle einbezogen. Vergleichen der Probe mit pro-oxidativen Behandlung mit dem jeweiligen Steuerzogen, die Anzahl der Zellen aufgetragen auf oberen Quadranten (UL + UR) höher. FACS-Besitzstandsition Einstellungen waren wie folgt: Spannung Kanäle: FL-1: Log 582; FL-4:. 410 log d) Histogramm zeigt den Prozentsatz von Zellen (UL + UR) durch oxidativen Stress in H 2 O 2-behandelten Embryonen und jeweilige Steuer betroffen. Die Messungen werden in C gezeigten Proben zusammen. Zellen, die durch oxidativen Stress beeinflusst werden, indem allgemeine ROS-empfindlichen Fluoreszenzsonde (, 2,5 uM CellROX) detektiert. Die Ergebnisse sind der Mittelwert von n = 2 verschiedene biologische Wiederholungen ± SD. E) Das Histogramm zeigt den Prozentsatz von Endothelzellen (GFP +) durch oxidativen Stress (ROS +) in H 2 O 2-behandelten Embryonen und jeweilige Steuer betroffen. Die Messungen werden in C gezeigten Proben zusammen. Die Ergebnisse sind der Mittelwert von n = 2 verschiedene biologische Wiederholungen ± SD. F) Histogramm zeigt den Prozentsatz von Zellen, die durch oxidativen Stress (ROS +) in nrf2a morphants betroffen (nrf2a MO) und die jeweiligen Kontrollen(Ctrl MO) bei 24 hpf. Die Ergebnisse sind der Mittelwert von n = 2 verschiedene biologische Wiederholungen ± SD G) Das Histogramm zeigt den Prozentsatz von Zellen, die durch oxidativen Stress beeinflusst mitochondrialen in behandelten Embryonen (Rotenon;. 10 uM) und den jeweiligen Steuerungen (Ctrl; DMSO) bei 72 hpf. Nach Dissoziation von Embryonen in Einzelzellen wurde mitochondrialen oxidativen Stress (mitochondriale ROS +) mit einer mitochondrialen spezifischen Sonde (; 5 uM MitoSOX) gemessen. Die Ergebnisse sind der Mittelwert von n = 3 unterschiedliche biologische Wiederholungen ± SD.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.