Summary
Pour comprendre la structure des réseaux neuronaux, la caractérisation fonctionnelle et morphologique des neurones individuels est une nécessité. Ici, nous démontrons juxtasomal étiquetage biocytine, qui permet des enregistrements électrophysiologiques dans la configuration extracellulaire, tout en conservant la capacité d'étiqueter intracellulaire du neurone pour la reconstruction post-hoc de l'architecture dendritique et axonale.
Abstract
Le cortex cérébral est caractérisé par de multiples couches et de nombreux types cellulaires distincts qui, ensemble, en tant que réseau sont responsables de nombreuses fonctions cognitives supérieures, y compris la prise de décisions, le comportement sensori-guidée ou de la mémoire. Pour comprendre comment ces réseaux neuronaux complexes effectuer des tâches, une étape cruciale consiste à déterminer la fonction (ou l'activité électrique) de types de cellules individuelles au sein du réseau, de préférence lorsque l'animal exécute une tâche cognitive pertinente. En outre, il est également important de déterminer la structure anatomique du réseau et l'architecture morphologique des neurones individuels pour permettre l'ingénierie inverse du réseau cortical. Percées techniques disponibles aujourd'hui permettent d'enregistrer l'activité cellulaire en éveil, se comporter animaux avec l'option précieuse de post hoc identifier les neurones enregistrés. Ici, nous démontrons la technique de marquage juxtasomal de biocytine, qui implique l'action d'enregistrement potentiomètreal dopage dans le extracellulaire (ou loose-patch) configuration à l'aide de pipettes de patch classiques. La configuration de l'enregistrement de juxtasomal est relativement stable et applicables à l'ensemble des conditions de comportement, y compris anesthésiés, sédation, éveillé tête fixe, et même dans l'animal se déplacer librement. Ainsi, ce procédé permet d'associer un type de cellule spécifique dopage potentiel d'action au cours de comportement de l'animal à la reconstruction des neurones individuels et finalement, l'ensemble du microcircuit cortical. Dans cette vidéo, manuscrit, nous montrons comment les neurones individuels dans la configuration de juxtasomal peuvent être étiquetés avec biocytine chez le rat anesthésié uréthane pour l'identification et la reconstruction post-hoc morphologique.
Introduction
Les réseaux de neurones sont constitués de plusieurs types de cellules, caractérisé par les propriétés morphologiques et physiologiques très spécifiques 7.1. En conséquence, les types de cellules individuelles des tâches spécialisées à l'intérieur du réseau (voir par exemple Gentet et al. 8 et Burgalossi et al. 9). Nous commençons seulement à comprendre les fonctions spécifiques de type cellulaire à travers les réseaux neuronaux et beaucoup reste à découvrir. A cette fin, de nombreux laboratoires mettent en œuvre des approches expérimentales qui permettent l'analyse des propriétés morphologiques de la même population neuronale à partir de laquelle les paramètres physiologiques ont été obtenus 1,10-15. Ici, nous démontrons la technique de marquage de juxtasomal 16,17 qui implique des enregistrements électrophysiologiques en utilisant des pipettes de patch classiques dans la configuration extracellulaire (donc non invasif) en combinaison avec l'électroporation du neurone enregistré avec biocytine. Laavantage majeur de cette approche est que la nature non invasive permet de s'assurer que l'action de dopage potentiel de neurones individuels est enregistrée sans modifier (par exemple, la dialyse), la teneur intracellulaire de la cellule. Suivi par électroporation, l'approche de juxtasomal offre la possibilité d'identification et de reconstruction post-hoc cellule de lier la fonction (physiologie) à la structure (morphologie). Typiquement, la reconstruction comprend la reconstruction morphologique de morphologie dendritique et axonale qui peut être étendue à la quantification de la colonne vertébrale et / ou des densités Bouton ou encore la reconstruction de la morphologie neuronale à une résolution nanométrique en utilisant la microscopie électronique. La technique d'enregistrement de juxtasomal peut être utilisé pour des enregistrements in vivo de divers types de cellules à travers les couches corticales ou dans les zones sous-corticales dans une gamme d'espèces, bien que la plupart des études ont appliqué la technique dans les petits rongeurs tels que les souris ou les rats. Notre recherche se concentre sur l'enregistrement et l'étiquetage des neuronesde rat primaire cortex somatosensoriel (S1) et implique l'identification visuelle des neurones enregistrés 18, reconstructions dendritiques en combinaison avec un enregistrement précis dans un cadre de référence normalisé de désosser réseaux corticaux 4,19 et reconstruction détaillée de l'architecture axonale à caractériser locale spécifique du type de cellule et projection à long terme cible 20.
Par rapport à vivo des techniques alternatives dans d'enregistrement (intracellulaires ou de cellules entières), les enregistrements juxtasomal sont relativement stables et peuvent donc être appliquées dans tous les États de comportement, y compris anesthésiés 21,22, sédation 14, éveillé animaux de la tête fixe 23, ou même librement mobiles 9 . Ici, nous montrons l'étiquetage juxtasomal dans S1 d'un rat d'uréthane anesthésiés, mais nous insistons sur l'applicabilité générale de cette technique à de nombreuses préparations de choix.
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Protocol
Une. Préparation de l'animal
Toutes les procédures expérimentales sont menées en conformité avec la loi néerlandaise et après évaluation par un comité d'éthique local à l'Université VU d'Amsterdam, aux Pays-Bas.
- Anesthésier un rat Wistar (P25-P45, ♂ / ♀) avec de l'isoflurane (2-3% dans de l'oxygène) et ensuite avec de l'uréthane (20% dans 0,9% de NaCl, 1.6 à 1.7 g / kg) par injection intrapéritonéale. Évaluer la profondeur de l'anesthésie en surveillant pincée retrait, les réflexes des paupières, et les mouvements vibrisses.
- Administrer une dose supplémentaire d'uréthane (10% de la dose initiale) dans le cas où l'animal ne parvient pas à la profondeur de l'anesthésie suffisante ou lorsque des secousses vibrisses sont observées au cours de l'expérience.
- Placer l'animal anesthésié sur le cadre stéréotaxique équipé d'un patin chauffant, à insérer une sonde de température rectale et à maintenir la température du corps de l'animal à 37,5 ± 0,5 ° C par une couverture chauffante.
- Injecter 100 ul de lidocaïne à 1% (dans du NaCl 0,9%), sous-cutanée pour l'anesthésie locale au site d'opération et d'attendre 3 à 5 min. Retirez la peau qui recouvre la surface du crâne en coupant dans le sens caudal à rostral et nettoyer le tissu restant.
- Nettoyez le crâne largement avec 0,9% de NaCl et tampons absorbants.
- Déterminer les coordonnées de la zone cible sur l'hémisphère gauche (pour cortex somatosensoriel primaire (S1): 2,5 mm et 5,5 mm postérieur au bregma latéral). Marquez l'emplacement sur le crâne avec un marqueur de la peau chirurgicale.
- Racler l'os doucement par une fraise dentaire à partir de la région d'intérêt jusqu'à ce que l'os devient transparent et les vaisseaux sanguins sont clairement visibles.
- Ajouter un 0,5 mm x 0,5 mm craniotomie par découpage d'une fenêtre dans le crâne amincie avec un scalpel (n ° 11), en évitant d'endommager la dure-mèreet les vaisseaux sanguins. En option: marquer les bords de la craniotomie en utilisant un marqueur de la peau chirurgicale pour améliorer la visibilité.
- Appliquez une fine couche de colle sur le crâne sec et ciment dentaire pour construire une salle de bain (c'est à dire de la chambre d'enregistrement) entourant la craniotomie.
- Coupez les moustaches du côté controlatéral à exactement 5 mm du follicule moustache. Facultatif: mettre en évidence les moustaches taillées avec mascara noir.
2. Juxtasomal Recordings et Biocytin étiquetage
- Assurez-pipettes de patch du verre borosilicate avec un diamètre de pointe à l'intérieur de ~ 1 pm pour obtenir électrodes avec 3-5 résistance de MQ. Remarque: La morphologie de la pipette idéal pour l'enregistrement de juxtasomal est un cône progressif mince, un angle de cône faible, et un ~ 1 um bout (figure 1).
- En fonction de la profondeur d'enregistrement (par rapport à la surface de la pie-mère), les dimensions de cône de l'électrode d'enregistrement doivent être ajustées. Critique important est que til cône diamètre doit être inférieure à 75 pm au point d'entrée dans le cerveau pour éviter les dommages mécaniques ou de stress à la zone d'enregistrement. Ceci indique que, pour des enregistrements corticales superficielles, un cône de 300 à 500 um avec un diamètre extérieur d'au maximum 75 um est nécessaire (figure 1A), alors que les enregistrements de couches corticales relativement profonds nécessitent une conicité plus de 1,500-1,800 pm, de nouveau avec extérieur maximal diamètre de 75 pm (1,800 um à partir de la pointe d'électrode).
- Chargez la pipette de patch avec la sonnerie de rat normal (IRB) additionné de 2% biocytine (voir le tableau 1 pour les solutions et réactifs) et monter la pipette de patch sur une scène de tête fixé à un micromanipulateur.
- Régler l'angle du support d'électrode à 34 ° par rapport au plan sagittal de cibler spécifiquement la colonne D2 de rat S1.
- Connectez le stade de la tête à un amplificateur à pont-mode (c.-à-pince de courant).
- Placez le patchpipette à proximité de la craniotomie. Remplir la baignoire avec 0,9% de NaCl et de déterminer la résistance de l'électrode qui doit être comprise entre 3-5 MQ, évalués en appliquant une impulsion carrée avec injection de courant positif (1 nA, 200 ms on / off).
- Établir surpression de 100-150 mbar et faire progresser la pipette de patch dans une um étapes tout en appliquant un courant positif impulsions carrées (1 nA, 200 ms on / off). Suivre l'évolution de la résistance solide à établir le contact avec la dure-mère. À ce stade, de définir les coordonnées du micromanipulateur à «zéro» pour permettre des mesures précises de profondeur.
- Avancez dans 1 um étape-mode jusqu'à ce que la pipette de patch pénètre la dure-mère indiquée par une chute soudaine de la résistance de l'électrode. Retirer la pression de maintien de la pipette.
- Rechercher des unités simples tout en avançant dans une um étapes. Surveillance de la résistance de l'électrode en continu en appliquant 200 ms on / off impulsions. Une augmentation de la résistance électrode typicallié indique la proximité d'un seul neurone. Avancez jusqu'à ce que l'électrode potentiel d'action positive (AP) des formes d'onde de ~ 2 mV sont enregistrées (Figures 2A et 2B).
- Facultatif: Enregistrez le modèle de dopage spontanée du neurone et déterminer moustache évoqués dopage, par exemple, de déviation caudale moustaches individuels pour 200 ms à un angle de 3,3 ° en utilisant un dispositif piézo-électrique 18.
- Avancer l'électrode jusqu'à ce que la résistance est 25-35 MQ et les pointes ont des amplitudes de 3-8 mV pour obtenir des conditions optimales de remplissage de juxtasomal. Commencez le remplissage de juxtasomal en appliquant des impulsions carrées de courant positif (1 nA, 200 ms on / off). Lentement et progressivement augmenter le courant par pas de 0,1 nA tout en surveillant la forme d'onde de l'AP et de la fréquence (figures 2A et 2B).
- Surveillance de l'ouverture de la membrane comme une nette augmentation de la fréquence AP au cours de la sur-phase de l'impulsion de bloc (figure 2C (figures 2C et 2D). Paramètres supplémentaires comprennent une augmentation du bruit ou un petit (1-5 mV) négatif décalage DC.
- Augmenter ou diminuer le courant (1 nA) pendant le remplissage afin de maintenir la perfusion de biocytine stable. Réduire ou d'arrêter les impulsions de courant lors d'une augmentation brusque de la fréquence AP pour éviter la toxicité par excès afflux d'ions extracellulaires, tels que des ions sodium. Remarque: chaque neurone réagit différemment à l'injection de courant et juxtasomal paramètres d'étiquetage doivent être ajustés en fonction des conditions d'enregistrement individuels.
- Suivre de près le signal après l'arrêt de l'injection de courant. La forme d'onde de pic après une séance de remplissage est généralement élargie et montre une forte réduction après hyperpolarisation. Attendre la récupération du neurone, ce qui est évident lorsque la forme d'onde de transitoire revient à ses propriétés d'origine (c'est à dire la présence d'normale après-hyperpolarisation, figure 2).
- Répétez biocytine remplissage sessions après la récupération complète du neurone à augmenter la charge biocytine pour une meilleure qualité de la coloration.
- Rétracter la pipette de patch par pas de 1 pm jusqu'à ce que l'amplitude de crête diminue pour réduire toute contrainte mécanique de la cellule. Attendez au moins 1 heure pour la biocytine à diffuser intracellulaire tout en surveillant étroitement la température du corps de l'animal et de la respiration.
3. Perfusion de l'animal et retrait du cerveau
- Préparer la mise en place de la perfusion, rincer, et précharger le tube avec 0,9% de NaCl.
- Placez l'animal sur un plateau chirurgical et fixer avec une bande d'étiquetage standard. Assurer une profondeur suffisante de l'anesthésie; pincée de pied et les réflexes des paupières doivent être absents.
- Faire une incision dedans en dehors (5-6 cm) à travers la paroi abdominale juste en dessous de la cage thoracique et continuer en direction postéro-antérieure à exposer le sternum.Tirez le sternum en avant et bien séparer le foie de la membrane.
- Faire une petite incision dans la membrane, couper à travers les côtes inférieures et continuer l'incision le long de toute la longueur de la cavité abdominale pour exposer le coeur.
- Retirez le péricarde.
- Insérez l'aiguille dans le ventricule gauche et faire une incision dans l'oreillette droite. Perfuse avec du NaCl 0,9% (~ 8 ml / min) jusqu'à ce que la décoloration du foie est terminée.
- Mettez la perfusion à 4% de paraformaldéhyde (PFA) jusqu'à ce que la rigidité de l'avant patte et la mâchoire inférieure est apparente.
- Décapite les rats en utilisant une paire de ciseaux
- Retirez les muscles du cou restants et exposer le crâne complètement.
- Positionner les ciseaux dans le tronc cérébral sur la face dorsale et couper l'os avec soin le long de la suture sagittale, en maintenant la position dorsale.
- Retirer les os de part et d'autre de la suture sagittale pour exposer le cerveau en utilisant une pince. Retirez délicatement la durée pour éviter dAmage.
- Insérez délicatement une spatule mousse à la face ventrale du cerveau et enlever délicatement le cerveau.
- Post-fixer l'ensemble de la nuit de cerveau en PFA à 4 ° C. Mettez le cerveau à 0,05 M de tampon phosphate (PB) et stocker à 4 ° C.
4. Couper en tranches le cerveau dans les sections tangentielles
- Prenez le cerveau de l'0,05 M PB et le mettre sur un papier filtre face antérieure. Utilisez une lame de rasoir pour couper le cervelet dans le plan coronal et séparer les hémisphères en coupant le long du plan sagittal milieu.
- Appliquer colle sur la plate-forme de montage et monter l'hémisphère gauche de son plan sagittal avec antérieure vers la droite. Fixez la plate-forme de montage à un angle de 45 ° sur un vibratome et plonger le cerveau dans 0,05 M PB.
- Fixer une lame de rasoir sur le vibratome et faire en sorte que le premier contact avec la surface du cerveau se trouve au milieu du plan antéro-postérieur de l'hémisphère. Couper 24 100 umsections et les recueillir dans une plaque de 24 puits contenant 0,05 M de PB.
5. Procédures histologiques
- Effectuer des protocoles pour la coloration histologique cytochrome oxydase et 24 la biotine-peroxydase-avidine Procédé selon l'une des méthodes 25 décrites précédemment. Facultatif: visualiser biocytine utilisant des conjugués fluorescents avidine / streptavidine-Alexa. Cela permet en outre double coloration avec des techniques de traçage rétrograde ou antérograde.
- Laver les sections 5 x 5 min avec 0,05 M de PB et préparer le tétrachlorhydrate de 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) solution pour la coloration de la cytochrome oxydase pour visualiser les fûts dans la couche 4 (L4) de S1-contenant (voir le tableau 2 pour les solutions et réactifs). Incuber sections 6-12 de la pie dans la solution préchauffé pendant 30-45 min à 37 ° C.
- Rincer les sections avec 0,05 M PB pour 6 x 5 min et éteindre l'activité de la peroxydase endogène en incubant les sections dans 3% de H 2 2 à 0,05 M de PB pendant 20 min à température ambiante (RT).
- Rincer les sections avec 0,05 M PB pour 5 x 10 min. Incuber les coupes dans ABC-solution (voir le tableau 3 pour les solutions et réactifs) pendant une nuit à 4 ° C.
- Rincer sections avec 0,05 M de PB à 5 x 10 min et préparer la solution-DAB pour visualiser le neurone de biocytine-remplie (voir tableau 4 pour les solutions et les réactifs). Incuber les coupes dans la solution filtrée pendant 45-60 min à température ambiante.
- Rincer les sections avec 0,05 M PB pour 5 x 10 min. Sections de montage sur des lames de microscope et lamelles à l'aide Mowiol (voir le tableau 5 pour des solutions et réactifs).
- Déterminer la qualité de l'étiquetage par microscopie optique.
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Representative Results
La connaissance détaillée de la structure 3D de neurones individuels est cruciale pour élucider les principes d'organisation des réseaux de neurones. Notre méthode consiste à un pipeline pour atteindre la haute qualité de l'étiquetage biocytine partir d'une préparation in vivo, ce qui permet la classification neuronale après hoc et la reconstruction détaillée de l'architecture dendritique et axonale des neurones isolés à haute résolution. En fonction de la qualité de l'étiquetage des juxtasomal, les neurones sont récupérés avec différentes intensités-DAB allant de faible à des signaux DAB intenses à des positions qui correspondent très exactement à l'emplacement d'enregistrement 19,26. Dans notre laboratoire, un expérimentateur formation fonctionne à un taux de réussite de 30-40% en uréthane rongeurs anesthésiés. Ceci indique que l'un neurone est sélectionné pour la reconstruction dendritique et axonale dans les expériences sur trois, qui se réunit alors les critères suivants: 1) un seul neurone rempli dans le cerveau, 2) une excellente qualité d'étiquetage,3) signal de biocytine est constante le long de projections axonales et ne diminue pas au niveau des terminaisons distales, 4) Cyt C contre-coloration est réussie pour permettre l'enregistrement des neurones, et 5) pas de dommages à des tranches de cerveau pendant l'histologie. Le facteur limitant est généralement insuffisante étiquetage biocytine, ce qui signifie que dans ~ 80% de toutes les expériences (anesthésiés et / ou d'éveil), le neurone enregistré sera récupéré (soma et dendrites). Ceci est suffisant pour le type de cellules mais pas pour la classification reconstruction fiable et complet de l'architecture axonale. Dans la figure 3, nous montrons deux exemples de neurones biocytine marqué avec signal DAB après étiquetage approprié; juxtasomal un neurone épineux pyramidale (figure 3A) et un interneurones (figure 3B). Reconstruction de sections tangentielles adjacentes permet la reconstruction de série pour obtenir la pleine morphologie neuronale 18,22,23,27,28. De plus, la coloration histologique de trames de référence anatomiques (par exemple encortex somatosensoriel primaire) permet l'enregistrement de neurones individuels aux cadres normalisés de référence 4,19. Les deux exemples présentés ici reflètent les conditions optimales pour classer et ensuite reconstruire les propriétés morphologiques avec un système manuel ou automatisé (Figure 4) 15,20,29-31.
Caractéristiques des électrodes Figure 1. Pour juxtasomal biocytine étiquetage. (A) de l'électrode pour l'enregistrement de juxtasomal de neurones corticaux à 300-500 profondeur de um par rapport à la surface de la pie-mère. (B) de l'électrode pour l'enregistrement de juxtasomal de neurones corticaux à 1,500-1,800 pm profondeur d'enregistrement. Notez la différence de longueur du cône entre les panneaux (A) et (B). (
Figure 2. Propriétés électrophysiologiques lors du remplissage de biocytine. (A, B) des potentiels d'action spontanés sont observées lors de l'application d'impulsions carrées (200 msec, on / off) avec un courant positif, mais avec une amplitude insuffisante pour charger le neurone avec biocytine. (C) L'augmentation de la amplitude de courant dans l'ouverture de la membrane neuronale permettant biocytine chargement, visible dans la trace comme rafale dopage à verrouillage de phase au cours de l'o sur phasef l'impulsion. (D) La forme d'onde de transitoire pendant le remplissage présente une largeur augmentée et réduite après hyperpolarisation. Pic d'amplitude est normalisée à pic amplitude B pour comparaison. (E, F) Après la reprise réussie du neurone à la suite de la session de remplissage une largeur de pointe normale et la fréquence peuvent être observées. Pic d'amplitude est normalisée à pic amplitude B pour comparaison. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 3. Étiquetage Biocytin-DAB de neurones juxtasomally remplis en primaire cortex somatosensoriel de rats anesthésiés uréthane. (A) neurone pyramidal dans tangentiellevue. Notez la différence importante de la taille de diamètre de dendrites et des axones. (B) rapide dopage interneurones dans tangentielle. Notez la structure de perles des dendrites et des axones. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 4. Reconstruction numérique de neurone juxtasomally marqué. (A) de l'image projetée Neuron à haute résolution (mais faible grossissement) obtenu à partir de 100 um tranche tangentielle de la couche 6 neurones de rat cortex somatosensoriel primaire à l'aide pipeline d'imagerie semi-automatisé. (B) La même image que dans (A) à la reconstruction numérique automatisé recouvert (axone en bleu, dendrite en rouge, respectivement). (C) boîte de support de (B) agrandie pour illustrer la fiabilité de la reconstruction axonale utilisant étiquetage juxtasomal. Notez les boutons axone sur toute la longueur de l'axone, deux boutons sont mis en évidence par des flèches noires. Cliquez ici pour agrandir l'image.
| mM | g / litre | |
| 135 | NaCl | 7,8894 |
| 5.4 | KCl | 0,40257 |
| 1.8 | CaCl | 0,26464 | |
| 1 | MgCl2 | 0,2033 |
| 5 | HEPES | 1.1915 |
| Ajuster le pH à 7,2 avec NaOH | ||
| Ajouter 20 biocytine mg/ml-1 |
Tableau 1. Normale Rat sonnerie complétée par Biocytin.
| 8 mg | Cytochrome C de coeur équine |
| 8 mg | Catalase à partir de foie de bovin |
| 265 pi | 75 mg / ml de DAB |
| Dissoudre dans 40 ml 0,05 M PB | |
| solution de filtrage et de préchauffage à 37 ° C | |
Tableau 2. Solution pour la cytochrome C oxydase coloration.
| Une baisse | Réactif A |
| Une baisse | Réactif B |
| 0,5 ml | 10% de Triton X100 |
| ight = le style "21" = "height: 21px;"> Dissoudre dans 9,5 ml 0,05 M PB (45 min à l'avance) | |
| Ajouter 410 solution de pl / puits | |
| Protocole pour ABC-solution pour une plaque de 24 puits. | |
Tableau 3. Solution avec Vectastain ABC-kit standard.
| 265 pi | 75 mg / ml de DAB |
| 13,4 pi | 30% de H 2 O 2 |
Tableau 4. Solution pour DAB coloration.
| 6 g | Glycérol qualité analytique |
| 2,4 g | Mowiol 4-88 |
| Remuer manuellement 10 min à manteau Mowiol avec le glycérol | |
| 6 ml | Distillée H 2 O |
| Incuber à température ambiante pendant 2 h | |
| 12 ml | 0,2 M Tris pH 8,5 |
| Incuber dans 50 ° C au bain-marie pendant 1 heure - O / N, remuer de temps en temps | |
| Centrifugeuse 15 min à 5000 xg, aliquote et conserver à -20 ° C | |
Tableau 5. Solution mowiol.
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Discussion
La méthode de juxtasomal permet d'enregistrer dans l'action in vivo dopage potentiel des unités simples dans des conditions de comportement (anesthésiés, éveillé tête fixe ou mobile librement) avec l'option de biocytine-étiquetage du neurone enregistré pour la classification post hoc de type cellulaire et / ou la reconstruction 3D. L'avantage majeur est d'obtenir des paramètres physiologiques de la configuration extracellulaire (donc non invasif), tout en étant capable de marquer de manière intracellulaire du neurone avec biocytine 16,17,32. En plus de l'étiquetage biocytine, cette technique peut être utilisée pour injecter les neurones avec de l'ADN, de l'ARN, des protéines, ou des colorants fluorescents 33,34. L'inconvénient le plus évident de cette approche est peut-être l'absence de contrôle visuel de la qualité de l'étiquetage, et donc aucun moyen de vérifier la qualité de l'étiquetage lors de l'expérience. Cependant, les conditions d'enregistrement et en particulier l'action de forme potentiel peuvent être utilisés pour évaluer le succès de la procédure de labellisation. Pour instance, la probabilité de récupérer un neurone avec dense étiquette biocytine-DAB augmente lorsque la fréquence de dopage au cours des impulsions de courant augmente de façon spectaculaire, accompagnée de la disparition de l'après-hyperpolarisation et l'élargissement de l'action onde potentiel (voir la figure 2). En outre, la qualité de la biocytine marquage est directement corrélée à la longueur additionnée des sessions d'étiquetage distincts, de telle sorte que plusieurs sessions de remplissage de longues (> 60 sec) se traduira par une meilleure qualité histologique par rapport à un individu séance de remplissage courte (<30 s) . Enfin, le temps de survie pour la diffusion du traceur de façon critique de déterminer l'intensité de marquage des compartiments distales. En général, le temps de survie de 1 heure après l'électroporation de haute qualité assure un étiquetage adéquat de longue portée projections axonales intracorticales. Un exemple de ces projections à long terme sont les neurones du cortex somatosensoriel primaire saillie de cortex somatosensoriel secondaire ou dysgranularles zones en saillie sont donc celles des zones qui sont à une distance de plusieurs millimètres à partir du site d'étiquetage 4,20. Lorsque projections axonales de même plus grandes dimensions sont étudiées (telles que des projections thalamo), le temps de survie devrait être augmenté de 15. Il est important de comprendre, c'est que l'électroporation du neurone aura un effet profond sur l'état physiologique du neurone en raison de l'afflux excessif de sodium de la solution d'électrode. Ainsi, il est fortement recommandé de se mêler de remplissage épisodes avec des épisodes de repos pour permettre une récupération complète de l'action dopage potentiel et la surveillance des conditions d'enregistrement après le remplissage des sessions quand biocytine est autorisé à diffuser le long de la dendritiques et axonales arborisations 12,31.
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Disclosures
Les authros n'ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier les professeurs. Huibert Mansvelder et Bert Sakmann pour un large soutien, le Dr Marcel Oberlaender pour des discussions fructueuses et fournir traçage neuronal, et Brendan Lodder pour l'assistance technique. Les données ont été acquises en utilisant la ntrode VI pour LabView, généreusement offert par R. Bruno (Columbia Univ., NY, USA). Cette recherche a été financée par la Société Max Planck et le Centre Bernstein for Computational Neuroscience, Tübingen (financé par le Ministère fédéral allemand de l'Éducation et de la Recherche (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Centre pour Neurogenomics et la recherche cognitive (CNCR) , Neuroscience Campus Amsterdam (NCA), le financement de CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 et ENC-réseau # p3-c3) et l'Université VU d'Amsterdam.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SM-6 control system | Luigs Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, Inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| LabView | National Instruments, Austin, TX, USA | LabView acquisition software | |
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY | ||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
References
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