Summary
Neuronal नेटवर्क की संरचना को समझने के लिए, व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की कार्यात्मक और रूपात्मक लक्षण वर्णन एक जरूरत है. यहाँ, हम juxtasomal biocytin बाह्य विन्यास में electrophysiological रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है जो लेबलिंग,, अभी तक intracellularly वृक्ष के समान और axonal वास्तुकला का पद अस्थायी पुनर्निर्माण के लिए न्यूरॉन लेबल करने की क्षमता बनाए रखने का प्रदर्शन.
Abstract
सेरेब्रल कॉर्टेक्स एक साथ एक नेटवर्क के रूप में निर्णय लेने, संवेदी निर्देशित व्यवहार या स्मृति सहित कई उच्च संज्ञानात्मक कार्यों के लिए जिम्मेदार हैं कि कई परतों और कई अलग सेल प्रकार की विशेषता है. ऐसे जटिल neuronal नेटवर्क में इस तरह के कार्य करने के लिए कैसे समझते हैं, एक महत्वपूर्ण कदम जानवर एक प्रासंगिक संज्ञानात्मक कार्य प्रदर्शन कर रहा है जब preferentially, नेटवर्क के भीतर व्यक्तिगत सेल प्रकार के समारोह (या बिजली की गतिविधि) निर्धारित करने के लिए है. इसके अतिरिक्त, यह रिवर्स cortical नेटवर्क इंजीनियरिंग अनुमति देने के लिए व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के नेटवर्क और रूपात्मक वास्तुकला की शारीरिक संरचना निर्धारित करने के लिए भी उतना ही महत्वपूर्ण है. आज उपलब्ध तकनीकी सफलताओं दर्ज न्यूरॉन्स की पहचान पद अस्थायी का मूल्यवान विकल्प के साथ जानवरों से बर्ताव कर, जाग में सेलुलर गतिविधि रिकॉर्डिंग की अनुमति. यहाँ, हम रिकॉर्डिंग कार्रवाई potenti शामिल है जो juxtasomal biocytin लेबलिंग तकनीक का प्रदर्शनअल पारंपरिक पैच pipettes का उपयोग कोशिकी (या ढीले पैच) विन्यास में spiking. juxtasomal रिकॉर्डिंग विन्यास, anesthetized बेहोश, जाग सिर तय की, और यहां तक कि स्वतंत्र रूप से चलती जानवर में शामिल है, व्यवहार शर्तों भर में अपेक्षाकृत स्थिर है और लागू है. इस प्रकार, इस विधि व्यक्तिगत न्यूरॉन्स और अंत में, पूरे cortical Microcircuit के पुनर्निर्माण के लिए पशुओं के व्यवहार के दौरान सेल प्रकार विशिष्ट कार्रवाई संभावित स्पाइकिंग जोड़ने की अनुमति देता है. इस वीडियो पांडुलिपि में, हम juxtasomal विन्यास में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स पद अस्थायी पहचान और रूपात्मक पुनर्निर्माण के लिए urethane-anaesthetized चूहे में biocytin साथ लेबल किया जा सकता है कि कैसे दिखा.
Introduction
Neuronal नेटवर्क अत्यधिक विशिष्ट रूपात्मक और शारीरिक गुणों 1-7 विशेषता द्वारा अनेक प्रकार की कोशिकाओं से मिलकर बनता है. एक परिणाम के रूप में, व्यक्तिगत प्रकार की कोशिकाओं (उदाहरण के लिए देखें Gentet एट अल. 8 और Burgalossi एट अल. 9) नेटवर्क के भीतर विशेष कार्य करते हैं. हम केवल neuronal नेटवर्क भर में सेल प्रकार विशिष्ट कार्यों को समझने की शुरुआत कर रहे हैं और ज्यादा खोजे जाने की अभी भी है. यह अंत करने के लिए, कई प्रयोगशालाओं शारीरिक मापदंड 1,10-15 प्राप्त किया गया है, जिसमें से एक ही neuronal आबादी की रूपात्मक गुणों का विश्लेषण है कि अनुमति प्रयोगात्मक दृष्टिकोण को लागू कर रहे हैं. यहाँ, हम biocytin साथ दर्ज न्यूरॉन की electroporation के साथ संयोजन में बाह्य (इस प्रकार noninvasive) विन्यास में पारंपरिक पैच pipettes का उपयोग electrophysiological रिकॉर्डिंग शामिल है जो juxtasomal लेबलिंग तकनीक 16,17 प्रदर्शित करता है.इस दृष्टिकोण का प्रमुख लाभ noninvasive प्रकृति व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की संभावित कार्रवाई spiking (जैसे dialyzing) सेल के intracellular सामग्री फेरबदल के बिना दर्ज की गई है कि यह सुनिश्चित करता है कि है. Electroporation द्वारा पीछा किया, juxtasomal दृष्टिकोण संरचना (आकृति विज्ञान) के लिए समारोह (फिजियोलॉजी) से जोड़ने के लिए पद अस्थायी सेल पहचान और पुनर्निर्माण का विकल्प प्रदान करता है. आमतौर पर, रूपात्मक पुनर्निर्माण रीढ़ की हड्डी और / या bouton घनत्व की मात्रा का ठहराव या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग नैनोमीटर प्रस्ताव पर neuronal आकारिकी का भी पुनर्निर्माण के लिए बढ़ाया जा सकता है जो वृक्ष के समान और axonal आकारिकी के पुनर्निर्माण शामिल है. सबसे अध्ययन चूहों या चूहों के रूप में छोटे कृन्तकों में तकनीक को लागू किया है, हालांकि juxtasomal रिकॉर्डिंग तकनीक, cortical परतों में या प्रजातियों में से एक रेंज में उप cortical क्षेत्रों में विभिन्न सेल प्रकार के vivo रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारे शोध से न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग और लेबलिंग पर ध्यान केंद्रित किया हैचूहे प्राथमिक somatosensory प्रांतस्था (S1) से और दर्ज न्यूरॉन्स 18 के दृश्य पहचान शामिल है, एक मानकीकृत संदर्भ फ्रेम में सटीक पंजीकरण के साथ संयोजन में वृक्ष के समान पुनर्निर्माण सेल प्रकार विशिष्ट स्थानीय चिह्नित करने के लिए cortical नेटवर्क 4,19 और axonal वास्तुकला का विस्तृत पुनर्निर्माण रिवर्स इंजीनियर और लंबी दूरी के प्रक्षेपण 20 लक्ष्यों.
जाग सिर तय 23, या भी स्वतंत्र रूप से चलती जानवरों 9, वैकल्पिक vivo में रिकॉर्डिंग तकनीक (intracellular या पूरे सेल) की तुलना में, juxtasomal रिकॉर्डिंग अपेक्षाकृत स्थिर हैं और इसलिए anesthetized 21,22 सहित व्यवहार राज्य भर में लागू किया जा सकता है, 14 बेहोश . हम चुनाव की सारी तैयारियाँ करने के लिए इस तकनीक का सामान्य प्रयोज्यता जोर देना हालांकि यहाँ, हम, एक urethane-anesthetized चूहे की S1 में juxtasomal लेबलिंग दिखा.
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Protocol
1. पशु की तैयारी
सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं नजरों से देख विश्वविद्यालय एम्स्टर्डम, नीदरलैंड में एक स्थानीय नैतिक समिति से डच कानून के अनुसार और मूल्यांकन के बाद किया जाता है.
- Intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा (0.9% NaCl, 1.6-1.7 ग्राम / किलो में 20%) urethane के साथ isoflurane (ऑक्सीजन में 2-3%) के साथ और बाद में एक Wistar चूहा (P25-P45, ♂ / ♀) anesthetize. चुटकी वापसी, पलक सजगता, और दृढ़रोम आंदोलनों की निगरानी के द्वारा संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करें.
- मामले में urethane की एक अतिरिक्त खुराक (प्रारंभिक खुराक का 10%) प्रशासन पशु पर्याप्त संवेदनाहारी गहराई तक पहुँच नहीं है या दृढ़रोम twitches प्रयोग के दौरान मनाया जाता है, जब भी.
- एक हीटिंग पैड से लैस stereotaxic फ्रेम पर anesthetized पशु रखें, गुदा तापमान जांच डालने और एक हीटिंग पैड से 37.5 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर पशु के शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए.
- आपरेशन स्थल पर स्थानीय संज्ञाहरण के लिए 100 μl 1% lidocaine subcutaneously (0.9% NaCl में) इंजेक्षन और 3-5 मिनट रुको. दुम को विजय - स्तम्भ दिशा में काटने से खोपड़ी की सतह को कवर त्वचा निकालें और शेष ऊतक साफ.
- 0.9% NaCl और शोषक swabs के साथ बड़े पैमाने पर खोपड़ी को साफ करें.
- (: 2.5 मिमी पीछे और शीर्षस्थान के लिए पार्श्व 5.5 मिमी प्राथमिक somatosensory प्रांतस्था (S1) के लिए) को छोड़ दिया गोलार्द्ध पर लक्षित क्षेत्र के निर्देशांक निर्धारित करते हैं. एक शल्य त्वचा मार्कर पेन के साथ खोपड़ी पर स्थान चिह्नित.
- हड्डी पारदर्शी हो जाता है और रक्त वाहिकाओं स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं जब तक ब्याज के क्षेत्र से एक दंत ड्रिल द्वारा धीरे हड्डी परिमार्जन.
- ड्यूरा मेटर को नुकसान से बचने, एक छुरी (# 11) के साथ पतला खोपड़ी में एक खिड़की काटने से एक 0.5 मिमी x 0.5 मिमी कपाल - उच्छेदन बनाओऔर रक्त वाहिकाओं. वैकल्पिक: दृश्यता में सुधार करने के लिए एक शल्य त्वचा मार्कर पेन का उपयोग कपाल - उच्छेदन के किनारों निशान.
- कपाल - उच्छेदन enclosing एक स्नान (यानी रिकार्डिंग कक्ष) के निर्माण के लिए सूखी खोपड़ी और फिर दंत सीमेंट पर superglue की एक पतली परत लागू करें.
- गलमुच्छा कूप से ठीक 5 मिमी contralateral पक्ष में मूंछ ट्रिम. वैकल्पिक: ब्लैक मस्कारा के साथ छंटनी की मूंछ पर प्रकाश डाला.
2. Juxtasomal रिकॉर्डिंग और Biocytin लेबल
- 3-5 MΩ प्रतिरोध के साथ इलेक्ट्रोड प्राप्त करने के लिए ~ 1 माइक्रोन के अंदर टिप व्यास के साथ borosilicate ग्लास का पैच pipettes बनाओ. नोट: juxtasomal रिकॉर्डिंग के लिए आदर्श पिपेट आकृति विज्ञान एक क्रमिक दुबला घटना, एक कम कोन कोण, और एक ~ 1 माइक्रोन टिप (चित्रा 1) है.
- (Pial सतह के संबंध में) रिकॉर्डिंग गहराई पर निर्भर करता है, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की घटना आयाम समायोजित किया जाना चाहिए. गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है कि टी हैवह व्यास रिकॉर्डिंग क्षेत्र के लिए यांत्रिक क्षति या तनाव से बचने के लिए मस्तिष्क में प्रवेश के बिंदु पर कम से कम 75 माइक्रोन होना चाहिए शंकु. अपेक्षाकृत गहरे cortical परतों से रिकॉर्डिंग अधिक से अधिक बाहरी के साथ फिर से, 1,500-1,800 मीटर की लंबी घटना की आवश्यकता होती है, जबकि इस सतही cortical रिकॉर्डिंग के लिए, ज़्यादा से ज़्यादा 75 माइक्रोन के एक बाहरी व्यास के साथ 300-500 सुक्ष्ममापी की एक घटना (चित्रा 1 ए) की आवश्यकता है कि इंगित करता है (इलेक्ट्रोड टिप से 1,800 मीटर) पर 75 माइक्रोन से व्यास.
- सामान्य चूहे घंटी (एन आर आर) के साथ पैच विंदुक लोड 2% biocytin के साथ पूरक (समाधान और अभिकर्मकों के लिए 1 टेबल देखें) और एक micromanipulator के लिए तय एक सिर मंच पर पैच पिपेट माउंट.
- विशेष रूप से चूहे S1 के डी 2 स्तंभ को लक्षित करने के बाण के समान विमान के लिए सम्मान के साथ 34 ° करने के लिए इलेक्ट्रोड धारक के कोण सेट.
- पुल मोड में एक एम्पलीफायर (यानी वर्तमान दबाना) के लिए सिर मंच से कनेक्ट करें.
- पैच स्थित करेंकपाल - उच्छेदन के करीब निकटता में पिपेट. 0.9% NaCl के साथ स्नान भरें और सकारात्मक मौजूदा इंजेक्शन (1 ना, / बंद पर 200 मिसे) के साथ एक वर्ग पल्स लगाने से आकलन किया 3-5 MΩ के बीच होना चाहिए जो इलेक्ट्रोड प्रतिरोध का निर्धारण.
- वर्ग दालों (1 ना, / बंद पर 200 मिसे) के रूप में सकारात्मक वर्तमान आवेदन करते समय 100-150 एम्बार की overpressure स्थापना और 1 माइक्रोन चरणों में पैच विंदुक अग्रिम. ड्यूरा मेटर के साथ संपर्क स्थापित करने पर मजबूत प्रतिरोध परिवर्तन की निगरानी. इस बिंदु पर, सही गहराई माप अनुमति देने के लिए 'शून्य' को micromanipulator के निर्देशांक निर्धारित किया है.
- पैच विंदुक इलेक्ट्रोड प्रतिरोध में अचानक गिरावट से संकेत ड्यूरा मेटर प्रवेश तक 1 माइक्रोन कदम मोड में अग्रिम. पिपेट की होल्डिंग दबाव निकालें.
- 1 माइक्रोन चरणों में आगे बढ़ रहा है, जबकि एकल इकाइयों के लिए खोज. / बंद दालों पर 200 मिसे लगाने से लगातार इलेक्ट्रोड प्रतिरोध की निगरानी. इलेक्ट्रोड प्रतिरोध typic में वृद्धिसहयोगी एक न्यूरॉन की निकटता को इंगित करता है. सकारात्मक कार्रवाई संभावित (एपी) ~ 2 एम वी के waveforms (आंकड़े 2A और 2 बी) दर्ज कर रहे हैं जब तक इलेक्ट्रोड अग्रिम.
- वैकल्पिक: न्यूरॉन की सहज spiking पैटर्न रिकार्ड और निर्धारित गलमुच्छा पैदा दुमदारी एक piezoelectric डिवाइस 18 का उपयोग कर 3.3 डिग्री के कोण पर 200 मिसे के लिए व्यक्तिगत मूंछ deflecting, उदाहरण के लिए, द्वारा spiking.
- प्रतिरोध 25-35 MΩ है और spikes juxtasomal भरने का इष्टतम स्थितियों को प्राप्त करने के लिए 3-8 एम वी के आयाम है जब तक इलेक्ट्रोड अग्रिम. सकारात्मक वर्तमान (1 ना, / बंद पर 200 मिसे) के वर्ग दालों लगाने से juxtasomal भरने शुरू. एपी तरंग और आवृत्ति (आंकड़े 2A और 2 बी) की निगरानी करते हुए और धीरे धीरे धीरे 0.1 एनए के कदम से मौजूदा वृद्धि हुई है.
- ब्लॉक पल्स (चित्रा -2 के पर चरण के दौरान एपी आवृत्ति में एक स्पष्ट वृद्धि के रूप में झिल्ली उद्घाटन मॉनिटर (आंकड़े -2 सी और 2 डी) से पता चलता है. अतिरिक्त पैरामीटर बढ़ा शोर या एक छोटे (1-5 एम वी) नकारात्मक डीसी पारी शामिल है.
- बढ़ाएँ या स्थिर biocytin आसव बनाए रखने के लिए भरने के समय (1 एनए) वर्तमान में कमी. कम या सोडियम आयनों के रूप में बाह्य आयनों की अतिरिक्त बाढ़ से विषाक्तता से बचने के लिए एपी आवृत्ति की अचानक वृद्धि पर वर्तमान दालों बंद करो. नोट: हर न्यूरॉन लेबलिंग मापदंडों व्यक्ति रिकॉर्डिंग स्थितियों के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता वर्तमान इंजेक्शन और juxtasomal लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया होगी.
- बारीकी से मौजूदा इंजेक्शन को रोकने के बाद संकेत की निगरानी. एक भरने सत्र के बाद स्पाइक तरंग आमतौर पर चौड़ी और एक जोरदार hyperpolarization के बाद कम से पता चलता है. कील तरंग (उसके मूल गुणों को यानी उपस्थिति देता है जब स्पष्ट है जो न्यूरॉन, की वसूली के लिए रुकोसामान्य बाद hyperpolarization, चित्रा 2).
- सुधार धुंधला गुणवत्ता के लिए biocytin लोड बढ़ाने के लिए न्यूरॉन की पूरी वसूली के बाद सत्र भरने biocytin दोहराएँ.
- कील आयाम सेल करने के लिए कोई यांत्रिक तनाव को कम करने के लिए कम हो जाती है जब तक 1 माइक्रोन के चरणों में पैच विंदुक वापस लेना. बारीकी से जानवर के शरीर के तापमान की निगरानी और साँस लेने जबकि intracellularly फैलाना biocytin के लिए कम से कम 1 घंटा रुको.
3. पशु perfusing और ब्रेन निकाल रहा है
- , छिड़काव सेटअप तैयार करें कुल्ला, और 0.9% NaCl के साथ ट्यूबिंग प्रीलोड.
- एक शल्य चिकित्सा ट्रे पर पशु स्थिति और मानक लेबलिंग टेप के साथ सुरक्षित है. संज्ञाहरण के पर्याप्त गहराई सुनिश्चित करना; पैर चुटकी और पलक सजगता अनुपस्थित होना चाहिए.
- बस पसलियों के नीचे पेट की दीवार के माध्यम से चीरा (5-6 सेमी) पार्श्व और उरोस्थि का पर्दाफाश करने के पीछे-पूर्वकाल दिशा में आगे बढ़ने के लिए एक औसत दर्जे का बनाने के.पूर्व से उरोस्थि खींचो और ध्यान से डायाफ्राम से जिगर अलग.
- कम पसलियों के माध्यम से कटौती डायाफ्राम में एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए और दिल को बेनकाब करने के लिए उदर गुहा की पूरी लंबाई के साथ चीरा जारी है.
- पेरीकार्डियम निकालें.
- बाएं वेंट्रिकल में सुई डालें और सही atrium में एक चीरा बनाते हैं. जिगर का रंग बिगाड़ना पूर्ण होने तक 0.9% NaCl (~ 8 मिलीग्राम / मिनट) के साथ छिड़कना.
- सामने पंजा की कठोरता तक 4% paraformaldehyde (पीएफए) के अर्क स्विच और निचले जबड़े स्पष्ट है.
- कैंची की एक जोड़ी का उपयोग चूहा सिर काटना
- शेष गर्दन की मांसपेशियों को निकालें और पूरी तरह से खोपड़ी बेनकाब.
- पृष्ठीय पक्ष पर ब्रेन स्टेम में कैंची स्थिति और पृष्ठीय स्थिति को बनाए रखने, बाण के समान सीवन के साथ सावधानी से हड्डी में कटौती.
- संदंश का उपयोग कर मस्तिष्क का पर्दाफाश करने के बाण के समान सीवन के दोनों ओर से हड्डियों निकालें. ध्यान डी से बचने के लिए ड्यूरा हटानेamage.
- ध्यान से मस्तिष्क के उदर किनारे एक कुंद रंग डालने और धीरे मस्तिष्क को हटा दें.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर पीएफए में पूरे मस्तिष्क रातोंरात परसर्ग 0.05 एम फॉस्फेट बफर (पंजाब) के लिए मस्तिष्क स्विच और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
4. स्पर्शरेखा वर्गों में मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया
- 0.05 एम पंजाब से बाहर मस्तिष्क लो और पूर्वकाल सामना करना पड़ रहा एक फिल्टर पेपर पर रख दिया. राज्याभिषेक विमान के साथ सेरिबैलम काटा और मध्य बाण के समान विमान के साथ काटने से गोलार्द्धों अलग करने के लिए एक तेज धार का प्रयोग करें.
- बढ़ते मंच पर superglue लागू करें और पूर्वकाल सही सामना करना पड़ के साथ अपने बाण के समान विमान पर छोड़ दिया गोलार्द्ध माउंट. एक vibratome पर 45 डिग्री के कोण पर बढ़ते मंच सुरक्षित और 0.05 एम पंजाब में मस्तिष्क डूब.
- Vibratome पर एक रेजर ब्लेड सुरक्षित और मस्तिष्क की सतह के साथ पहले से संपर्क गोलार्द्ध के पूर्वकाल पीछे विमान के बीच में है कि सुनिश्चित करें. 24 100 माइक्रोन कटवर्गों और 0.05 एम पंजाब युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली में उन्हें इकट्ठा.
5. ऊतकीय प्रक्रियाएं
- पहले वर्णित विधियों 25 के अनुसार साइटोक्रोम ऑक्सिडेज़ धुंधला 24 और avidin बायोटिन-peroxidase विधि के लिए ऊतकीय प्रोटोकॉल प्रदर्शन करना. वैकल्पिक: फ्लोरोसेंट avidin / streptavidin-एलेक्सा conjugates का उपयोग biocytin कल्पना. इस अतिरिक्त प्रतिगामी या अग्रगामी अनुरेखण तकनीक के साथ डबल धुंधला अनुमति देता है.
- 0.05 एम पंजाब और 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (थपका) के समाधान के लिए 2 टेबल देखें (परत 4 S1 के (L4) में बैरल कल्पना करने के लिए साइटोक्रोम ऑक्सिडेज़ धुंधला के लिए समाधान युक्त तैयार करने और साथ धो 5 वर्गों एक्स 5 मिनट अभिकर्मकों). 37 डिग्री सेल्सियस पर 30-45 मिनट के लिए preheated समाधान में पिया से वर्गों 6-12 सेते
- 6 एक्स 5 मिनट के लिए 0.05 एम पंजाब के साथ वर्गों कुल्ला और 3% एच 2 में सभी वर्गों incubating द्वारा अंतर्जात peroxidase गतिविधि बुझाना 2.
- 5 एक्स 10 मिनट के लिए 0.05 एम पंजाब के साथ वर्गों कुल्ला. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (समाधान और अभिकर्मकों के लिए 3 टेबल देखें) एबीसी समाधान में वर्गों सेते
- 5 एक्स 10 मिनट के लिए 0.05 एम पंजाब के साथ वर्गों कुल्ला और (समाधान और अभिकर्मकों के लिए तालिका 4 देखें) biocytin से भरे न्यूरॉन कल्पना करने के लिए थपका समाधान तैयार करें. आरटी पर 45-60 मिनट के लिए फ़िल्टर समाधान में वर्गों सेते हैं.
- 5 एक्स 10 मिनट के लिए 0.05 एम पंजाब के साथ वर्गों कुल्ला. माइक्रोस्कोप स्लाइड और Mowiol के साथ कवर पर्ची (समाधान और अभिकर्मकों के लिए 5 तालिका देखें) पर माउंट वर्गों.
- प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग लेबलिंग गुणवत्ता निर्धारित.
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Representative Results
व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की 3 डी संरचना पर विस्तृत ज्ञान neuronal नेटवर्क के संगठनात्मक सिद्धांतों elucidating के लिए महत्वपूर्ण है. हमारे विधि जिससे पद अस्थायी neuronal वर्गीकरण और वृक्ष के समान और उच्च संकल्प में एक न्यूरॉन्स की axonal वास्तुकला का विस्तृत पुनर्निर्माण की अनुमति, एक में vivo तैयारी से उच्च गुणवत्ता biocytin लेबलिंग प्राप्त करने के लिए एक पाइप लाइन शामिल है. Juxtasomal लेबलिंग की गुणवत्ता पर निर्भर करता है, न्यूरॉन्स बेहोश से बहुत सही रिकॉर्डिंग स्थान 19,26 के अनुरूप है कि पदों पर तीव्र थपका संकेतों को लेकर अलग थपका तीव्रता के साथ बरामद कर रहे हैं. हमारी प्रयोगशाला में, एक प्रशिक्षित प्रयोगकर्ता urethane anaesthetized कृन्तकों में 30-40% की सफलता दर पर चल रही है. , मस्तिष्क, 2) उत्कृष्ट लेबलिंग गुणवत्ता में भरा 1) केवल एक न्यूरॉन: यह एक न्यूरॉन तो निम्नलिखित मानदंडों को पूरा करती है, जो एक से तीन के बाहर प्रयोगों में वृक्ष के समान और axonal पुनर्निर्माण के लिए चयन किया गया है कि इंगित करता है3) biocytin संकेत axonal अनुमानों के साथ स्थिर है और 4) CYT सी counterstaining neuronal पंजीकरण की अनुमति के लिए सफल है, बाहर का अंत में कमी, और ऊतक विज्ञान के दौरान मस्तिष्क के स्लाइस को 5) कोई नुकसान नहीं है. सीमित कारक सभी प्रयोगों (anaesthetized और / या जाग) की 80% ~ में, दर्ज न्यूरॉन (सोम और dendrites) बरामद किया जाएगा जिसका अर्थ है कि आम तौर पर अपर्याप्त biocytin लेबलिंग है. इस सेल प्रकार वर्गीकरण के लिए नहीं बल्कि axonal वास्तुकला के विश्वसनीय और पूर्ण पुनर्निर्माण के लिए पर्याप्त है. एक काँटेदार पिरामिड न्यूरॉन (चित्रा 3) और एक interneuron (3B चित्रा), चित्रा 3 में, हम उपयुक्त juxtasomal लेबलिंग के बाद थपका संकेत के साथ biocytin लेबल न्यूरॉन्स के दो उदाहरण दिखाते हैं. आसन्न स्पर्शरेखा वर्गों का पुनर्निर्माण पूरा neuronal आकारिकी 18,22,23,27,28 प्राप्त करने के लिए धारावाहिक पुनर्निर्माण की अनुमति देता है. उदाहरण के लिए संरचनात्मक संदर्भ फ्रेम के साथ ही, ऊतकीय धुंधला हो जाना (मेंप्राथमिक somatosensory प्रांतस्था) मानकीकृत संदर्भ फ्रेम 4,19 करने के लिए एकल न्यूरॉन्स दर्ज की अनुमति देता है. यहाँ प्रस्तुत दो उदाहरण वर्गीकृत करने और बाद में एक मैनुअल या स्वचालित प्रणाली के साथ रूपात्मक गुण (चित्रा 4) 15,20,29-31 के पुनर्निर्माण के लिए इष्टतम स्थितियों को दर्शाते हैं.
लेबलिंग biocytin juxtasomal के लिए चित्रा 1. इलेक्ट्रोड विशेषताओं. (ए) pial सतह के संबंध में 300-500 माइक्रोन गहराई में cortical न्यूरॉन्स की juxtasomal रिकॉर्डिंग के लिए इलेक्ट्रोड. (बी) 1,500-1,800 माइक्रोन रिकॉर्डिंग गहराई में cortical न्यूरॉन्स की juxtasomal रिकॉर्डिंग के लिए इलेक्ट्रोड. पैनल (ए) और (बी) के बीच घटना की लंबाई में अंतर नोट करें. (
चित्रा 2. Biocytin भरने के दौरान electrophysiological गुण. (ए, बी) स्वतःस्फूर्त कार्रवाई क्षमता biocytin साथ न्यूरॉन लोड करने के लिए सकारात्मक वर्तमान के साथ (/ बंद पर 200 मिसे,) वर्ग दालों के आवेदन के दौरान लेकिन अपर्याप्त आयाम के साथ मनाया जाता है. (सी) की अनुमति neuronal झिल्ली के उद्घाटन में वर्तमान आयाम परिणामों में वृद्धि biocytin लोड हो रहा है, पर चरण ओ दौरान चरण बंद फट spiking के रूप में पता लगाने में दिखाईच नाड़ी. (डी) भरने के दौरान कील तरंग एक वृद्धि की चौड़ाई से पता चलता है और hyperpolarization के बाद कम हो. स्पाइक आयाम तुलना के लिए बी में आयाम स्पाइक सामान्यीकृत है. एक सामान्य कील चौड़ाई और आवृत्ति मनाया जा सकता है भरने सत्र के लिए बाद में न्यूरॉन के सफल वसूली के बाद (ई, एफ). स्पाइक आयाम तुलना के लिए बी में आयाम स्पाइक सामान्यीकृत है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. Urethane anaesthetized चूहों के प्राथमिक somatosensory प्रांतस्था में juxtasomally भरा न्यूरॉन्स से Biocytin-थपका लेबलिंग. स्पर्शरेखा में (ए) पिरामिड न्यूरॉनदेखें. Dendrites और axons की व्यास आकार में प्रमुख अंतर नोट करें. स्पर्शरेखा दृश्य में (बी) के तेजी से spiking interneuron. Dendrites और axons की मनके संरचना पर ध्यान दें. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Juxtasomally लेबल न्यूरॉन की चित्रा 4. डिजिटल पुनर्निर्माण. (ए) न्यूरॉन प्रक्षेपण उच्च संकल्प पर छवि (लेकिन कम बढ़ाई) अर्द्ध स्वचालित इमेजिंग पाइप लाइन का उपयोग कर चूहे प्राथमिक somatosensory प्रांतस्था की परत 6 न्यूरॉन के 100 माइक्रोन स्पर्शरेखा टुकड़ा से प्राप्त की. (बी) स्वचालित डिजिटल पुनर्निर्माण के साथ (ए) के रूप में एक ही छवि नीले, dendr में (अक्षतंतु मढ़ा) क्रमश: लाल रंग में ite. (ख) से (ग) ब्रैकेट बॉक्स juxtasomal लेबलिंग का उपयोग axonal पुनर्निर्माण की विश्वसनीयता को वर्णन करने में तेजी से बढ़ी है. अक्षतंतु की लंबाई भर अक्षतंतु BOUTONS नोट, दो BOUTONS काला तीर द्वारा डाला जाता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| मिमी | ग्राम / लीटर | |
| 135 | NaCl | 7.8894 |
| 5.4 | KCl | 0.40257 |
| 1.8 | CaCl | 0.26464 | |
| 1 | 2 MgCl | 0.2033 |
| 5 | HEPES | 1.1915 |
| NaOH के साथ 7.2 पीएच को समायोजित करें | ||
| 20 mg/ml-1 biocytin जोड़ें |
तालिका 1. सामान्य चूहा घंटी Biocytin के साथ पूरक.
| 8 मिलीग्राम | घोड़े का दिल से साइटोक्रोम ग |
| 8 मिलीग्राम | Catalasगोजातीय जिगर से ई |
| 265 μl | 75 मिलीग्राम / एमएल थपका |
| 40 एमएल 0.05M पंजाब में भंग | |
| 37 डिग्री सेल्सियस तक और पहले से गरम समाधान | |
तालिका 2. साइटोक्रोम ग oxidase धुंधला के लिए समाधान.
| 1 बूंद | अभिकर्मक एक |
| 1 बूंद | अभिकर्मक बी |
| 0.5 मिलीलीटर | 10% ट्राइटन X100 |
| ight = "21" शैली = "ऊंचाई: 21px;"> 9.5 मिलीलीटर 0.05M पंजाब में भंग (अग्रिम में 45 मिनट) | |
| 410 μl समाधान जोड़ें / अच्छी तरह से | |
| एक 24 अच्छी तरह से थाली के लिए एबीसी समाधान के लिए प्रोटोकॉल. | |
तालिका 3. Vectastain मानक एबीसी किट के साथ समाधान.
| 265 μl | 75 मिलीग्राम / एमएल थपका |
| 13.4 μl | 30% एच 2 ओ 2 |
तालिका 4. थपका धुंधला के लिए समाधान.
| 6 ग्राम | विश्लेषणात्मक ग्रेड ग्लिसरॉल |
| 2.4 जी | Mowiol 4-88 |
| मैन्युअल ग्लिसरॉल के साथ कोट Mowiol को 10 मिनट के लिए हलचल | |
| 6 मिलीलीटर | आसुत एच 2 हे |
| 2 घंटे के लिए आरटी पर सेते | |
| 12 मिलीलीटर | 0.2 एम त्रिपीएच 8.5 |
| 1hr के लिए 50 डिग्री सेल्सियस waterbath में सेते हैं - हे / n, कभी कभी हलचल | |
| -20 डिग्री सेल्सियस पर 5,000 XG, विभाज्य और दुकान पर अपकेंद्रित्र 15 मिनट | |
सारणी 5. Mowiol समाधान.
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Discussion
juxtasomal विधि व्यवहार शर्तों भर में एकल इकाइयों से विवो कार्रवाई संभावित spiking में रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है (anesthetized, जाग सिर तय या स्वतंत्र रूप से चलती) biocytin लेबलिंग पद अस्थायी सेल प्रकार वर्गीकरण और / या 3 डी पुनर्निर्माण के लिए दर्ज न्यूरॉन के विकल्प के साथ. प्रमुख लाभ कोशिकी (इस प्रकार noninvasive) विन्यास में शारीरिक मापदंड प्राप्त करने के लिए है, अभी तक biocytin 16,17,32 साथ intracellularly न्यूरॉन लेबल करने के लिए सक्षम किया जा रहा. लेबलिंग biocytin के अलावा, इस तकनीक का डीएनए, आरएनए, प्रोटीन, या फ्लोरोसेंट रंगों 33,34 साथ न्यूरॉन्स इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण का सबसे स्पष्ट नुकसान लेबलिंग गुणवत्ता के दृश्य नियंत्रण का शायद कमी है, और प्रयोग के दौरान लेबलिंग गुणवत्ता की जाँच के इस प्रकार से कोई मतलब है. हालांकि, रिकॉर्डिंग की स्थिति और विशेष रूप से कार्रवाई संभावित आकार लेबलिंग प्रक्रिया की सफलता का आकलन किया जा सकता है. इंस्टा लिएवर्तमान दालों के दौरान स्पाइकिंग आवृत्ति नाटकीय रूप से बढ़ जाती है जब nce, घने biocytin-थपका लेबल के साथ एक न्यूरॉन उबरने की संभावना के बाद hyperpolarization कार्रवाई संभावित तरंग का और विस्तार (देखें चित्र 2) के लापता होने के साथ साथ, बढ़ जाती है. इसके अतिरिक्त, biocytin लेबलिंग की गुणवत्ता को सीधे कई लंबे भरने सत्र (> 60 सेकंड) एक व्यक्ति कम भरने सत्र (<30 सेकंड) की तुलना में बेहतर ऊतकीय गुणवत्ता में परिणाम होगा कि इस तरह के, अलग लेबलिंग सत्र की अभिव्यक्त लंबाई करने के लिए जोड़ा जाता है . अंत में, ट्रेसर प्रसार के लिए अस्तित्व के समय गंभीर रूप से बाहर का डिब्बों की लेबलिंग तीव्रता का निर्धारण करेगा. सामान्य में, उच्च गुणवत्ता वाले electroporation के बाद 1 घंटा के अस्तित्व के समय लंबी दूरी intracortical axonal अनुमानों के पर्याप्त लेबलिंग सुनिश्चित करता है. ऐसी लंबी दूरी अनुमानों का एक उदाहरण माध्यमिक somatosensory प्रांतस्था या dysgranular को पेश प्राथमिक somatosensory प्रांतस्था से न्यूरॉन्स हैंजोनों इस प्रकार कई मिलीमीटर दूर लेबलिंग साइट 4,20 से जो कर रहे हैं क्षेत्रों के लिए पेश. यहां तक कि बड़े आयाम की axonal अनुमानों (जैसे thalamocortical अनुमानों के रूप में) की जांच कर रहे हैं, अस्तित्व के समय 15 वृद्धि की जानी चाहिए. एहसास ज़रूरी न्यूरॉन की electroporation कारण इलेक्ट्रोड समाधान से अत्यधिक सोडियम बाढ़ के न्यूरॉन के शारीरिक हालत पर गहरा असर होगा. इस प्रकार, यह अत्यधिक संभावित कार्रवाई spiking की पूरी वसूली की अनुमति के लिए मौन एपिसोड के साथ एपिसोड भरने और biocytin वृक्ष के समान और axonal arborizations 12,31 साथ फैलाना करने की अनुमति दी है जब सत्र भरने के बाद रिकॉर्डिंग की स्थिति की निगरानी मिलाना की सिफारिश की है.
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Disclosures
authros खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम Profs धन्यवाद देना चाहूंगा. व्यापक समर्थन के लिए Huibert Mansvelder और बर्ट Sakmann, उपयोगी विचार विमर्श और तकनीकी सहायता के लिए neuronal ट्रेसिंग, और ब्रेंडन Lodder उपलब्ध कराने के लिए डा. मार्सेल Oberlaender. डाटा उदारता आर ब्रूनो (कोलंबिया यूनिवर्सिटी., न्यूयॉर्क, संयुक्त राज्य अमरीका) द्वारा प्रदान की Labview के लिए ntrode छठी, का उपयोग अधिग्रहण कर लिया था. इस शोध मैक्स प्लैंक सोसायटी और कम्प्यूटेशनल न्यूरोसाइंस, Tuebingen के लिए बर्नस्टीन केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था (शिक्षा और अनुसंधान के जर्मन संघीय मंत्रालय (BMBF द्वारा वित्त पोषित, FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Neurogenomics और संज्ञानात्मक अनुसंधान के लिए केंद्र (CNCR) , तंत्रिका विज्ञान कैम्पस एम्स्टर्डम (एनसीए), CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 और पूर्वी नौसेना कमान नेटवर्क # पी 3-C3) और नजरों से देख विश्वविद्यालय एम्स्टर्डम के लिए धन.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SM-6 control system | Luigs Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, Inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| LabView | National Instruments, Austin, TX, USA | LabView acquisition software | |
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY | ||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
References
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
- Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
- Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
- Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
- Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
- de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
- Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
- Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
- O'Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
- Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
- Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
- Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
- Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
- Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
- Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
- Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
