Langzeit-Intravitalimmunfluoreszenz-Imaging von Gewebematrix Bestandteile mit Epifluoreszenz und Zwei-Photonen-Mikroskopie

Zusammenfassung

Die extrazelluläre Matrix unterliegt erheblichen Umbau während der Wundheilung, Entzündung und Tumorgenese. Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz Intravital-Immunfluoreszenz-Mikroskopie, die Dynamik der Fibrillen sowie netzartige Matrix-Komponenten mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mit Epi-Fluoreszenz-oder Zwei-Photonen-Mikroskopie visualisieren.

Zusammenfassung

Abgesehen davon, dass eine physikalische Gerüst Gewebemorphologie beizubehalten, wird die extrazelluläre Matrix (ECM) aktiv bei der Regulierung der Zell-und Gewebefunktion während der Entwicklung und Homöostase beteiligt Organ. Es tut dies, indem über biochemische, biomechanische und biophysikalische Signalwege, wie zum Beispiel durch die Freisetzung von bioaktiven ECM-Protein-Fragmente handelt, die Regulierung Gewebespannung und die Bereitstellung Wege für die Zellmigration. Die extrazelluläre Matrix der Tumor-Mikroumgebung erfährt erhebliche Umgestaltung, gekennzeichnet durch den Abbau, Ablagerung und Organisation von fibrillärem und nicht-fibrillärem Matrixproteine. Stromal Versteifung der Tumor-Mikroumgebung kann das Tumorwachstum und Invasion zu fördern und dazu führen, Umbau des Blut-und Lymphgefäße. Live-Darstellung von Matrixproteine, zu diesem Punkt ist jedoch begrenzt auf fibrillären Kollagene, die mit Multi-Photonen-Mikroskopie durch Erzeugung der zweiten Harmonischen nachgewiesen werden können, so dass die Mehrheit der Matrixkomponenten largely unsichtbar. Hier beschreiben wir Verfahren zur Tumorimpfung in der dünnen Rückenohrhaut, Immunmarkierung von extrazellulären Matrixproteinen und intravitalen Bildgebung des exponierten Gewebes in lebenden Mäusen mit Epifluoreszenz und Zwei-Photonen-Mikroskopie. Unsere intravitalen Abbildungsverfahren ermöglicht die direkte Detektion von sowohl fibrillärem und nicht-fibrillärem Matrixproteinen im Zusammenhang mit einer zunehmenden Hauttumor. Wir zeigen Beispiele von Schiff Umbau von lokalen Matrix Kontraktion verursacht. Wir fanden auch, dass fibrilläre Matrix der mit der Erzeugung der zweiten Harmonischen detektiert Tumor ist räumlich getrennt von neu abgeschiedenen Matrixkomponenten wie Tenascin C Wir zeigten auch langfristig (12 Stunden) Abbildung von T-Zell-Interaktion mit Tumorzellen und Tumorzellen Migration entlang der Kollagen IV der Basalmembran. Zusammen genommen, erlaubt dieses Verfahren einzigartig für den gleichzeitigen Nachweis von Tumorzellen, deren physische Mikro und der endogenen Gewebeimmunantwort über die Zeit, die prov kannide wichtige Einblicke in die Mechanismen der Tumorprogression und möglichen Erfolg oder Therapieresistenz zugrunde liegen.

Einleitung

Intravital-Bildgebung von entzündlichen, metastatischen und Matrix-Umbauprozesse ist ein wichtiger Bereich der Forschung und hat die Schaffung von zahlreichen transgenen Mausmodellen Reporter, die fluoreszierende Proteine ​​exprimieren ^1,2 motiviert. Aufgrund out-of-focus Fluoreszenzsignale, die Bildqualität zu verringern und Grenzen Lichteinfall durch das Gewebe, ist Bild dicke Gewebe nur mit konfokaler oder Multi-Photonen-Scanning-Mikroskopie ³ möglich. Verwendung schneller, weniger kostspielig und komplex Epifluoreszenzmikroskopie nur mit nahezu zweidimensionalen Geweben wie Huhn Chorioallantoismembran ⁴ oder Mäuseohr Dermis ⁵ möglich. Die meisten Bildgebungssysteme nutzen transgenen Mäusen, die verschiedene fluoreszierende Proteine ​​in einer Zelltyp-spezifische Weise. Auch wenn diese Proteine ​​bieten schwachen Phototoxizität induzieren sie Immunantwort ^6. Ferner ist es schwierig, zwischen spezifischen Zelltypen zu wechseln oder zu markieren dieir basale oder aktivierten Zustände als solche Änderung erfordert die Herstellung einer neuen genetischen Modells. Zusätzlich, wie fluoreszierende Proteinexpression wird allgemein intrazellulären Kompartiment beschränkt, ist es meist nicht möglich, die Bildextrazelluläre Strukturen wie Basalmembran-Proteinen oder Gewebeeinlagen ⁷ Chemokin. Stattdessen indirekte Markierung mit Antikörpern gegen die extrazelluläre Antigene bietet Flexibilität für nahezu jeden Zelltyp-spezifische Komponente oder Matrix ^8,9. Jedoch ist der Hauptnachteil dieser Markierungsmethode mit Immun durch Antigen-Antikörper-Immunkomplexe, Komplement-System-abhängige Zelltoxizität und Phagozytose von Zellen und extrazellulären Strukturen ¹⁰ auslösen kann vermittelten verbunden.

Die extrazelluläre Matrix der Tumor-Mikroumgebung, sondern auch von normalem Gewebe während einer Entzündung oder Wundheilung, erfährt erhebliche Umgestaltung. Stromal Versteifung der Tumor-Mikroumgebung kann promote Tumorwachstum und Invasion durch Stress-induzierten Signalmechanismen und die Ursache Umbau des Blut-und Lymphgefäße ^11. Allerdings ist die Live-Darstellung von Matrixproteinen zu fibrillären Kollagene, die mit Multi-Photonen-Mikroskopie durch Erzeugung der zweiten Harmonischen detektiert werden kann begrenzt. Kürzlich wurde ein neues Intravitalbildgebendes Verfahren, das Risiko von Photo-und Immun-toxische Schädigung abzubildenden Zellen und Gewebestrukturen ⁵ minimiert veröffentlicht. Im Vergleich mit etablierten bildgebenden Verfahren, wo die einzige Runde der kontinuierlichen intravital Visualisierung in einem Bereich von 30 Minuten bis 2 Stunden ^12-17, unsere Intravital-Immunfluoreszenz (IF)-Technik erlaubt 12 Stunden ^{(Langzeit-8)-Bildgebung.} Es ist wichtig zu beachten, dass die Aufnahmezeit ist auf 12 Stunden wegen Grenzen in unserem Tier Protokoll definiert beschränkt, aber es gibt keine technischen Gegenanzeigen, dass es nicht verlängert werden kann, wenn kritische Gesundheitsparameter des Tieres, wie Blutdruck und HerzRate gesteuert ^8. Zusätzlich wird durch Verwendung eines automatisierten Fluoreszenz-Stereomikroskop konnten wir Bilder aus den verschiedenen Bereichen in einem einzigen Experiment sammeln und beobachtet seltene immunologische und Umbauprozesse, die im physiologischen Kontext der durch funktionelle Blut-und Lymphgefäße unterstützt Haut aufgetreten. Da die stereo Linse eine relativ große, 2 cm, Arbeitsabstand im Gegensatz zum Zwei-Photonen-mikroskopische Optik nicht verdampfenden Wasserlagerung erfordern, wurde langfristig Abbildungs ​​nur unter Fluoreszenz-Stereomikroskop durchgeführt. Intravital wenn erlaubt die Immun Markierung und zum Nachweis jeder Komponente der extrazellulären Matrix der normalen Haut. Das Design dieser Technik basiert auf dem innovativen Konzept der Verwendung von Immunfärbung für lebende Zellen und Gewebematrixelemente auf chirurgisch freigelegt Maus Dermis, ohne dass schädliche immunotoxizität ⁵ basiert. Das chirurgische Verfahren selbst ist sicher an der DermisGefäßsystem, wie es nur auf der Trennung von zwei Hautschichten im Ohr, die unabhängig voneinander innerviert werden, autonom durch Blut zugeführt und durch getrennte Kreisläufe abgeführt lymphatischen beruht. Unser Versuchsaufbau ermöglicht die Abbildung von einer Reihe von wichtigen pathophysiologischen Ereignisse über mindestens 12 Stunden, einschließlich Leukozyten Handel zwischen Blut-und Lymphgefäße und Wundheilungsprozesse. In der ursprünglichen Veröffentlichung, verglichen wir unsere Technik zu State-of-the-art-Standards in verschiedenen Bereichen der Intravital-Bildgebung. Folglich beobachten wir Blutgefäß Extravasation und lymphatischen Intravasation Ereignisse durch verschiedene Arten von Leukozyten, darunter die einzigartige Visualisierung von Immunzellen Eingabe Sammeln statt der erwarteten Anfangs Lymphgefäße ^15. Außerdem ergänzen die Beobachtungen von anderen Gruppen ^9,18 getan, fanden wir, dass in vivo CCL21 ist in der Lage, um starke, diskontinuierliche Einlagen auf das Sammeln aber nur selten auf initialen Lymphgefäße bilden.

Hier beschreiben wir eine modifizierte Intravital-IF-Technik, die mit Zwei-Photonen-Mikroskopie in Kombination mit dem Netzwerk der fibrillären Kollagene mit Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) zu erkennen. Wir zeigen, dass dieses Verfahren auch für die Bildgebung Invasion von Krebszellen im Rahmen der dynamischen Tumor-Mikroumgebung, die Matrixmoleküle wie Tenascin C, die von aktuellen Bildgebungstechniken ¹⁹ weitgehend unerforscht sind, umfasst werden. Wir fanden, dass die fibrillären Matrix des Tumors, wobei die zweite Harmonische detektiert, nimmt verschiedene Stellen der Tumormikroumgebung als die neu abgelagerte Matrix aus Tenascin C zusammen Ferner beschreiben wir Beispiele Gefäß Umbau von lokalen Matrixkontraktion verursacht, lang Ausdruck (12 Stunden) Abbildung von T-Zell-Interaktion mit Tumorzellen und Tumorzellmigration auf Kollagen IV der Basalmembran. Solche Ereignisse können abgebildet werden, während gleichzeitig die Aufnahme lokale physiologische Parameter wie Blutgefäß permeability und Lymphdrainage.

Protokoll

Alle Verfahren an Tieren durchgeführt wurden in strikter Übereinstimmung mit dem Schweizer Tierschutzgesetzes, der Verordnung über den Tierschutz und der Verordnung über die Tierversuche. Wir bestätigen, dass unsere Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC), genannt Commission de Surveillance de l'Etat de Vaud (Ausweis-Nummer: 2687), die speziell genehmigte diese Studie.

1. Tumor Beimpfung des Ohr

1. Kultur B16-F10-Melanom-Zellen GFP in einer 10 cm Petrischale mit DMEM + 10% FBS-Medien.
2. Wenn die Zellen 80-90% konfluent, waschen Sie sie mit PBS und trennen sie durch Trypsinierung. Spin down Zellen bei 1.500 xg für 5 min bei 4 ° C, das Pellet in 1 ml Ringer-Lösung und überträgt es in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Spin wieder und entfernen Sie alle Überstand außer einer dünnen Schicht des Mediums, die gerade über dem Pellet bleibt. Resuspendieren der Zellen mit einer dicken Zellaufschlämmung enden.
3. Betäuben die Maus mit einer Mischung aus MarktAmin / dorbene [Medetomidin] (75mg/kg-1mg/kg) und bestätigen, dass das Tier ausreichend durch Durchführen einer sanften Prise Zehe betäubt. Erhöhen Sie die Isofluran-Konzentration in Schritten von 0,1% bei Bewegungen beobachtet werden (zB Entzug der Pfote). Halten Sie die Maus auf einem rektalen Thermistor gesteuert Heizkissen (37 ° C) während des gesamten Verfahrens und seine Augen mit einer geeigneten Augensalbe zu schützen.
4. Bereiten Sie eine Hamilton-Spritze (33 G-Nadel, 10-ml-Spritze Volumen). Entfernen Sie die Kappe mit der Nadel und laden 20 ul Zellaufschlämmung oben auf der Spitze Kammer. Ziehen Sie den Kolben, bis 5 ml Schlamm wird in der Spritze geladen. Entfernen Sie den überschüssigen Schlamm aus dem Spitzenkammer und schließen Sie die Verschlusskappe.
5. Mit Klebeband fixieren den proximalen Rand des Ohres an der Spitze des Zeigefingers. In einem Winkel von 45 °, langsam legen Sie die Hamilton-Spritze Nadel zwischen Rücken Dermis und des Knorpels. Einmal drinnen, durchdringen das Ohr nahe für ca. 2-3 mm distal.
   Hinweis: Das Verfahren von Zellinjektion sollte von geschulten und zertifizierten Techniker durchgeführt werden. Darüber hinaus muss dieser Prozess langsam und der Reihe nach durchführen: Erstens sollte die Nadel horizontal zum Ohr Haut platziert und langsam in die Gehör Dermis eingelegt werden. Einmal und nur dann das Nadelende in die Haut, sollte der Kolben gedrückt wird. Durch Drücken des Kolbens wird Zellen Impfung in der Haut auslösen. In dem unwahrscheinlichen Fall der Nadel vorbei an den zwei Schichten der Dermis Ohr, der Schicht des Knorpels und tritt in die Haut der Person, die das Experiment sollte die Schmerzen für den Experimentator Finger zugefügt als alarmierendes Zeichen berücksichtigt und zur sofortigen Rückzug werden der Nadel vom Experimentator Haut. In diesem Fall Kolben sollte nicht gedrückt werden, und die Haut sollte mit Alkohol sterilisiert werden. Alternativ können unbelebten Objekt anstelle eines Fingers zur Stabilisierung der Ohr werden.
6. Inject 3 ul Zellaufschlämmung und die Nadel aus dem Ohr langsam zurückzuziehen.Lassen Tumorzellen bilden eine solide Tumor während 7-9 Tagen und folgen dem Tumorwachstum mit Hilfe eines Fluoreszenz-Stereomikroskop.
7. Alternativ, um die frühen Schritte der Tumorzelle Interaktion mit Gewebematrix zu folgen, gelten 50 ul von 100.000 Tumorzellen in Ringer-Lösung auf den exponierten und gefärbt Ohr Dermis (nach Schritt 3.3) suspendiert.

2. Ohrenkorrektur

1. Drei Tage vor dem Experiment, rasieren Sie die Maus Kopf, enthaaren die Haare um den Kopf und Ohr (15.10 sec) und mit Wasser abspülen.
2. Anesthetize die Maus mit einer Mischung aus Sauerstoff und befeuchtet Isofluran (3-4% Induktion, 1-2% Wartung) und bestätigen, dass das Tier ausreichend durch Durchführen einer sanften Prise Zehe betäubt. Erhöhen Sie die Isofluran-Konzentration in Schritten von 0,1% bei Bewegungen beobachtet werden (zB Entzug der Pfote). Halten Sie die Maus auf einem rektalen Thermistor gesteuert Heizkissen (37 ° C) während des gesamten Verfahrens und seine Augen mit einem Schutzgeeignete Augensalbe.
3. Erstellen Sie eine Plattform von 8 Glas geklebt Histologiepräparaten gemacht. Drehen Sie die Maus auf den Rücken und legen Sie die tumortragenden Ohr auf dem Stapel von Glasobjektträger sanft. Verwenden kleine Streifen von Klebeband, um die vorderen und hinteren Kanten des Ohres auf den Stapel zu fixieren.
4. Schneiden Sie die Bauchhaut des Ohres entlang der Anthelix der Maus Ohrmuschel mit einem Skalpell. Mit Hilfe der gekrümmten Pinzette vorsichtig abziehen der ventralen Dermis und den Knorpel von den dorsalen Dermis, wo der Tumor überimpft wurde. Ziehen Sie die Bauchhaut und Knorpel mit einer gebogenen Pinzette, Freilegung der dorsalen Dermis. HINWEIS: Wenn die Hauptgefäße des Ohres abgeschnitten oder die Blutzirkulation nicht zu normalen Fluss innerhalb von 15 Minuten zurückkehren, sind das Ohr nicht für die Bildgebung verwendet werden. Immer nass halten das Ohr geöffnet Haut mit Ringer-Puffer und schützen die Feuchtigkeit durch die Verwendung eines Deckglases.
5. In Fall gibt es anhaltende Blutungen Form Tumorgefäßen, die Blutung zu stoppen durch Zugabe von 100 ulThrombin (5 U / ml) in Ringer-Puffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl _2, 28 mM Natriumlactat) auf der Oberseite des Ohres für 5 min.
6. Zweimal waschen das Ohr mit etwa 5 ml Ringer-Puffer und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit sterilen Tüchern. Gleich mit dem nächsten Schritt fortfahren (nicht das offene Ohr trocknen lassen an einem beliebigen Punkt!).

3. Immunfluoreszenzfärbungen

Verwendung Ringer-Puffer mit menschlichem Serum (1:10), Maus-sekundären Antikörper zu polyklonalem menschlichen IgG (1:50) und 125 IU / ml (2,5 mg / ml), Aprotinin (Blockierungspuffer) für alle Färbeschritte ergänzt. Aprotinin hemmt Plasmin Förderung Koagulation ersten Blutung, die nach der Operation auftreten können, zu begrenzen.

1. Falten Sie den Teil des Ohres mit den offenen Lederhaut in die Eminentia Muscheln und trocknen die äußeren Ohr ungeöffnet Dermis mit sterilen Tüchern. Immobilisieren das Ohr auf dem Stapel der Glasträger durch Aufbringen von 0,5 ul chirurgischen Klebstoff auf den vorderen und hinteren Handrückenl Kanten. Dann sanft glätten die Rücken Ohr Dermis auf das Glas.
2. Gelten primären Antikörper gegen extrazelluläre Matrixmoleküle bei einer Konzentration von 10 ug / ml in einem Gesamtvolumen von 100 &mgr; l Blockierungspuffer zu der exponierten Ohres. Decken Sie das Ohr mit einem Deckglas, um die Farblösung zu verhindern, um auf den Ohrrändern trocknen. Inkubation: 15 min. Zweimal waschen das Ohr mit etwa 5 ml Ringer-Puffer.
3. Anwendung geeigneter sekundärer Antikörper oder Streptavidin-Konjugate (Fluorophore mit einem hohen Anregungswellenlänge wie 594 nm oder 647 nm günstig für intravitalen Imaging sind) in einer Konzentration von 10 ug / ml in einem Gesamtvolumen von 100 &mgr; l Blockierungspuffer zu der exponierten Ohres. Decken Sie das Ohr mit einem Deckglas und Inkubation für 15 min. Zweimal waschen das Ohr mit etwa 5 ml Ringer-Puffer.

4. Wechselwirkung von Blut übertragene Aktiv Splenozyten mit Tumorzellen in situ

1. 7 Tage nach inoculation von GFP-B16-F10 Melanom auf der Rückenhaut kongenen Maus, das Tier einschläfern zu sammeln und die Milz. Isolieren Splenozyten mit mechanischen Störung der Milz durch eine 70 um Zellsieb.
2. Etikett Splenozyten für 8 min bei 37 ° C mit roten CMTPX Zytoplasma-Färbung (1 &mgr; M in PBS), wasche 4 Mal in 15 ml bei 4 º C und sofort mit 200 &mgr; l serumfreiem Medium zu injizieren, in die Schwanzvene der Maus, deren Ohren B16-F10-GFP 7 daysearlier inokuliert.

5. Intravital Imaging mithilfe eines Stereomikroskop

1. Für kurzfristige Bildgebung (bis zu 2 Stunden), fügen frisch zubereitet sterile die Ascorbat-Ringer-Puffer mit 140 mM Natriumascorbat, 10 mM HEPES, 4 mM KCl und 5 mM CaCl _2, bei einem pH-Wert von 7,5 (des Ascorbat-Ringer-Puffer endgültige Osmolarität 320 mOsM) auf der Oberseite des immobilisierten Ohr. Decken Sie das Ohr mit einem Deckglas und starten Bildgebung mit Hilfe eines Fluoreszenz-Stereomikroskop mit 2X Objektiv.
2. Für die Langzeitabbildungs(Mehr als 2 Stunden), setzen Sie den Ausgang einer Nadel (bis zu einem Reservoir, das die Ascorbat-Ringer-Puffer angeschlossen) unter dem Deckglas, ca. 0,5 cm vom Ohr weg. Verwenden eine peristaltische Pumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 ml / min zu liefern, die ständig Ascorbat-Ringer-Puffer in die Kammer unter dem Deckglas.
3. Ändern Sie den 1X-Objektiv (Arbeitsabstand 6 cm) 2X Objektiv (Arbeitsabstand 2 cm). Öffnen Sie die Erfassungssoftware und konfigurieren Sie die Einstellungen des Fluoreszenzstereomikroskop. In der Kamera-Einstellungen wählen, wie 12-Bit-Farbtiefe des Bildes und stellen Sie die Kamera Palette von Grauwerte von 0% (Minimum) bis 5,1% (maximal) eingestellt und Gamma-Korrektur zu 2.
   1. Stellen Erwerb Verstärkung auf 1 (Minimum), Fluoreszenz-Intensität bis 1000 (maximal), Vergrößerung 280X-320X einstellen und die Belichtungszeit vermeidet Über-oder Unterbelichtung (Belichtungszeit sollte weniger als 1 Sekunde sein). Abhängig von der Anzahl der Abbildungsbereiche (üblicherweise 10 bis 20) das Zeitintervall für die Erfassungszyklus gesetzt werden kannschen 1 bis 2 min. Kürzen Zeiten können die Bleich-und Phototoxizität führen.
4. Wählen mehrere Felder, die Tumorzellen als auch gefärbten ECM Proteine ​​(wie in Fig. 3) enthalten. Mit dem Motortisch erwerben Bilder der geeigneten Fluoreszenzkanäle (wie GFP-Fluorophor und 647 in Abbildung 3) über die Zeit (zB alle 2 Minuten).
5. Nach dem Experiment mit der Maus einschläfern nach institutionellen Tier Richtlinien. In diesem Fall wird am Ende des Experiments euthanize anästhesierten Maus durch zervikale Dislokation gefolgt durch Ausbluten (intrakardiale Perfusion).

6. Intravital Imaging mithilfe eines Multiphotonen-Mikroskop

1. Verwendung von Silikonfett, bauen eine kreisförmige Wand von ca. 2 cm Durchmesser und 2-3 mm Höhe um das Ohr, beginnend an der Basis des Ohrs. Stellen Sie sicher, es gibt keine undichten Stellen. Füllen Sie den Kreis mit der Ascorbat-Ringer-Puffer.
2. Bewegen Sie die Mausauf der Bühne und schließen Sie das Heizkissen (37 ° C).
3. Offene Erfassungssoftware und konfigurieren Sie die Einstellungen der Multiphotonen-Mikroskop.
4. Wählen, bis zu vier verschiedene Bereiche, die Tumorzellen und Bunt ECM Proteine ​​(wie in Fig. 3) enthalten. In diesem Beispiel stimmen die Ti-Saphire Laser bis 850 nm für GFP-Signal ein nachfolgendes Einzelphotonen 647 für Fluorophor 647 und Färbung visualisiert fibrillären Kollagene mit SHG. Erwerben Sie Bilder der geeigneten Fluoreszenzkanäle (wie GFP-Fluorophor und 647 in Abbildung 3) und der zweiten Harmonischen mit der Zeit, z. B. alle 2 min, mit Wasser Eintauchen HCX APO 20X mit 1,00 NA Objektiv und 2 mm Arbeitsabstand.
5. Nach dem Experiment euthanize anästhesierten Maus mit zervikale Dislokation gefolgt durch Ausbluten (intrakardiale Perfusion).

Ergebnisse

Bisher Immunfärbung in lebendem Gewebe normalerweise nicht aufgrund der Bildung von Immunkomplexen, die zu hohen Hintergrundfärbung und Immun ²⁰ verwendet. Dies wurde durch Vorblockierstellung Fcy Rezeptoren auf Makrophagen Gewebe, also "blendend" diese Zellen, um nachfolgende starke indirekte Immunfärbung zu überwinden. Die Markierung wurde als extrazelluläre könnte Phototoxizität und Fluorophor Bleich durch Eintauchen des Gewebes in natürliches Antioxidans gepuffert isosmotische Ascorbinsäure (1A) gesteuert werden. Seit unserer ersten Beschreibung dieser Methode ^5, verbesserten wir unsere Anti-Bleich-und anti-Technik, so dass phototoxische Photobleaching können jetzt nicht nur gesperrt werden, sondern vollständig verhindert (Abb. 1B). Dies wird durch Einbetten des Ohres in einer großen Menge an Antioxidationsmittel (100 &mgr; l) in der Kammer, wo das Ohr immobilisiert geführt. Beachten Sie, dass 300 Sekunden konstanter Abbildungszeit entspricht zu 10 Stunden Bild wenn Bilderfür 500 ms jede Minute (die durchschnittliche Bildeinstellungen) gesammelt.

Abbildung 1. Photobleichen und Phototoxizität wurde durch Ersetzen Chlorid mit Ascorbat in Ringer-Puffer und die Einbettung der exponierten Ohr in 100 ul Volumen dieser Lösung gestoppt. (A) Das Gewebe wurde zunächst mit einem biotinylierten Antikörper gegen Collagen IV, der Bestandteil der Basalmembran gefärbt. Die Färbung wurde später mit Streptavidin-647 (rot) detektiert, und dann 300 Sekunden lang ständig entweder in normaler Ringer-Puffer (oben) oder Ascorbat-Ringer-(unteres Feld) abgebildet. Beachten Sie, dass 300 Sekunden konstanter Abbildungszeit entspricht 10 Stunden Bildgebung, wenn Bilder für 500 msec jeder Minute (die üblichen Bildeinstellungen) gesammelt. Der hellste 25% der pixel Intensitätswerte sind grün gefärbt. (B) Quantifizierung der Immunfluoreszenz-Zerfall (50% in Ringer-vs 0% im Ascorbat-Ringer). Die Werte wurden auf die Anfangsfluoreszenz normalisiert. Bilder mit Immunfluoreszenzstereomikroskop gesammelt. Maßstabsbalken in A, 100 um. Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Tumorzellen und Metastasen Tumorstromas ist entscheidend, um den Prozess der Tumorzellmigration und Tumorimmunität zu verstehen. Denn die Tumor-assoziierten Stroma bildet bis zu 90% der Tumormasse und regelt aktiv das Tumorwachstum und Metastasierung ^21. Allerdings mechanistischen Einblick in die Matrix Laufwerke Tumorzellmigration in Richtung entweder Lymph-oder Blutgefäße fehlen ^22. Dies ist teilweise auf die Tatsache zurückzuführen, dass im intravitalAlterung der Matrixproteinen an der Visualisierung gereift Fasern der fibrillären Kollagene mit Erzeugung der zweiten Harmonischen in der Zwei-Photonen-Mikroskopie ²³ begrenzt. Daher passen wir unsere Methode zur Visualisierung von Gewebe-Mikroumgebung, einschließlich Blut-und Lymphgefäße, Perizyten, Nerven-, Muskel-und Fettzellen, die direkte Visualisierung von extrazellulären Matrixkomponenten umfassen. Viele Strukturen können auf der Grundlage ihrer Morphologie nach Immunfärbung für Basalmembran-Komponenten wie Kollagen IV oder Perlecan (2A), aber direkte Färbung für spezifische Zelloberflächenmarker, wie zB LYVE1 (Fig. 2B und C) und podoplanin unterscheiden (Abb. . 2C), ermöglicht eine weitere Unterscheidung Anfangs, Kapillar Lymphgefäße (LYVE1 ⁺⁾ aus lymphatischen Kollektoren (LYVE1 ^-). Färbung auf Matrix-gebundenen CCL21 in der Haut zeigte Vorkommen dieses Chemokin auf der Basalmembran der lymphatischen Sammler idemit der Färbung für perlecan, der Heparansulfat-Proteoglykan (2D) ntified.

2. Beispiele für Lebendfärbung in einem normalen Mausohren. (A) Färbung für perlecan eine Basalmembran Komponente zeigt alle Blut-und Lymphgefäße, Nerven-, Muskel-und Fettzellen Fasern. (B) LYVE1 Färbung markiert den ersten Lymph-kapillaren Netzwerk. (C) Co-Färbung für LYVE1 und podoplanin, einem pan-lymphatische Marker, stellt Netzwerke der Aus-und Lymphgefäße sammeln. Die Rücken Ohr Dermis kann mit klassischen Epifluoreszenzmikroskopie (ohne optische Schnitte) als die Dermis Ohr abgebildet werden, hat eine geringe Anzahl von Fettzellen, die sonst das Bildfeld abdecken würde. (D) CCL21 stai ning (grün) auf lymphatischen Basalmembran für perlecan (rot) gefärbt. Bilder mit Immunfluoreszenzstereomikroskop gesammelt. Maßstabsbalken in A und B, 1 mm; in C, 100 um und 50 um in D. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Am wichtigsten ist, strukturelle Proteine, die normalerweise nicht von SHG, dem klassischen Nachweisverfahren Matrix ²³ festgestellt werden kann, kann sichtbar gemacht werden. Beispielsweise fanden wir, dass Tenascin C (Fig. 3A), die eine Matrix-Protein, das während der Tumorgenese exprimiert wird, wird die Wundheilung und Entzündungs ^​​19 an verschiedenen Stellen des Tumorstroma als fibrilläre Kollagene (3B) abgeschieden. Diese Matrix kann Heterogenität von Tumorzellen und Metastasen Verteilung (Fig. 3C) zu beeinflussen.

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Abbildung 3. Die Rücken Ohr Dermis kann live mit Multi-Photonen-Mikroskopie abgebildet werden. Ein einzelnes Gebiet der Tumor B16-F10. Tumor-Stroma wurde mit Tenascin-C-Antikörper markiert und die Färbung wurde mit Anti-Ziege-594 Esel Antikörper nachgewiesen. Immunfluoreszenz von Tenascin C (rot) Netzwerk ist in A gezeigt und fibrillären Kollagene mit der zweiten Harmonischen (SGH) in B festgestellt. Diese zwei Netzwerke mit Tumorzellen (Cyan) in C (fusionierten) überlagert. Neue Tumor-Matrix durch Tenascin C markiert ist nicht mit fibrillären Kollagene mit SHG (grün) erkannt lappen. Das Bild mit 44, vier Mal gemittelt z-Schnitte mit z-Schritt 1,0 um wurde in 16 Bit Farbtiefe-Modus erworben. Bilder mit Zwei-Photonen-Mikroskop gesammelt. Maßstabsbalken, 100 um.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" target = "_blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Nach der Immunmarkierung verschiedener Tumormatrixkomponenten (z. B. Tenascin C und Kollagen IV) der Tumormatrix wir konnten identifiziert beschränkt und plötzliche Ereignisse der Tumormatrix Richtungs Umbau (Video 1). Kräfte, die in Tumor-Mikroumgebung zu entwickeln kann die Expansion oder Kontraktion des Tumors Matrix und in Folge Umbau und die Dehnung des Tumorgefäßsystems in einem ähnlichen Ausmaß zu führen, wie wir zuvor im Falle der Wundheilung ^11,24 gezeigt.

Video 1. Erweiterung der Tumor-Matrix mit Kollagen IV (rot) und Tenascin C (Cyan) länglich Blutgefäße (Pfeil) und passiv translozieren drei Tumorzellen (grün) markiert. Lokalisierte Kontraktion teascin C-reiche Matrix translozieren Tumorblutgefäße (rot horizontal ausgerichtete Strukturierunge) während 12 Stunden Abbildungs ​​etwa 100 &mgr; m. Bilder mit Immunfluoreszenzstereomikroskop gesammelt. Klicken Sie hier, um Video anzusehen.

Verwendung von Multi-Photonen-Mikroskopie mit Fluorophor Kennzeichnung ist problematisch, da Photonenfluss in diesen Experimenten verwendet werden schnell zu bleichen Fluoreszenzfarbstoffen, die nicht vom Oxidations ²⁵ geschützt sind. Hier zeigen wir, dass wir Zwei-Photonen-Zeitraffer-Mikroskopie durchführen können, während gleichzeitig die Abbildung immun Tenascin C-Matrix mit minimalem Photobleaching der Fluorophore auch in Zwei-Photonen-Mikroskopie hohe Photonendichte (Video 2).

Video 2. Low-Level-Photobleaching von Tenascin C Immunfluoreszenz (rot) während der Zwei-Photonen-Mikroskopie. B16-F10-GFP Tumorzellen (cyan) wurden in der offenen Rücken Ohr 9 Tage nach der Impfung abgebildet. Das Fluoreszenzsignal wurde durch Anwendung der Ascorbat-geschütztRinger-Puffer auf dem abgebildeten Gewebe. Erzeugung der zweiten Harmonischen (grün) nicht mit neuen Matrix von Tenascin C 16-Bit-Farbtiefe mit 11 viermal gemittelten Z-Profilen mit Z-Stufe 1,9 um wurde für 15 min entsprach dem lappen. Die Bilder wurden alle 1 Minute 5 Sekunden 6 z-Ebenen gesammelt gesammelt. Klicken Sie hier, um Video anzusehen.

Zudem abgebildet Immunzellinteraktionen mit metastatischen Tumorzellen. CMTPX-markierte Splenozyten aus einer tumortragenden Maus 8 Stunden nach der Transfusion von iv Tumor-assoziierten Blutgefäße Extravasaten Invasion der Tumormatrix und mit Tumorzellen aktiv durch Bildung dauerhafte Zellkontakte (Video 2) interagiert. Fluorophor-647-markierten Kollagen IV-Strukturen waren resistent gegen Ausbleichen während der 12-Stunden-Bildgebung.

Video 3. Interaktion von CMTPX-markierte Splenozyten von Tumor (B16-F10)-bZipfel Maus mit einzelnen Tumorzellen (GFP-B16-F10). Splenozyten wurden nach iv Gewebe Färbung für Kollagen IV transfundiert. Collagen IV-grün (647), Splenozyten-rot (CMTPX), B16-F10 Cyan (GFP). Bilder mit Immunfluoreszenzstereomikroskop gesammelt. Videodauer 12 Stunden. Klicken Sie hier, um Video anzusehen.

Frisch isolierte Tumorzellen wurden auf den freiliegenden Dermis Ohr für Kollagen IV vorgelagert gefärbt. Wir konnten beobachten, dass nach dem zu dem Gewebe haften einige Gruppen von Zellen gestartet kollektive Migration entlang Basalmembran von Blutgefäßen und Adipozyten.

Video 4. Tumorzellen wandern entlang Basalmembran. Normale Haut Ohren für Kollagen IV (647, rot) gefärbt wurde mit frisch agiert B16 F10-GFP-Zellen überschichtet und für 5 Stunden abgebildet. Einige Tumorzellen, die Gewebe eingehalten gestartet kollektive Migration entlangBasalmembran der Blutgefäße und Fettzellen. Bilder mit Immunfluoreszenzstereomikroskop gesammelt. Videodauer:. 5 Stunden Klicken Sie hier, um Video anzusehen.

Auch, weil die Ohr Dermis praktisch zweidimensionalen, wir leicht sammeln könnten große Datenmengen unter Verwendung der schnellen Fluoreszenz-Stereomikroskopie, statt langsamer und teurer oder konfokale Multiphotonenmikroskopie. Es ist jedoch auch möglich, eines der genannten Scanning-Mikroskopie-Methoden mit unserer Intravital verwenden IF Zubereitungen (Abb. 3, Video 1).

Diskussion

Bedeutung

Hier präsentieren wir eine neue Intravitalmikroskopie Ansatz, der hohen Auflösung und dynamische Visualisierung von verschiedenen Gewebemikrokomponenten, einschließlich fibrillären sowie netzartige Matrixproteinen ermöglicht. Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber aktuellen Intravitalbildgebenden Verfahren: (i) Intravital-Fluoreszenz-Bildgebung hat in der Mikrozirkulation Studien verwendet wurde, um beispielsweise gelösten Austritt aus Blut-oder Lymphgefäße in die Spur, hat aber nicht mit Immunfärbung kombiniert. (Ii) Die Verwendung von gentechnisch veränderten Reporter Mäusen ermöglicht spezifische Zelltypen abgebildet werden soll, erfordert aber ihre Verfügbarkeit (oder erhebliche Anstrengungen, um neue zu schaffen) und begrenzt die Anzahl von interagierenden Zelltypen, die untersucht werden können. (Iii) Die extrazelluläre Matrix kann in vivo unter Verwendung von zweiten Harmonischen dargestellt werden, aber diese Technik kann nur faserige Kollagen zu erfassen, wobei eine große Anzahl von wichtigen extrazellulären Komponentenwie Basalmembranen, Fibronektinen, Tenascine, Wachstumsfaktoren, Chemokine und Gewebe Glykosaminoglykane außerhalb der Reichweite für die aktuelle Forschung. Unser Verfahren überwindet diese Einschränkungen und können Standard-Bildgebungstechniken eingearbeitet und weiter kombiniert mit Immunfärbungen für andere Zelltypen, Gewebestrukturen, Ablagerungen von Heparinsulfat-bindenden Wachstumsfaktoren (z. B. VEGF ²⁶⁾ und Chemokinen (CCL21 und ^5,18 zeigt. 2D ) oder extrazellulären Matrixproteinen und gleichzeitig Tracking Blut und / oder lymphatischen fließt.

Begrenztheit

Die Epi-Fluoreszenz-Bildgebung von Intravital IF ist auf die dünnen Hautlappen, der dicke Unterhaut (Fettgewebe) beraubt begrenzt. Während wir festgestellt, dass die dorsalen Ohr Dermis ist optimal für die relativ harmlosen chirurgischen Darstellung der Ohrhaut, Epi-Fluoreszenz mit Intravital IF-Technik ist nicht auf Ohr Dermis beschränkt und könnte möglicherweise zu z. B. angewendet werdendie freigelegte Haut der Zehen oder der Rückenhaut des neugeborenen Maus. Rapid-Antikörper-Färbung (15 Minuten) in der Immunfluoreszenz IF hängt nicht passive Diffusion, sondern erfordert funktionelle Lymphdrainage und interstitielle Strömung, damit keine Färbung beobachtet, wenn Lymphgefäße ²⁷ verschlossen werden. Im Einklang mit dem, Lymphgefäße Fleck stärker als undichte Blutgefäßsystem (verletzt Gefäße, Arteriolen) ^5. Die Trennung des dorsalen und ventralen Hautlappen Ohr ist ein mildes chirurgische Verfahren aber eine Schädigung einigen Kapillaren und Zelltod zu verschiedenen Gewebezellen. Dies könnte ein Problem sein, wenn man völlig intaktem Gewebe zu untersuchen, z. B. Blick auf die milde Wirkung von Drogen auf das Überleben der Zellen benötigt. Auch der Einsatz von Antioxidantien, die die Haut vor Phototoxizität und Photobleaching Schutz dient schließt die Verwendung von Intravital-Immunfluoreszenz-Technik, um z. B. das Gewebe oxidativen Stress oder Stickstoffmonoxid-biologisch studiereny.

Schließlich Verblindung der Gewebe Makrophagen mit Immunkomplexe können diese Zellen und Einfluss z. B. die Untersuchung von Gewebeimmunantwort und Aktivierung dendritischer Zellen zu aktivieren.

Änderungen und Fehlersuche

Um Gewebe oxidativen Stress oder Stickstoffmonoxid Biologie Studie hat Ascorbat mit anderen gewebeverträglichen Medien, die nicht mit dem experimentellen Ausgangs stört ersetzt werden. Ebenso sollten Blockierungs Fc-Rezeptoren auf dermalen Immunzellen vermieden werden, wenn das Ziel der Untersuchung ist die Funktion und Aktivierung des Gewebeimmunantwort und dendritischen Zellen-Aktivierung und Migration. Dies kann mit der Verwendung sekundärer Antikörper mit Fc-Fragment gespalten (F (ab) 2-Antikörperfragmente) oder die Verwendung von biotinylierten Antikörpern und Streptavidin als Fluoreszenznachweisreagenzien durchgeführt werden.

Zukünftige Anwendungen

Wir präsentieren eine neue und einzigartige innerVital IF-Technik für Bild in nicht-fibrillären Komponenten der extrazellulären Matrix in transplantierbaren Hauttumoren in Kombination mit SHG-erkannt fibrillären Kollagene und gereift mit Zwei-Photonen-Mikroskopie. Einer der Vorteile der Verwendung von Multi-Photonen-(oder konfokale) Mikroskopie über Epi-Fluoreszenz-Bildgebung ist z-Stapeln Möglichkeit und in der Folge räumliche Co-Lokalisation von Ereignissen innerhalb der extrazellulären Matrix auftreten, z. B. Tumor Intravasation in Lymph-oder Blutgefäße, die im Falle von Standard Epifluoreszenzmikroskopie kann nur von morphologischen Veränderungen der Zelle eindringenden abgeleitet werden. Diese Technik besitzt viel breiteres Potential. Zum Beispiel haben wir die intravital verwendet werden, wenn der Mechanismus der Okklusion von lymphatischen lymphatischen spezifische photodynamischen Therapie ²⁷ zu untersuchen. Weitere mögliche Anwendungen dieser Verfahren beinhalten, sind aber während der Entzündung, Mechanismus der Transplantatabstoßung oder Methoden von Blut und Lymphe nicht auf die Untersuchung von Haut Immunität beschränkt tischen Gefäßwachstum während der Tumorgenese.

Kritische Schritte in dem Verfahren

Der wichtigste Schritt, die kritische Auswirkungen für die Aufrechterhaltung eines physiologischen Gewebeumgebung weist eine chirurgische Trennung der Bauchhaut und Knorpel von dorsal Dermis. Schneiden oder Verschließen der großen Arterie oder Vene wird auf übermäßige Blutungen und lokale Gewebehypoxie führen, die zelluläre Reaktion auf Behandlungen und Zellbewegung ⁸ beeinflussen. Immobilisierung das Ohr mit chirurgischen Klebstoff sollte mit Vorsicht, da verschüttet den Kleber auf aussetzen Gewebe durchgeführt werden wird eine dauerhafte Schädigung des Gewebes führen durch Verschluss von Blutgefäßen. Die Temperatur der Maus muss kontrolliert und bei 37 ° C gehalten werden, Zusätzlich muss befeuchteten Sauerstoff zu der Isofluran-Narkose verwendet werden, so dass die Augen und Lungen bleiben richtig während des Experiments befeuchtet. Außerdem muss Natriumascorbat frisch hergestellt werden und ihr pH vor der Verwendung überprüft.

ntent "> Zusammenfassend überbrückt diese Immunfluoreszenz-Intravitalechtzeit, lokale Messungen der physiologischen Funktion mit der molekularen Bildgebung komplexer zellulärer Ereignisse in der Mäusehaut. Außerdem hat diese Methode ein großes Potential, da es leicht zu zB post-Entwicklungsstudie angewendet werden Mechanismen der Blut-und Lymph-Angiogenese-oder die frühen Phasen der Infektion der Haut durch verschiedene Krankheitserreger Mit seiner Flexibilität und Hochdurchsatz-Potenzial visualisieren., kann diese Technik Intravital deutlich um mehrere Felder der Biologie beitragen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Mäusestamm
BALB/C Mäuse (8-12 Wochen)	Charles River		Orleans, Frankreich
C57/Bl6 Mäuse (8-12 Wochen)	Harlan		Carshalton UK
Zelllinie
B16 F10 Melanom, das OVA-GFP exprimiert
Wartung der Anästhesie
Isofluoran	Minrad Inc.	2222	Minrad Inc., Buffalo, NY
Befeuchtetes Verabreichungssystem	Rothhacher GmBH		Bern, Schweiz
DC-Temperaturregelungssystem	FHC Inc		Bowdoin, MA
Stereomikroskop
Fluoreszenz-Stereomikroskop mit motorisiertem Tisch .	M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Deutschland
1X Objektiv (lineare Systemvergrößerung von 7,5x bis 160x)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Deutschland
2X Objektiv (lineare Systemvergrößerung von 15,6x bis 320x)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Deutschland
DFC 350 FX Kamera gesteuert von LAS AF Software	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Deutschland
Multiphotonenmikroskopie
LEICA SP5, Zwei-Photonen-Multiplikator, motorisierter Tisch	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Deutschland
HCX APO 20X/1.2 Ölimmersion
Chamäleon Ultra Laser
Ringer-Puffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM Natriumlactat)	B. Braun Medical AG	445968	Sempach, Deutschland
Aprotinin	Elastin	AP92	Owensville, Vereinigte Staaten Von
Amerika	Sigma-Aldrich	T7326-1KU	Taufkirchen, Deutschland
Natriumascorbat	Sigma-Aldrich	11140-50G	Taufkirchen, Deutschland
Mausserum gegen humanes IgG	Abcam	ab34834	Cambridge, Vereinigtes Königreich
Kollagen IV	Abcam	AB6581	Cambridge, Vereinigtes Königreich
Perlacan	RnD	ab79465	Minneapolis, MN
Tenascin C	RnD	AF3358	Minneapolis, MN
Podoplanin	RnD	AF3244	Minneapolis, MN
LYVE-1	Reliatech	103-PA50	Wolfenbü ttel, Deutschland
CCL21	RnD	AF457	Minneapolis, MN
Streptavidin Pacific Blue	Invitrogen	S11222	Grand Island, NY
Streptavidin Alexa 647	Invitrogen	S21374	Grand Island, NY
Streptavidin Alexa 488	Invitrogen	S11223	Grand Island, NY
Esel Anti Ziege 594	Invitrogen	A21113	Grand Island, NY
Esel Anti Kaninchen 594	Invitrogen	A21207	Grand Island, NY
CMTPX CellTracker	Lifetechnologies	C34552	Carlsbad, Kalifornien
Histocryl (chirurgischer Kleber)	Braun Aesculap	1050060	Tuttlingen, Deutschland
Reagenzien für Zellkulturen
Dulbecco' s modifizierter Eagle" (DMEM	Gibco Invitrogen	E15-843	Grand Island, NY
Fötales Rinderserum (FBS	Gibco Invitrogen		Grand Island, NY
Trypsin	Gibco Invitrogen	25300062	Grand Island, NY
PBS	Gibco Invitrogen		Grand Island, Vereinigte Staaten von Amerika