BEST: Barcode Aktiviert Sequenzierung Tetrads

Zusammenfassung

Barcode Aktiviert Sequenzierung Tetrads (BEST) ersetzt die manuellen Prozesse zu isolieren, zu stören und Abstand Tetraden. BESTE isoliert Tetraden durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung auf Agarplatten, trennt die Sporen durch Schütteln mit Glasperlen, und bestimmt, welche zufällig angeordnet Kolonien wurden aus der gleichen ursprünglichen Tetrade mit Molekular Barcodes abgeleitet.

Zusammenfassung

Tetrad Analyse ist ein wertvolles Werkzeug für Hefe-Genetik, aber die aufwändige manuelle Art des Verfahrens hat seine Anwendung auf großen Skalen behindert. Barcode Aktiviert Sequenzierung Tetrads (BEST) ¹ ersetzt die manuellen Prozesse zu isolieren, zu stören und Abstand Tetraden. BESTE isoliert Tetraden aufgrund einer Sporenspezifische GFP-Fusionsprotein, das Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung Tetraden ermöglicht direkt auf Agar-Platten, wo der Ascus enzymatisch verdaut, und die Sporen zerstört werden und zufällig durch Glasperlenbeschichtung angeordnet. Die haploiden Kolonien werden dann Schwester Sporen Beziehungen zugeordnet, also Informationen darüber, welche Sporen stammten aus der gleichen tetrad, mit molekular Barcodes während Genotypisierung lesen. Durch das Entfernen der Flaschenhals der manuellen Zerlegung, können Hunderte oder sogar Tausende von Tetraden in Minuten isoliert werden. Hier präsentieren wir eine detaillierte Beschreibung der erforderlich ist, um BEST in der Hefe durchzuführen experimentellen VerfahrenSaccharomyces cerevisiae, die mit einem heterozygoten diploiden Stamm durch die Isolierung von Kolonien aus der haploiden Nachkommen meiotischen abgeleitet.

Einleitung

Meiotische Gen-Kartierung, die gemeinhin als Tetradenanalyse bekannt, ist von zentraler Bedeutung für Hefe-Genetik. Kurz gesagt, werden zwei haploiden Stämme, die jeweils eine einzelne Kopie jedes Chromosoms enthalten, zusammengefügt, um einen heterozygot diploide Stamm mit zwei Kopien von jedem Chromosom, eine von jedem Elternteil zu bilden. Hungernde diploiden Zellen für Stickstoff induziert Meiose (Sporenbildung), in dem Chromosomen duplizieren, Umlagerung, und teilen sich in vier haploide Zellen (Sporen oder Abkömmlinge) mit neuen Kombinationen von Allelen von jedem Elternteil. Die vier Sporen aus einer Meiose ergeben, können durch einen manuellen Prozess namens tetrad Dissektion isoliert werden.

Konventionelle tetrad Dissektion ^2,3, die relativ wenig seit der ursprünglichen Veröffentlichung im Jahr 1937 ⁴ geändert hat, hat drei Ziele. Zunächst müssen Zellen, die Meiose (Tetraden) unterzogen wurden, von einem Hintergrund von vegetativen Zellen isoliert werden. Bei herkömmlichen Analyse, wird dies durch einen Forscher, der erreicht, mitein Mikroskop visuell identifiziert Tetraden auf einer Agar-Platte und beschäftigt ein Mikromanipulator Gerät visuell identifizieren Tetraden auf einer Agar-Platte und mit einem Mikromanipulator, um die Tetrade auf einem zellfreien Bereich der Platte zu bewegen. Weiter müssen die vier Sporen in der Tetrade physikalisch getrennt werden, um interspore Stecken. Sporen innerhalb einer Tetrade werden sowohl von einem Ascus, der Rest der Zellwand des ursprünglichen diploiden Zelle, und eine Reihe von Brücken interspore ⁵ zusammengehalten werden. Bei herkömmlichen Tetradenanalyse die Ascus durch enzymatische Verdauung entfernt und ein Forscher nutzt die Mikromanipulator, um die interspore Brücken brechen auseinander und necken die Sporen. Schließlich werden die einzelnen Sporen in einem Gittermuster, das die Beziehung zwischen der Sporen unterhält angeordnet sind, dh alle Nachkommen in einer Reihe von vier Schwester Sporen des gleichen ursprünglichen Tetrade. Ein erfahrener Hefe-Forscher können den Prozess der Zerlegung 10 Tetraden (eine allgemein akzeptierte Mindestzahl vervollständigenpro Quer) in ca. 15 min.

Wir haben einen neuen Hochdurchsatz-Genotypisierung tetrad Methode, die wir als B arcode E Enabled S equencing von T etrads (BEST) ¹ entwickelt. BEST baut auf aktuellen Methoden in der Hochdurchsatz-Genetik, indem du die Generierung und Genotypisierung einer großen Zahl von Nachkommen, die isoliert sind, Genotyp, und als Individuen in einer Weise, die Schwester Sporen Beziehungen aller vier meiotischen Produkte gewonnen werden können gehalten werden. Dies wird unter Verwendung von drei Hauptstrategien (Fig. 1) erreicht. Zuerst ist die Einführung eines Reporterkonstrukt, das Zellen, die mit GFP Meiose durchlaufen haben Etiketten und ermöglicht es ihnen, durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) isoliert werden. Zweitens ist der Einbau eines hochkomplexen DNA Barcode (eine Kette von 15 zufälligen Nukleotiden) in einer Form, die an allen vier Sporen einer Tetrade übertragen wird und durch DNA-Sequenzierung des rekombinanten PROGEN leseny und damit identifiziert Schwester Sporen aus der gleichen Tetrade. Drittens ist die Genotypisierung Schritt, und am besten mit zahlreichen Plattformen, die Genotypisierung Capture sowohl eine Reihe von genomischer Marker sowie die Tetrade spezifische Barcode-kompatibel ist. Wir beschäftigen eine Restriktions-assoziierten DNA-Tag-Sequenzierung (RAD-Seq) ⁶ Methode, die Genom-Sequenzierung, um spezifische Restriktionsstellen ¹ leitet, wodurch eine konsistente 2-3% des Genoms von Nachkommen der Stämme sowie die Erfassung der plasmidgetragenen Barcode . Die Erholung der Tetrade Beziehungen zusammen mit der empirisch abgeleiteten Genotypisierung Daten aus der Quer ermöglicht die genaue Rückschlüsse auf fehlende Informationen, einschließlich des Status von Markern mit geringer Sequenzabdeckung und das komplette Erbgut von nicht lebensfähig (und damit nicht behebbarer) Individuen. Hier beschreiben wir die Anwendung des Verfahrens in dem am häufigsten verwendeten Mikroorganismus für meiotischen Zuordnung der Hefe S. cerevisiae. jedoch mit geringfügigen Substitutionen von Organismus-spezifischen GrundHerren, z. B. verschiedene Sporulation-spezifische Proteine ​​mit GFP fusioniert ist, sollte das Verfahren ohne weiteres übertragbar auf andere Mikroorganismen, einschließlich Organismen, in denen meiotischen Zuordnung ist wesentlich arbeitsintensiv oder momentan unlösbar sein.

Abbildung 1. BEST-Methode. (A) Die pCL2_BC Plasmid ist ein 2-Mikron-Plasmid mit einer Sporenbildung spezifische GFP-Fusions, Resistenz gegen G418, und ein 15-mer Zufalls Barcode. Der Bau der Plasmid-Bibliothek wird in Ludlow et al ¹ beschrieben. (B) Ein Pool von Barcode-Plasmide in die diploide Stamm aus einer Kreuzung umgewandelt. (C) Die Transformanten werden dann zur Auswahl gezüchtet und ~ 10.000 transformierten Kolonien werden vereinigt und mit Sporen. Während der Meiose jeweils Sporen einer Tetrade erbt eine Zusammenarbeitpy der Barcode-Plasmid. (D) Tetrads aus unsporulated Zellen durch FACS getrennt und auf Agar-Platten, wo sie verdaut werden und gestört, dass die einzelnen Sporen, um eine Kolonie zu bilden gesammelt. (E) Die Kolonien werden dann nahm in 96-Well-Platten, phänotypisiert und genotypisiert. Während Genotypisierung das Plasmid Barcode gelesen und verwendet werden, um die vier Mitglieder jeder Tetrade identifizieren. Diese Zahl hat sich von Ludlow et al ¹ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protokoll

1. Dehnungs Konstruktion und Charakterisierung

1. Konstruieren die heterozygoten diploiden Stamm in die Quer durch Paarung haploiden Stämmen und Auswählen Diploide ² oder unter Verwendung eines natürlich vorkommenden heterozygoten Stamm verwendet werden. Die Stämme sollten nicht bergen GFP.
2. Zu bestätigen, dass der Stamm nicht auf YPD ² + 200 &mgr; g / ml G418 wachsen.
3. Bestätigen Sie, dass der Stamm ist in der Lage, Sporen zu bilden. BEST ist mit Effizienz Kreuze niedrigen Sporenbildung kompatibel, aber niedrige Sporenbildung Frequenz erhöht FACS-Sortierzeit erforderlich.
   1. Richten Sie eine O / N-Kultur des Stammes in 5 ml YPD und wachsen unter Rühren bei 30 ° C
   2. Mit PBS (pH 7,4) waschen 0,5 ml des O / N-Kultur dreimal.
   3. Pellet die Zellen gewaschen, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren in 2 ml Sporulationsmedium ^7.
   4. Man schüttelt Zellen bei RT und prüfen täglich für tetrad Bildung unter Verwendung eines Phasenkontrast-Lichtmikroskop mit einer 40X-Objektiv.
   5. Schätzen Sie die Lebensfähigkeit der Sporen des Kreuzes durch konventionelle Dissektion ^2,3 von einer geringen Anzahl (~ 20) Tetraden. Die Lebensfähigkeit der Sporen in Kreuzungen zwischen verschiedenen Hintergründen Belastung sehr unterschiedlich und unvorhersehbar. Jedoch a priori Erwartungen Lebensfähigkeit der Sporen verwendet werden, um die Effizienz eines beste Experiment vor der arbeits-und kostenintensiven Schritte des Speicherns und Genotypisierung der Stämme zu bewerten. Daher wird dieser Schritt sehr empfehlenswert.

   2. Transformation von Diploiden mit Bibliothek Barcode Plasmide

   1. Legen Sie die pCL2_BC Barcode-Plasmid in die heterozygot diploide Stamm mit der in Gietz und Woods ⁸ beschrieben Transformationsprotokoll mit folgenden Änderungen.
      1. Nachdem die Zellen wurden mit dem Transformationsgemisch bei 30 ° C für 20 min inkubiert wurden, fügen DMSO bis 8% des Volumens der Transformationsmischung. Zugabe von DMSO wurde gefunden, daß die Transformationseffizienz zu verbessern in einige Dehnungshinter ^9.
      2. Nach dem Hitzeschock-Schritt, die Zellen zu pelletieren, mit einer kurzen Zentrifugation dekantiert die Transformationsansatz, und waschen Sie die Zellen vorsichtig in YPD. Dann Resuspendieren der Zellen in 1 ml YPD und es ihnen ermöglichen, bei RT für 3 h ohne Rühren erholen.
   2. Wählen Transformanten durch Ausplattieren auf YPD + G418 (200 ug / ml)-Agarplatten. Um eine komplexe Pool von Plasmid-Barcodes zu gewährleisten, ernten, eine große Anzahl von Kolonien, z. B. 5-Platten mit ~ 2500 Kolonien pro Platte.
   3. Sobald Kolonien sichtbar sind (2-3 Tagen Wachstum bei 30 ° C), bündeln die Transformanten durch vorsichtiges Schaben sie von der Platte in flüssiges YPD + G418 (200 ug / ml) + 15% Glycerin. Vortex diese Zellsuspension, Transfer in ein Kryokonservierungsfläschchen, und frieren bei -80 ° C eingefroren Einen separaten Lager für jede Platte. Diese froren Bestände dienen als Ausgangsstämme für Schritt 3.1 und kann auch verwendet werden, um mehr Tetraden zu einem späteren Zeitpunkt zu erzeugen, wenn gewünscht.

   3. Sporulierenden die Bibliothek von transformierten Zellen zu erhalten Barcode Tetrads

   1. Revive-Zellen aus den gefrorenen Aktien in 2.3 von O / N Wachstum in 5 ml YPD + G418 (200 ug / ml) unter Rühren erzeugt bei 30 ° C.
   2. Waschen der Zellen von dem O / N Kulturen 3x in PBS (pH 7,4) und anschließend hat ein Resuspendieren der Zellen in Sporulationsmedium ⁷ plus 200 ug / ml G418.
   3. Man schüttelt die Sporenbildung Kulturen bei RT und tägliche Überwachung der Sporenbildung Fortschritte, bis neue Tetraden haben aufgehört zu bilden.
   4. Sobald die Kultur enthält gut ausgebildeten Tetraden und relativ wenigen Dyaden, Kulturen entfernen Agitation und lassen bei RT für mindestens 7 Tage. Während einige Kreuze können zugänglich auf Platte Verdauung und Störung so schnell wie Tetraden gebildet haben sein (gemessen als in 7.3), ist die zusätzliche Inkubation (7-10 Tage in unseren Versuchen) die für andere Kreuze. Daher wird dieser Schritt sehr empfehlenswert.

   4. Stellendie Tore für FACS Tetrad Sortierung

   Die meiotisch ausgedrückt SPS2-GFP-Fusions auf dem Plasmid ermöglicht pCL2_BC Tetraden in der Sporulation Kultur detektiert und aus der Kultur isoliert werden durch Fluoreszenz. Das folgende Protokoll wurde für eine FACSAria II entwickelt.

   
   2. FACS-Gatter. Eine Reihe von vier aufeinanderfolgenden Toren verwendet wird, um Tetraden isolieren. Die in (A) gezeigt, Toren und (B) zur Verringerung der Anzahl von Klumpen. Fluoreszenzereignisse mit der Gate-in (C) ausgewählt. Das Histogramm in (D) zwei Peaks. Veranstaltungen in der linken Spitze sind in erster Linie Tetraden (linkes Bild Einschub) und Ereignisse in die richtige Spitzen Tetraden sind in der Regel mit einem angeschlossenen Kopfhörer (Bild rechts im Bild). Eine letzte Tor istangewandt, um diesem Histogramm, an Veranstaltungen, die meist Tetraden (rote Balken) sind zu wählen. Diese Zahl hat sich von Ludlow et al ¹ geändert worden.

   1. (2A und 2B) Legen Sie das sporenbildenden Kultur auf eine FACS-Sorter und zwei Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung Tore gesetzt, um Schmutz, verklumpte Zellen und mehreren Zellen pro Tröpfchen auszuschließen.
   2. Es sollte eine Bevölkerung von fluoreszierenden Zellen, die bei der Verwendung der SPS2-GFP-Reporter-Konstrukt gehören Dyaden und Tetraden ¹⁰ sein. Tor der GFP gegen FSC, diese Leuchtstoff Ereignisse (2C) enthalten.
   3. Je nach Beanspruchung Hintergrund kann es notwendig sein, eine zusätzliche Gate Klumpen, die Tetraden und andere Zellen umfassen auszusortieren. Wenn dies erforderlich ist, prüfen einen FSC-Histogramm der Fluoreszenz Ereignisse und geben ein Tor, das Ereignisse mit geringeren FSC (2D, gated Veranstaltungen sind in rot) umfasst.
   4. Prüfen Sie die Effizienz der t er Anschnittregelung ordnen ~ 1.500 Tetraden auf einen Objektträger und zum Zählen der Anteil der nicht-Tetraden Tetraden mit einem Phasenkontrastmikroskop bei 400-facher Vergrößerung. Der Prozentsatz der Tetraden genau durch Zählen nur ~ 200 sortiert Ereignissen abgeschätzt werden, aber Sortier ~ 1500 verringert die Menge an Zeit für die Suche nach Zellen auf dem Objektträger. Alternativ kann das Verhältnis der Tetraden nicht-Tetraden in Schritt 4.5 geprüft werden.
   5. Überprüfen Sie regelmäßig, dass die Sortier genau die Berichterstattung über die Zahl der Veranstaltungen von 25 Sortier Tetraden auf einen Objektträger und die Prüfung der in den Tropfen enthaltenen Zellen mit einem Phasenkontrastmikroskop bei 400-facher Vergrößerung. Es sollte 25 Tetraden im Tropfen sein. 3-4x wiederholen, um die Varianz des FACS Instruments beurteilen.

   5. Sortierung Tetrads auf eine Agarplatte

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   Abbildung 3. Platzierung des Agar-Platte auf der FACS-Sorter. Um Tetraden in einen kleinen Tropfen der Lösung Zymolyase in der Mitte von einem Standard-(Kreis-) Agar-Platte, ein Standard-(100 mm rechteckig) platziert sortieren 96-Well-Platte ist das erste auf der Stufe des Zellsortierer angeordnet, und die Sortiereinrichtung so programmiert ist, Tetraden in einem bestimmten gut deponieren (in diesem Fall D5). Dann wird die kreisförmige Agarplatte auf der Oberseite der Platte mit 96 Vertiefungen platziert und ausgerichtet, so dass die Tropfen Zymolyase über die vorgegebene gut zentriert.

   1. Erwärmen die gewünschte Anzahl von YPD + G418 (200 ug / ml)-Platten für mindestens 1,5 Stunden in einem 37 ° C-Inkubator in der Nähe der FACS-Sorter angeordnet.
   2. Ein Schlüsselmerkmal des Sortier Protokoll ist die Fähigkeit, genau zu zielen FACS sortiert Tetraden zu einer bestimmten Stelle auf einer Agar-Platte, die einen Pool von Zymolyase Lösung enthält. Um dies zu tun, setzen Sie ein "Wahrzeichen" 96-Well-Platte auf Ter automatisierten Zellablageeinheit (ACDU) der Sorter. Bereiten Sie eine Art Layout, das 25 Tetraden in eine Vertiefung einer 96-Well-Format zu sortieren wird. Wählen Sie ein gut in der Nähe der Mitte der Platte, z. B. auch D5. Abbildung 3 zeigt eine Petrischale und 96-Well-Platte auf einen Zellsortierer geladen. Sortierung 25 Tetraden pro Platte ergibt gut getrennten Kolonien.
   3. Bringen Sie einen Stapel von 10-Agar-Platten aus dem 37 ° C Inkubator zum Sortierer.
   4. Nehmen Sie eine Agar-Platte und Pipette 25 ul Zymolyase-Lösung (1 mg / ml in 0,7 M Sorbit) auf dem Agar in der Nähe der Mitte der Platte. Dann wird die Platte auf dem Wahrzeichen 96-Well-Platte, richten Sie die Zymolyase Tröpfchen über dem Ziel gut aus Schritt 5.2, z. B. auch D5.
   5. Starten Sie die Art und abzuscheiden 25 Tetraden in der Mitte der Zymolyase Tröpfchen auf der Agarplatte. Dann entfernen und die Platte abgedeckt.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 5.4 und 5.5 bis 25 Tetraden wurden in Zymolyase Tröpfchen auf jeder Platte im Stapel sortiert worden.
   7. Rückgabe den Stapel von Tetraden-enthaltenden Platten zu dem 37 ° C Inkubator.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 5.3 bis 5.7, bis alle Platten Tetraden.

   6. Trenn-Sporen

   1. Inkubieren jeder Stapel Tetrade Agarplatten bei 37 ° C für 1,5 Stunden.
   2. Platten entfernen aus dem Inkubator, fügen 15-25 sterile Glasperlen 3 mm pro Platte, und schütteln Sie die Platten als Stapel (oder als zwei Stapel von 5 Platten) für 3-5 min. Die beste Trennung wird durch Sporen starr bewegen die Platten von Seite zu Seite, um zurück-oder Front erreicht. Die Platten, so dass die Perlen "Wirbel" um den äußeren Rand der Platte nicht bewegen. Lassen Sie die Perlen auf den Platten, wenn Sie fertig.
   3. Legen Sie den Stapel von Platten mit Perlen stehen in einem 30 ° C-Inkubator. Rufen Sie die nächste Stapel Platten aus dem 37 ° C-Inkubator, und wiederholen Sie Schritt 6.2.
   4. Platten O / N inkubieren bei 30 ° C.

   7. Ernten Kolonien

   1. Nachein O / N-Inkubation bei 30 ° C sollten kleine Kolonien auf den Platten gebildet sind. Die Platten vorsichtig aus dem Inkubator zu entfernen, ohne die Glasperlen zu stören.
   2. Entfernen Sie die Glasperlen durch sorgfältig und schnell über ein tiefes Gefäß Umdrehen der Platten. Der Behälter sollte tief genug, um die Perlen ohne dass sie hüpfen auf und traf den Agar-Platte zu fangen. Durch Tippen auf die Unterseite der Platte, während es umgekehrt ist, kann helfen, zu vertreiben Perlen, die auf die Platte geklebt werden. Diese Perlen können durch gründliches Waschen mit Seife wiederverwendet werden, Spülen und mit VE-Wasser und Sterilisieren durch Autoklavieren.
   3. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte und verwenden Sie die Anzahl der Kolonien, die Effizienz der Sporen Trennung und Rückgewinnung zu schätzen. Zum Beispiel könnte 25 Tetraden pro Platte für ein Kreuz mit nahezu 100% Lebensfähigkeit insgesamt 100 Kolonien pro Platte.
   4. Von Platten mit einer ausreichenden Zahl von Kolonien (> für ein Hoch Lebensfähigkeit Kreuze 65), Transfer-Zellen aus jeder colony in eine separate Vertiefung einer 96-Well-Platte mit YPD Flüssig + G418. Außerdem notieren die Vertiefungen mit Kolonien von der gleichen Agar-Platte; Diese Informationen werden verwendet, um die Zuordnung tetrad Software zu unterstützen.
   5. Verwenden Sie die 96-Well-Platten flüssigen Kulturen für die Genotypisierung und für die Rettung Stämme als Glycerin eingefroren Aktien Saatgut. Details zu RAD-Tag-Sequenzierung und Sequenzanalyse kann in Ludlow et al ¹ gefunden werden.

Ergebnisse

BEST können die Geschwindigkeit, mit der Sporen von Tetraden isoliert werden können erheblich verbessern. Als ein Beispiel für den Durchsatz dieses Verfahren liefern kann, durchgeführt, ein Forscher die FACS-Sortierung und Trennung Sporen (Schritte 5.1 bis 6.3) mit 149-Agar-Platten in 3 h ^1. Eine äquivalente Ausbeute (ca. 3.725 Tetraden) würden mehr als 90 Stunden der manuellen Zerlegung erfordert. Wie bei vielen Hochdurchsatzverfahren, die aktuelle Iteration des Verfahrens hat jedoch einen gewissen Verlust an Effizienz im Vergleich zur manuellen Dissektion. Dieser Verlust manifestiert sich als eine geringere Anzahl von Kolonien gewonnen, verglichen mit der Erwartung, berechnet auf der Basis der Lebensfähigkeit der Sporen der Quer durch manuelle Dissektion (Schritt 1.4) ermittelt. Unter der Annahme, dass die Ursachen der Sporen Verlust (Diskussion) beeinflussen Sporen zufällig kann Schätzungen, wie viele Kolonien gewonnen werden Mitglieder der Tetraden in dem 1, 2, 3 oder 4 Sporen wurden gewonnen (Fig. 4) ermöglicht werden.

Abbildung 4. Simulation der Verfahren die Effizienz im Tetradenstadium Ebene. Nicht erfolgreiche Sporen zu erholen (wie Kolonien) kann aufgrund Sporen inviability, sporen Haftung auf den Glasperlen, das Versagen der Sporen voneinander zu trennen, etc. Die Binomialverteilung verwendet wurde um den erwarteten Anteil der Tetraden (mit mindestens einer erfolgreich wiederhergestellt Sporen) Herstellung von 4, 3, 2 oder 1 Kolonien bezogen auf den Anteil aller Sporen erfolgreich wiederhergestellt berechnen. Oder - 4 - Sporen Tetraden Dieser Graph kann als grobe Richtlinie für die Anzahl von Stämmen, die letztlich in 3 montiert werden dienen. Da die Anzahl der Kolonien pro Platte zunimmt, nimmt die Anzahl der vollständigen Tetraden gewonnen.

In dem oben beschriebenen Experiment, 25 Tetraden aus einer Kreuzung mit Lebensfähigkeit der Sporen in der Nähe von 100% (wie detdurch manuelle Zerlegung ermined) wurden auf ¹ 149 Agar-Platten. In diesem Experiment wurde die maximale Anzahl von Kolonien pro Platte zu beobachten war 80, was anzeigt, dass 20 Sporen konnte diskrete Kolonien bilden. Die mittlere Anzahl der Kolonien pro Platte betrug 62. Kolonien von den Platten 61, die 65 oder mehr Kolonien wurden geerntet und sequenziert. Oder - 4 - Von den 3.700-Stämme, die Sequenzierung Qualitätskontrolle durchlaufen, könnten rechnerisch 72% in 3 zugeordnet werden Sporen Tetraden.

Diskussion

Viele Bereiche der Genetik Forschung, die von komplexen Abbildungsmerkmal ¹¹ auf die Untersuchung der Mechanismen ¹² zugrunde liegenden DNA-Rekombination, erfordern eine extrem große Anzahl von Nachkommen und große Mengen von DNA-Sequenzierung. Techniken, die die Leistung von herkömmlichen Ansätzen mit der Kapazität von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung zu heiraten haben das Potenzial, Studien, die vorher unlösbar waren zu ermöglichen. Obwohl mehrere Hochdurchsatz-Methoden haben Hefegenetik tatsächlich auf spezifische Probleme angewendet hat jede Einschränkungen, die kurz von der breiten Anwendbarkeit der konventionellen Tetradenanalyse fallen. BEST-Adressen diese Herausforderungen durch den Einsatz einer Hochdurchsatz-Ansatz, der Tetrade Dissektion und Genotypisierung des Nachkommen von Hefe-Kreuze. In Verbindung mit Multiplex-RAD-Tag-Sequenzierung, bietet BEST eine kostengünstige Möglichkeit, Genotyp Informationen für jeden Nachkommen Stamm aufzulesen Wahrung tetrad Beziehungen durch einzigartige tetrad Barcodes.0; Von allen derzeit verwendeten Hochdurchsatzverfahren, am nächsten BEST rekapituliert die Informationen durch eine manuell zerlegt Hefe Kreuz zur Verfügung gestellt.

BEST hat zwei wichtige Funktionen. Die erste ist die Verwendung von FACS, um schnell zu isolieren unsporulated Tetraden von Zellen in der Kultur (Protokoll Schritte 5-6). Die Möglichkeit, Tausende von fluoreszierenden Ereignisse (Tetraden) zu isolieren gibt BEST größten Gewinn an Durchsatz. Diese Automatisierung bietet einen noch größeren Vorteil gegenüber der manuellen Zerlegung für Kreuze mit geringer Sporenbildung Effizienz, aufgrund der erhöhten Zeit, um visuell zu identifizieren seltene Ereignisse benötigt. Die zweite wichtige Merkmal ist die Verwendung eines hoch komplexen molekularen Barcode (Protokoll Schritt 2), die für jede Schwester Sporen einer Tetrade übertragen wird. Da diese Barcodes verwendet werden, um rechnerisch zu rekonstruieren, die Tetrade Beziehungen zwischen Sporen, die zufällig auf einer Agarplatte verteilt wurden, die Notwendigkeit, manuell Arrayzellen in einem geordneten Raster gelindert werden. Schließlichda das Molekular Barcode und die Sporenbildung spezifischen GFP-Reporter-Gen physikalisch (auf dem gleichen Plasmid) verbunden werden nur Tetraden, die die molekulare Barcode beibehalten wurden durch FACS-Sortierung ausgewählt.

Es gibt zwei Aspekte, die Länge der Zeit, die Kulturen sollte in der Sporulation Medium inkubiert werden, zu regeln. Erstens, weil die Sporenbildung spezifische Reporter (SPS2-GFP) früh in der Meiose ausgedrückt, allein GFP unterscheidet nicht komplett 4-Sporen Tetraden aus Zellen, die noch nicht abgeschlossen haben Meiose (dh Dyaden). Während zusätzliche FACS-Gating kann die Zahl der fluoreszierenden, unvollständige Tetraden zu verringern, ist der einfachste Weg, um diese unerwünschten Ereignisse verringern einfache Überwachung des Sporenkultur (Schritt 3.3) und fort einmal neue Tetraden haben aufgehört zu bilden. In unseren Experimenten ist die Frequenz der Dyaden sortiert weniger als 1%. Zweitens, für einige Kreuze zusätzliche Zeit in Sporulationsmedium verbrachte bei RT ohne Rühren (Schritt 3.4) significantly verbessert die Trennung von Tetraden, die von den Glasperlen während des Plattierens ((Protokoll Schritt 6). In der Tat ist dieser Schritt für die Unterbrechung einiger Kreuzungen unbedingt erforderlich.

Wie alle Hochdurchsatz-Methoden ist BEST "lauter" als die entsprechenden konventionellen Ansatz. Die leichte Reduktion der Effizienz der BEST Vergleich zu herkömmlichen tetrad Dissektion konnte aus Kombinationen von verschiedenen Faktoren führen. Ein Faktor ist der erhöhte Verlust an sich lebensfähiger Sporen, die von Haftung an den Glasperlen während des Streuens oder erhöhte Sporen Tod aufgrund der mechanischen Beanspruchungen des Prozesses führen kann. Ein zweiter Faktor könnte einfach Plasmid-Verlust während der Meiose werden. Ein dritter Faktor könnte eine wirksame Abnahme der nutzbaren Kolonien aus Kolonien mit gemischten Genotypen ergeb sein, Kreuze schätzungsweise ca. 5% der Kolonien in unserer Pilot ^ein. Es ist wahrscheinlich, dass diese Kolonien repräsentieren Ausfälle von Schwester Sporentrennung. Da die schnelle Fluorescence Sortier-und Sporen Trennung erlauben die Sammlung von riesigen Mengen von Tetraden wird BEST gut gerüstet, um Rückgänge in Effizienz auf dieser Skala zu überwinden. Während künftige Iterationen des BEST könnten Wirkungsgrade, die der von manuellen Präparation zu erhöhen, ist es vielleicht eher, dass die aktuelle Flugbahn des exponentiellen DNA-Sequenzierung Kapazität schnell zu kompensieren für diese Ebene der nutzbaren Stamm Verlust. Unabhängig davon, wird die Fähigkeit, Tetradenanalyse auf die Waage, um die am besten angewendet werden kann, führen Studien zu ermöglichen, die derzeit nicht machbar durch manuelle Methoden sind.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
FACSAria II (Special Order Unit)	BD Biosciences		Für dieses Verfahren sollten andere Zellsortierer in Frage kommen. Die Schlüsselfaktoren sind: (1) ein Laser-/Detektionssystem für den verwendeten Fluoreszenzreporter (488-nm-Laser zur Anregung von EGFP in unserem Fall), (2) die Fähigkeit, einzelne Ereignisse zu sortieren, (3) die Möglichkeit, auf Objektträger zu sortieren, um die Sortierqualität zu beurteilen und (4) die Möglichkeit, auf Petrischalen zu sortieren
Automatisierte Zellabscheidungseinheit (für FACSAria II)	BD Biosciences	643155 (wenn separat vom FACSAria-Gerät erhältlich)
Zymolyase 100T	Seikagaku Biobusiness
G418	A.G. Wissenschaftliche		http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html