Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Genetische Varianten, sowohl β _2-Integrine und ICAM-Liganden sind nun erkannt, mit der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen ^1,2 zugeordnet werden. Die Bestimmung der funktionellen Konsequenzen dieser Varianten in Zellen von Individuen mit diesen Varianten abgeleitet ist, für das Verständnis, wie diese Varianten tragen zur Pathogenese von Autoimmunerkrankungen erforderlich. Solche funktionellen Untersuchungen ermöglichen die Bestimmung der Mechanismen, durch die natürlich vorkommende genetische Varianten Form die Immunantwort sowohl in Gesundheit und Krankheit. Im konkreten Beispiel von SLE, wir wissen jetzt, dass Varianten in ITGAM (CD11b) und sein Ligand, ICAM-1, stark mit der Entwicklung der Krankheit ^1,2 verknüpfen. Da Neutrophile sind entscheidend für Entzündungsreaktionen kann die quantitative Untersuchung der Adhäsion von Neutrophilen liefern mechanistische Einblicke in die genetischen Varianten in ITGAM / ICAM ändern Entzündung.

NeutropHIL feste Adhäsion von Zellen (EG) Endothelzellen ist ein hoch regulierter Prozess und spielt eine wesentliche Rolle bei Entzündungsreaktionen ^3,4. Die feste Adhäsion von neutrophilen folgt Anfangs Neutrophilen-Roll-und Capture auf die EG und schließlich in Trans in vivo führen. Diese Verfahren umfassen viele verschiedene Arten von Adhäsionsmolekülen, wie ICAM-1, ICAM-2, P-Selectin, E-Selectin in den Endothelzellen und β _2-Integrine auf der Neutrophilen ^5-9. Somit wird eine sorgfältige Quantifizierung der Adhäsion von Neutrophilen von Spendern mit verschiedenen Allelvarianten von Adhäsionsmolekülen wichtig sein, um die funktionalen und pathologischen Folgen dieser genetischen Varianten zu verstehen.

Erprobung eines Strömungskammer kann eine in vitro-Umgebung mit Schubspannung ähnlich der in dem Blutgefäß in vivo Umgebung ^10-12 beobachtet erstellen. In der Tat, eine Flusskammer-Assay mit menschlichen Nabel gekoppeltcal Venenendothelzellen (HUVEC), die in vivo Umgebung eines Blutgefßes zu simulieren. Mit dieser Methode kann man die Gesamtzellhafteigenschaften gegenüber Endothelzellen zu untersuchen. Zusätzlich ermöglicht auch die sehr kontrollierter Umgebung der Strömungskammer Beurteilung der Zellbindung an gereinigtes Haftliganden, wie ICAM-1, um die Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen erleichtern.

Wir stellen hier ein Verfahren, das eine Strömungskammer Haftung Assaysystem, um die Klebeeigenschaften des menschlichen peripheren Neutrophilen zu HUVEC und gereinigten Liganden Substraten zu untersuchen. Mit dieser Methode mit Zellen von Spendern, die verschiedene Adhäsionsmolekül Allel-Varianten können wir beurteilen, wie diese genetischen Varianten humanen neutrophilen feste Haftung verändern.

Alle Spender für diese Studie rekrutiert gab schriftliche Einwilligung und die Studie wurde von der Universität von Alabama in Birmingham Institutional Review Board genehmigt.

1. HUVEC Erste, Kultur und Subkultur

1. Kultur menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) in vitro in komplettem Wachstumsmedium, das von Endothelzellen Grundmedium besteht (siehe Liste der Materialien) mit einer endothelialen Zellwachstumsfaktoren ergänzt.
   Anmerkung: Die Wachstumsfaktoren, die in dieser Studie verwendet werden, umfassen: 5 ng / ml humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor (hEGF), 1,0 mg / ml Hydrocortison, 50 mg / ml Gentamicin und 50 ng / ml Amphotericin-B (GA-1000), 2 % fötalem Rinderserum (FBS), 0,5 ng / ml Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), 10 ng / ml menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Basis mit Heparin (hFGF-B), 20 ng / ml menschlichem rekombinantem Insulin-like Growth Factor ( R ^3-IGF-1), 1 &mgr; g / ml Ascorbinsäure und 22,5 ug / ml Heparin. Das Komplettmediumzunächst bei 37 ° C hergestellt und dann bei 4 ° C für die Verwendung innerhalb von 1 Monat nach der Herstellung gelagert werden.
2. In einen Kolben für Zellen herzustellen, wird komplettem Wachstumsmedium auf eine 75 cm ^{2-Gewebekulturkolben} (1 ml / 5 cm ²⁾ und dann der Kolben lässt man auf 37 ° C / 5% CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator für äquilibrieren hinzugefügt mindestens 30 min. Menschliche HUVEC direkt in diesem äquilibriert Kulturkolben in einer Dichte von 2.500-5.000 Zellen / cm ² ausgesät werden.
3. Während die Medien ausgleich, schnell auftauen Lager HUVEC Kryoröhrchen in einem 37 ° C Wasserbad. Dispergieren der Zellen in der ursprünglichen Speicherfläschchen durch Vortexen und fügen sie direkt zu dem Kulturkolben mit dem voräquilibriert HUVEC komplettem Wachstumsmedium, um eine Dichte von 2.500-5.000 Zellen / cm ² zu erreichen. Die Flasche vorsichtig rocken gleichmäßig zu verteilen und die Zellen dann die Flasche zurück in den Inkubator. Diese Zellen stellen nun die ^1. Durchgang.
<li> Medium sollte alle zwei Tage gewechselt werden, bis die Zellen 70-80% konfluent.
4. Die HUVECs kann nun aus der Kulturflasche mit Trypsin / EDTA geerntet werden. Das Kulturmedium wird aus den Kulturkolben, gefolgt von einer PBS spülen, um restliches Eiweiß und Kalzium aus den Zellen zu entfernen abgesaugt. A 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung zugegeben und innerhalb von 2-6 min Zellablösung sollte klar sein, wie durch Lichtmikroskopie untersucht.
5. Wenn 90% der Zellen werden von der Platte abgerundet, stoppen Sie die Trypsinierung durch Zugabe eines gleichen Volumens 2x Trypsin-Inhibitor. Um die Ernte der Zellen zu erleichtern, fügen Sie eine weitere gleiche Menge an vollständige Wachstumsmedium. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen.
6. Die abgelösten Zellen zentrifugiert bei 225 g für 5 min bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand und dann Resuspendieren der Zellen in 2-3 ml Vollwachstumsmedium. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und Lebensfähigkeit mit einem Hämazytometer und Trypanblau.
7. Um th nutzenE geernteten Zellen für Studium, wieder Samen zusätzliche 75 cm ^2-Kolben mit Zellen in einer Dichte von 10.000 Zellen / cm ² und gehen Sie zu Schritt 2.2. Alternativ können die Zellen an diesem Punkt für zukünftige Studien eingefroren werden. Für Zellgefrier Pellet der Zellen durch Zentrifugation bei 225 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Absaugen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in FBS mit 10% DMSO bei einer Konzentration von 1 x 10 ⁶ Zellen / ml. Die Zellsuspension wird dann nach dem Einfrieren der Zellen in einem Zellgefrierbehälter zu Kryoröhrchen überführt und bei -80 ° C gelagert.

2. HUVEC Layer-Vorbereitung

1. Verwendung von gefrorenem ^2. Passage HUVECs: Wiederbelebung und Kultur. Wenn Sie aktiv wachsenden Zellen, gehen Sie zu Schritt 2.2.
   1. Auftauen Kryoampulle enthält ^2. Passage HUVECs aus Schritt 1.8 schnell in einem 37 ° C Wasserbad. Übertragen Zellen aus dem Kryoröhrchen in ein 15 ml steriles Zentrifugenröhrchen und 10 ml Wachstums medium.
   2. Zentrifugieren der Zellen bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur und saugt den Überstand, um das restliche DMSO zu entfernen.
   3. Zellpellet mit kompletter Wachstumsmedium und übertragen die Zellen in einer 75 cm ^2-Kolben. Hinzufügen Wachstumsmedium auf ein Gesamtvolumen etwa 20-25 ml und bei 37 ° C / 5% CO _2.
2. Optisch jeden Tag untersuchen die Zellkultur für Zusammenfluss mit Medienwechsel alle zwei Tage. Gewöhnlich versandfertig in 2-4 Tagen werden die Zellen 80-90% Konfluenz zu welcher Zeit sie bereit für den Einsatz in der Strömungskammer Assay zu erreichen.
3. Um die Kulturschale, die in der Flusskammer verwendet werden vorzubereiten (siehe Abschnitt 5), 1 ml von 10 ug / ml Fibronektin und 0,05% (w / v) Gelatine zu einer 35-mm-Gewebekulturschale und Pipette mehrmals, um sicher, dass die gesamte Plattenoberfläche beschichtet. Entfernen der übermäßigen Fibronektin und Gelatinelösung und der Luft trocknen die Platte mindestens 30 Minuten, um die Proteinmatrixbildung zu optimieren. Die fibronectin und Gelatine-Lösung kann bis zu 10x wiederverwendet werden.
4. Ernte der HUVEC-Zellen aus Schritt 2.2 unter Verwendung von Trypsin-EDTA wie in den Schritten 1.5-1.7 beschrieben. Seed 500.000 Zellen in jedes beschichtete Gewebekulturschale. 2 ml Wachstumsmedium in jeder Schale und bei 37 ° C / 5% CO _2.
5. Lassen Zellen zu wachsen, um, wie in Schritt 2.2 Konfluenz. Zellen sollten visuell täglich mit Mediumwechsel alle zwei Tage überprüft werden. Vor der Flusskammer-Assay, Prime die HUVEC mit 20 ng / ml TNF-α Menschen für 4-6 Stunden zu regulieren und stimulieren Adhäsionsmolekülexpression.

3. Gereinigtes Ligand Coating

1. Zeichnen Sie einen Kreis von 0,5 cm Durchmesser mit einem Marker oder Stift in der Mitte einer 35-mm-Gewebekulturschale.
2. Platte 20 ul von 20 ug / ml Protein A in der markierten Fläche. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um das Protein zu verbreiten, eine Lösung für den gesamten Bereich innerhalb des Kreisdurchmesser 0,5 cm zu bedecken. Es ist wichtig, nicht berühren oder zerkratzen die Oberfläche der dish. Inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde.
3. Mit 1 ml PBS (pH 8,0) waschen die Protein-A-beschichteten Platte 3x.
4. Platte 50 ul 1% BSA in dem markierten Bereich zu blockieren unspezifische Bindung auf der Platte. Inkubation für 2 h bei 4 ° C.
5. Mit 1 ml PBS, wie in Schritt 3.3 wasche die Platte 3x blockiert.
6. Bereiten Sie die Fc-Rezeptor-Liganden Haftung chimären Proteins Lösungen für die Beschichtung. In diesem Experiment wurde eine Chimäre ICAM-1/Fc Lösung bei 25 &mgr; g / ml und eine P-Selectin/Fc Chimäre bei 0,5 ug / ml in PBS (pH 8,0) wurde verwendet.
7. Bestreichen Sie die markierte Fläche mit 50 ul Substrat. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. Die Schale sollte innerhalb von zwei Tagen verwendet werden, und der beschichtete Bereich sollte nicht austrocknen. In PBS, wenn notwendig, die 50 ul Lösung auf der Platte zu halten.

4. Neutrophilen-Separation (alle Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt)

1. Nach Einholung der Einwilligung, sammeln Teilnehmer Blut durch Aderlass in einn Antikoagulans Blutröhrchen oder Vacutainer (EDTA oder Heparin). Nach der Blutentnahme, verdünnen das Blut 1:1 mit PBS vor der Trennung.
2. Bereiten Sie eine Zwei-Schicht Ficoll zur Trennung von PBMC und Neutrophilen in 50 ml-Zentrifugenröhrchen. Zuerst 15 ml Ficoll schwer (siehe Liste der Materialien, ρ = 1,118 bis 1,120), und dann sorgfältig Schicht 10 ml Ficoll leuchten (siehe Liste der Materialien, ρ = 1,077 bis 1,080) auf der Oberseite der schweren Ficoll. Es sollte eine scharfe Grenze zwischen dem Licht und Schwer Ficoll Ficoll Schichten sein. Anschließend vorsichtig Schicht 25 ml der verdünnten Blutprobe auf der Oberseite der Licht Ficoll, ohne die Ficoll-Schicht zu stören.
3. Das Röhrchen bei 250 × g für 30 min bei Raumtemperatur. Hinweis: Der Zentrifugenrotorbremse sollte ausgeschaltet sein, diese Spins um mögliche Störung der Zelltrennung während der Rotorverzögerung am Ende der Zentrifugation zu minimieren. Nach der Zentrifugation werden die folgenden Schichten (von oben nach unten) vorhanden sind: die oberste Schicht ist die Plasma foldurch die PBMC-Schicht auf der Licht Ficoll-Schicht heiraten, ist die Neutrophilen-Schicht mit wenigen roten Blutkörperchen (RBC) zwischen den leichten und schweren Ficoll gefolgt von der schweren Ficoll-Schicht und Erythrozyten am Boden der Röhre.
4. Ernte und übertragen die Neutrophilen-Schicht in ein neues 50 ml-Röhrchen mit einem Transfer-Pipette PBS auf ein Endvolumen von 50 ml und zentrifugiert bei 225 g für 10 min bei Raumtemperatur.
   1. Nach der Zentrifugation, kann es immer noch mit den Erythrozyten Neutrophilen gemischt sein. Saugen Sie den Überstand bis zur 10 ml-Marke. Resuspendieren des Neutrophilen-RBC Pellet durch vorsichtiges Schütteln der Röhre (oder einer kurzen niedriger Geschwindigkeit Vortex) und dann wieder waschen mit 50 ml PBS.
5. Nach dem zweiten Waschen, saugen Sie den Überstand. Um die kontaminierenden Erythrozyten zu entfernen, Resuspendieren der pelletierten Zellen in der Rest PBS durch Bewegung (oder kurz Vortex), 25 ml H ₂ O und sanft Wirbel für 10 Sekunden, um die RBC lysieren.
   1. 25 ml 1,8% NaCl und sofort mischendurch Zentrifugation bei 225 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Die verunreinigenden RBC sollte nun lysiert, wobei ein weißer neutrophilen Zellpellet werden.
6. Mit PBS Waschen Sie die neutrophilen Zellpellet.
7. Resuspendieren der isolierten Neutrophilen in RPMI-Medium mit 10% FBS und bestimmen die Zellkonzentration unter dem Lichtmikroskop mit einem Hämozytometer.
8. Stellen Sie die Zelldichte zu 500.000 Zellen / ml mit RPMI-10% FBS-Medium.

5. Flusskammer Adhesion Assay

1. Montieren Sie die Flusskammer. Legen Sie die 35 mm-Schale, die die konfluente HUVECs oder gereinigtes Haftung Rezeptor-Liganden auf dem Mikroskoptisch. Schließen Sie das Parallelplattenlaufkammer mit Spritzenpumpe, Vakuumsystem und lassen Sie eine Zeile offen für die Neutrophilen-Eingang. Legen Sie die Flusskammer auf der Platte und befestigen Sie die Flusskammer Anordnung ^13. (Siehe Fig. 1)
2. Starten Sie das Video-Aufnahme-Programm auf dem Computer verbunden to das Mikroskop. Stellen Sie das Feld und Fokus des Mikroskops, bis eine klare Feld mit ausgewachsenen HUVEC Zellen oder einem Feld innerhalb der Ligand Beschichtungsbereich sichtbar ist.
3. Mit der Spritzenpumpe, spülen Sie die Flusskammer mit RPMI Medium. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Kammer oder der Neutrophilen-Eingabezeile.
4. Wenn gewünscht, können die Neutrophilen mit niedriger Dosis (10 ^-8 M) für 10 min fMLP grundiert werden. Dies wird für eine Anpassung der basalen Ebene der Aktivierung von Neutrophilen zwischen ¹⁴ verschiedenen Spendern zu ermöglichen.
5. Verwenden der Spritzenpumpe, die Neutrophilen in die Strömungskammer in definierten Geschwindigkeiten zu injizieren (eine Geschwindigkeit von 350 &mgr; l / min, was einer Scherspannung von 1,5 dyn / cm ² entspricht in dieser Studie). Nehmen Sie das Video. Da die Adhäsion von Neutrophilen kann schnell erfolgen, ist ein Video mit einer Länge von 4-5 min in der Regel ausreichend, um die Haftung Ereignissen zur Analyse quantifizieren.
6. Eine anhaftende Zelle als eine Zelle, die weniger als ein Zelldurchmesser bewegt definiertinnerhalb von 5 Sekunden auf der HUVEC oder Liganden-beschichteten Oberfläche ^15,16. Zählen Sie die Anzahl der adhärenten Zellen in das Feld in der aufgezeichneten Videos mit dieser Regel vor. Durch die Aufnahme von Videos mit ähnlicher Länge der verschiedenen Geber Neutrophilen, kann man die adhärenten Zellen / min berechnen, um die Hafteigenschaften zwischen verschiedenen Spendern zu vergleichen.

Beispiele von Neutrophilen-Bindung an gereinigte Ligand (ICAM-1/P-Selectin) beschichteten Strömungskammer (2) oder die Bindung an einen Neutrophilen-HUVEC beschichtet Strömungskammer Assay (Fig. 3) gezeigt. Wie in den Figuren gezeigt, Neutrophilen weiterhin zu akkumulieren / haften an der beschichteten Oberfläche oder HUVEC unter Bedingungen der kontinuierlichen Fluss. Unter unseren typischen Versuchsbedingungen, können wir 50-70 menschlichen Neutrophilen während eines Vier-Minuten Aufzeichnungsdauer fest an der beschichteten Oberfläche haften oder HUVEC beobachten. Jedoch Allelvarianten Neutrophilen Adhäsionsmoleküle oder Allelvarianten in dem Substrat (gereinigt Ligand oder HUVEC), konnte im Wesentlichen quantitative neutrophile Adhäsion 14 verändern.

Ferner beurteilten wir die Zeitabhängigkeit der in unseren Studien beobachtet Adhäsion von Neutrophilen Ereignisse. Während wir eine konstante Strömungsverhältnisse ist es möglich, dass die Hafteigenschaften der Zellen über die Zeit ändern. However, über die relativ kurze Zeit Kurse in unseren Studien haben wir keine konsistenten Unterschiede in der Rate der Haftung über die Zeit einhalten. Zum Beispiel die Beurteilung Haftung an den 1-2 Minuten-Zeitpunkten verglichen, um die Haftung zwischen den 3-4 min Zeitpunkten beobachtet wurden, sind nicht konsequent anders. Natürlich, wenn Zellen, die während des Experiments Adhäsion stimuliert, wechselt dann in Hafteigenschaften über die Zeit zu erwarten.

In unseren Studien zur Isolierung induzierte Aktivierung von Neutrophilen gesteuert wir durch absichtlich Grundierung der Zellen mit niedriger Dosis fMLP (10 -8 M) für 10 min vor der Studie. Endothelzellen (HUVEC in unseren Studien) bedarf einer vorherigen Aktivierung Adhäsionsmolekülexpression für optimale Leukozyten feste Haftung hochregulieren. In Abwesenheit von Vorbehandlung, wird Endothelzellen (HUVECs) sehr wenig Neutrophilen-Adhäsion zu unterstützen. In unseren Untersuchungen haben wir 10 ng / ml TNF-Behandlung für 4-6 Stunden vor der Verwendung. IL-1β (10 ng / ml) und LPS (0,5-1 ug / ml) können auch verwendet werden, um vor Aktivierung der Endothelzellen werden. Wichtiger ist, kann unbehandelt HUVEC als Negativkontrolle verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Zelladhäsion wird durch spezifische (Rezeptor-vermittelte) Neutrophilen-Endothel-Zell-Wechselwirkungen verursacht werden. Alternativ können Anti-Rezeptor-Antikörper verwendet, um spezifische Rezeptoren zu blockieren, um die Spezifität der Haftung zu beurteilen.

Abbildung 1. Flusskammer-Konfiguration auf dem Mikroskoptisch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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. Abbildung 2 Screenshots von einem Beispielvideo von Neutrophilen Einhaltung beschichteten Oberfläche zu verschiedenen Zeitpunkten (A ICAM-1/P-Selectin: 0 Zeitpunkt, B: 1 min Zeitpunkt, C: 2 min Zeitpunkt und D: 4 Minuten Zeitpunkt). Die Konzentration von ICAM-1 ist 25 ug / ml und P-Selectin ist 0,5 ug / ml. Neutrophilen-Strömungsgeschwindigkeit von 350 ul / min mit Neutrophilen Dichte auf 500.000 Zellen / ml.

. Abbildung 3 Screenshots von einem Beispielvideo von Neutrophilen Einhaltung HUVEC beschichteten Oberfläche zu verschiedenen Zeitpunkten (A: Zeitpunkt 0, B: 1 min Zeitpunkt, C: 2 min Zeitpunkt und D: 4 min Zeitpunkt).Neutrophile Strömungsgeschwindigkeit beträgt 350 ul / mit neutrophilen Dichte bei 500.000 Zellen / ml ml.

Tabelle 1. Beispielscherspannung in verschiedenen Organen und verschiedenen Arten.

* Von Artikeln 13, 16, 19 und 20 zusammengefaßt.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.