Methodenartikel

A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie

DOI:

10.3791/51454

⸱

3. Juni 2014

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1Centre for Interdisciplinary NanoPhysics, Department of Physics, University of Ottawa, 2University of Ottawa Heart Institue, University of Ottawa, 3Libin Cardiovascular Institute of Alberta, University of Calgary, 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Institute for Science, Society and Policy, University of Ottawa

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir stellen in diesem Artikel ein neues Streck Plattform, die verwendet werden können, um einzelne Zellantworten auf komplexe anisotropen biaxiale mechanische Verformung zu untersuchen und zu quantifizieren, die mechanischen Eigenschaften von biologischen Geweben.

Zusammenfassung

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Werkzeuge, die die Anwendung von mechanischen Kräften, um Zellen und Gewebe oder die Quantifizierung zu ermöglichen kann die mechanischen Eigenschaften von biologischem Gewebe haben sich zum Verständnis der Grund Mechanobiologie beigetragen. Diese Techniken wurden intensiv genutzt, um zu zeigen, wie die Entstehung und Progression von verschiedenen Krankheiten sind stark von mechanischen Signale beeinflusst. Dieser Artikel stellt eine multifunktionale biaxiale Streckung (BAXS)-Plattform, die entweder mechanisch stimulieren können einzelne Zellen oder zu quantifizieren, die mechanische Steifigkeit des Gewebes. Die BAXS Plattform besteht aus vier Schwingspulenmotoren, die unabhängig voneinander gesteuert werden können. Einzelne Zellen können auf einem flexiblen Substrat, das an die Motoren so dass man die Zellen, um komplexe, dynamische und räumlich variierenden Dehnungsfeldern aus befestigt werden kann, kultiviert werden. Umgekehrt wird durch den Einbau eines Kraftlastzelle, kann man auch eine Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Primärgeweben, wie sie Deformationszyklen ausgesetzt sind.In beiden Fällen muss eine richtige Satz von Klemmen entwickelt und montiert, um den Motoren BAXS Plattform, um fest zu halten das flexible Substrat oder das Gewebe von Interesse sein. Die BAXS Plattform auf einem inversen Mikroskop, um die gleichzeitige Durchlicht und / oder Fluoreszenzabbildung durchzuführen, um die strukturelle oder biochemische Reaktion der Probe während des Streckens Experimente untersuchen montiert werden. Dieser Artikel enthält experimentelle Details der Gestaltung und Nutzung des BAXS Plattform und präsentiert die Ergebnisse für einzelne Zelle und ganze Gewebestudien. Die BAXS Plattform wurde verwendet, um die Verformung der Kerne in Einzel Maus Myoblasten Zellen in Reaktion zu messen, um Stamm-Substrat und die Steifigkeit der isolierten Maus-Aorten messen. Die BAXS Plattform ist ein vielseitiges Werkzeug, mit verschiedenen optischen Mikroskopie, um neue Erkenntnisse zu den mechanobiological subzellulärer, Zell-und Gewebespiegel bieten ganze kombiniert werden können.

Einleitung

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Die mechanische Mikro spielt eine wichtige Rolle in vielen Zellfunktionen wie Proliferation, Migration und Differenzierung, die eine tiefgreifende Wirkung auf die Entwicklung und die Homöostase von Geweben und auch Krankheiten 1-6 haben. Im Laufe der Jahre eine Vielzahl von experimentellen Werkzeuge werden verwendet, um mechanisch zu stimulieren Zellen oder Geweben zu messen und mechanischen Eigenschaften von biologischem Gewebe mit dem Ziel der Erhöhung der unser Verständnis der Grund Mechanobiologie und Untersuchung der Entstehung und Progression von Krankheiten 6-17. Allerdings muss man oft auf verschiedenen experimentellen Vorrichtungen, um ....

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Protokoll

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1. Mechanische Verformung von Einzelzellen

  1. Die Herstellung einer PDMS Substrat mit Embedded Leuchtstoffperlen
    Vor der Herstellung des Substrats werden fluoreszierenden Mikrosphären in einer Wasserlösung in Isopropanol suspendiert zu Wulst Mischen in PDMS aufgrund der hydrophoben Natur zu verbessern.
    1. Pipette 500 ul von fluoreszierenden Mikrokugeln in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 16.200 × g für 10 min.
    2. Überstand verwerfen und fügen Sie 500 ul Isopropanol folgte mit 5 min von Vortex. Setzen Sie die Fläschchen beiseite über Nacht im Dunkeln, damit keine großen Partikel-Aggregate zu sedimentieren.
    3. ....

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Ergebnisse

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Handy Stretching

Die BAXS Plattform verwendet, um die mechanische Antwort des Kerns in einzelne Maus-Myoblasten-Zellen (C2C12) auf ein Substrat eine Verformung von 25% exponiert wurden. Myoblasten-Zellen werden in Muskelgewebe gefunden und werden ständig mechanischen Dehnung und Kompression in vivo ausgesetzt wird. Die Form und die mechanischen Eigenschaften des Zellkerns haben gezeigt, eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression und Transkriptionsaktiv.......

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Diskussion

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Die hier vorgestellten BAXS Plattform ermöglicht zahlreiche Experimente in der Studie von Mechanobiologie aus Untersuchungen von Einzelzellen zu ganzen Geweben. Außerdem ist die Plattform hoch flexibel und konfigurierbar, so dass für zahlreiche mechanische Stimulationsexperimente und multiaxiale Zugversuch. Die Plattform ermöglicht auch die Aufrechterhaltung von Zellen und Geweben unter physiologischen Bedingungen und ermöglicht die gleichzeitige Mikroskopie während des Streckens Experimenten. Die beiden in den vorherig.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

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DT wurde von einem Postdoc-Stipendium von le Fonds de Recherche du Québec-Nature et Technologies (FQRNT) und eine MITACS Elevate Strategische Fellowship unterstützt. CMC wurde von einem Postdoc-Stipendium von le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) und Ernest und Margaret Ford Kardiologie dotierten Forschungsstipendium an der University of Ottawa Heart Institute unterstützt. EOB wurde durch Betriebskostenzuschüsse MOP80204 von der kanadischen Institut für Gesundheitsforschung (CIHR) und T6335 aus der Herz-und Schlaganfall-Stiftung von Ontario unterstützt. Die CIHR und Medtronic kollektiv EOB mit einem Peer-Review-Research Chair (URC # 57093). AEP wird durch d....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PDMSEllsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0,5 kgDas in diesem Protokoll verwendete Verhältnis von Base zu Vernetzer beträgt 20:1. Mischen Sie eine laminare Haube ein, um zu verhindern, dass Staub Ihre Haut verunreinigt.
FluoSpheres fluoreszierende MikrosphärenInvitrogenF8810Vor Licht schützen.
Lineare SchwingspuleMoticontLVCM-051-051-01Die motro wird in zwei Teilen (Magnet und Spule) geliefert. Er muss auf einem Kugellagersystem montiert werden, um funktionsfähig zu sein.
KugelgelagerterSchlitten Edmund OpticsNT37-360Miniatur- und kleine Linearführungen mit Kugellager
Linearer PositioniertischEdmund Optics38-960Zentrierantrieb 1,25" quadratische lineare Verschiebungstische
Optischer EncoderGSI microE systemsMercury II 1600S -Reflektierender Inkrementalgeber
Motion ControllerGalilDMC-2143(DIN)-DC48 mit AMP-204404-Achsen-Controller mit einem 4-Achsen-Verstärker
WägezelleHoneywell31 niedrigeMiniatur-Wägezelle mit einem Bereich von 0-150 g
Insektenminutiens Pins (0,20 mm)Pin Service Austerlitz InsektenstifteEdelstahlstifte, die in einer offenen Dreiecksform gebogen sind
SU-8 2050Micro ChemSU-8 2050Permanenter Epoxid-Negativ-Fotolack. Von Hitze und Licht fernhalten
Luft-Plasma-BehandlungssystemGlowresearchAutoglow Sauerstoff-Plasma-System
Rattenschwanz-KollagenInvitrogenA10483-01Kollagen I, Rattenschwanz 5 mg/ml
Hoechst 33342InvitrogenR37605DNA-spezifischer Fluoreszenzfarbstoff. Im Kühlschrank aufbewahren.
Kapton (Polyimidfolie) isolierte flexible Heizelementeomega.caKHLV-0504/(10)-P28 V flexible Heizkörper; kann mit einem 24 V
1/16 DIN Autotune Temperatur- und Prozessreglergeliefert werden omega.caCN63200-R1-LVTemperaturregler; Versorgung mit 24 V.
DMEM-KulturmediumHycloneSH3024301Dulbecco' s modifizierte 30 Eagle Medium. Halten Sie bei 4 ° C
Penicillin-Streptomycin-HyklonSV30010Halten Sie den Bestand eingefroren. Die Lösung bei 4 °C weiterarbeiten.
Fötales Rinderserum (FBS)HyklonSH3039603CTiefgefroren aufbewahren.
Trypsin 0,05%HyklonSH30236,02Tiefgefroren aufbewahren. Verdau von Zellanheftungsproteinen für die Subkultivierung
HepesWisent Inc330-050-ELHEPES-gepufferte Salzlösung 
NaClFisher ScientificBP358-1HEPES-gepufferte Salzlösung / Krebs physiologische Lösung
KClFisher ScientificBP366-500HEPES-gepufferte Salzlösung / Krebs physiologische Lösung
MgSO4Fisher ScientificM65-500HEPES-gepufferte Salzlösung / Krebs physiologische Lösung
CaCl2Fisher ScientificC614-500HEPES-gepufferte Salzlösung / Krebs physiologische Lösung
DextroseFisher ScientificBP220-1HEPES-gepufferte Salzlösung / Krebs physiologische Lösung
NaHCO3Fisher ScientificBP328-1Krebs physiologische Lösung
KH2PO4Fisher ScientificBP362-500Krebs physiologische Lösung
Carbogen 95% O2/5% CO2LindleDIN:02154749Krebs physiologische Lösung Oxygenierung
NocodazolSigmaM1404Mikrotubuli Depolymerisationsmittel
Cytochalasin-DSigmaC8273Aktinfilamente Depolymerisationsmittel
Anti-α- SMA-FITCSigmaF3777Zur Färbung und Quantifizierung des Gehalts an glatten Muskelzellen
Picrosirius-RotfärbungFluka43665Zur Färbung und Quantifizierung des Kollagengehalts
mit 0,5 μm Auflösung.

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Res Ther. 3, (2012).
  2. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
  3. Wang, N.....

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Schlagwörter

Biaxiale Streckplattformmechanische DeformationZell MechanobiologieMessung der GewebesteifigkeitVoice Coil Motorenflexibles Substratinvertierte Mikroskopiefluoreszierende Mikrosph renPDMS HerstellungAnalyse von Aortengewebe

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