In-vitro-Methode zur E-Selektin-vermittelte Interaktionen zwischen Prostata zirkulierenden Tumorzellen, abgeleitet von Patienten und humanen Endothelzellen beachten

Summary

Unser Bericht beschreibt eine einzigartige Methode zur Visualisierung und Analyse von CTC / EG Wechselwirkungen bei Prostatakrebs unter physiologischen Flussbedingungen.

Abstract

Metastasierung ist ein Prozess, in dem Tumorzellen zu vergießen aus dem Primärtumor intravasate Blut Gefäß-und Lymphsystem, damit, den Zugang zu extravasieren und bilden einen Sekundär Nische. Die Extravasation von Tumorzellen aus dem Blutgefäßsystem kann mit Endothelzellen (ECs) und Tumorzellen aus verschiedenen Zelllinien untersucht werden. Erste Studien wurden mit statischen Bedingungen durchgeführt, aber es ist gut dokumentiert, dass ECs anders unter physiologischen Flussbedingungen verhalten. Daher unterschiedlichen Strömungskammeranordnungen werden derzeit zum Studium Krebs-Zell-Interaktionen mit ECs verwendet. Aktuelle Durchflusskammer-Baugruppen bieten reproduzierbare Ergebnisse entweder mit verschiedenen Zelllinien oder Flüssigkeit bei unterschiedlichen Scherstressbedingungen. Jedoch zu beobachten und zu studieren Wechselwirkungen mit seltenen Zellen, wie zirkulierenden Tumorzellen (CTC), sind bestimmte Änderungen erforderlich, um das herkömmliche Strömungskammer-Anordnung hergestellt werden. CTCsind eine seltene Zellpopulation unter Millionen von Blutzellen. Folglich ist es schwierig, eine reine Population von CTC erhalten. Kontamination der CTC mit verschiedenen Arten von Zellen, die normalerweise im Blut gefundenen unvermeidlich mit vorliegenden Anreicherung oder Abreicherung Techniken. In dem vorliegenden Bericht beschreiben wir eine einzigartige Methode zur fluoreszenz Label zirkulierenden Prostatakrebszellen und studieren ihre Wechselwirkungen mit ECs in einer selbstorganisierten Flusskammer-System. Diese Technik kann weiter verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen Prostata-CTC und jedes Protein von Interesse zu beobachten.

Introduction

Metastasierung ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, der kaum verstanden bleibt. Der Ligand E-selectin/selectin Achse ist gezeigt worden, eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung durch Förderung der Primär adhäsiven Wechselwirkungen zwischen dem vaskulären Endothel und Krebszellen ^1,2 spielen. Endothelzellen (E)-Selectin ist ein Transmembran-Protein von aktivierten Endothelzellen exprimiert wird, während die verschiedenen E-Selektin-Ligand (en) durch Tumorzellen ³ ausgedrückt. Zahlreiche in vitro-Ansätze wurden erfolgreich eingesetzt, um E-selectin/selectin Ligand-Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Endothelzellen (ECs) <....

Protocol

1. Kultivierung HUVECs auf Mikroobjekttragerglaschen für Observing CTC-Endothel-Interaktionen

1. Unter der Gewebekultur Kapuze, zuerst den Mikroobjekt spülen, Kanalbreite von 1 mm mit PBS. Sanft Beschichtung der Mikroobjekt mit 200 ul von 50 ug / ml Fibronektin (gelöst in PBS) unter Verwendung einer 1-ml-Luer-Lock-Spritze.
2. Decken Sie die Mikroobjekt mit dem Deckel und halten Sie sie in der Gewebekultur Haube für 30 min. Langsame Abgabe der Flüssigkeit in den Mikroobjekt verhindert Blasenbildung im Kanal.
3. Perfuse 200 &mgr; l warme (37 ° C) HUVEC-Wachstumsmedium (M199-Medium, 1 M HEPES, 20% FBS, 5 mg / ml Heparin, 100 ug / ml Endothelzellen-....

Results

Figur 1 zeigt ein O / N-Kultur von einer Monoschicht von Endothelzellen auf der Mikroobjekt. Die Skalierungen auf Fig. 1A zeigt, dass 100% der Mikroobjekt sichtbar mit 5X Ziel, während 70% sichtbar mit einem 10X-Objektiv (Abbildung 1B). Für E-Selektin-vermittelte Wechselwirkungen werden die Zellen rollen an den Kanten nicht berücksichtigt, die mehr als 70% der Mikroobjekt verfügbar für Video-Aufnahme und-Wiedergabe Analyse macht. In unserer Erfahrung, zunächst dieses Se.......

Discussion

Aufgrund der geringen Anzahl von CTC unter Blutzellen, ist es schwierig, CTC als reine Population von Zellen zu isolieren. Um CTC / EC-Interaktionen zu untersuchen, die seltene und unreine Bevölkerung von CTC stellt zwei großen Herausforderungen: a) Identifikation von CTC unter Blutzellen; b) Beobachtung der CTC / EC-Interaktionen.

Um die erste Einschränkung der Identifizierung Prostata CTC unter Blutzellen zu überwinden, nutzten wir die Tatsache, dass praktisch a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microslide	Ibidi	80331
Fibronektin	Millipore	FC010
Kunststoffschlauch	Cole Parmer	EW-96115-08
Luer-Adapter für Männer	GlycoTech	31-001
Luer-Adapter für Innengewinde	GlycoTech	31-001
Spritzenpumpe	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-Lock-Spritze	BD Biosciences	309628
M199 Medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Labor für urologische Onkologie
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		zur Verfügung gestellt von Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x Objektiv	Zeiss Plan Neofluar
Reagenz für enzymfreie Zelldissoziation	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02