Method Article

Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

DOI:

10.3791/51474

⸱

September 3rd, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology and Physiology, University of California, Los Angeles, 2Department of Aerospace and Mechanical Engineering, University of Notre Dame, 3Molecular Imaging Center, University of Southern California

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir zeigen eine Mikrofluidik-basierten Assay, um die Zeitskala für Zellen für den Transit durch eine Sequenz von Mikrometermaßstab Verengungen zu messen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier werden wir ausführlich die Konstruktion, Herstellung und Verwendung von Mikrofluid-Vorrichtung, um die Verformbarkeit der eine große Anzahl von einzelnen Zellen in einer effizienten Weise zu bewerten. Typischerweise können Daten für ~ 10 2 Zellen in einem 1 h Experiment gewonnen werden. Ein automatisiertes Bildanalyseprogramm ermöglicht die effiziente Post Experiment Analyse von Bilddaten, so dass die Verarbeitung innerhalb weniger Stunden zu sein. Unsere Vorrichtung Geometrie ist einzigartig, da Zellen müssen durch eine Reihe von Mikrometermaßstab Einschnürungen zu verformen, wodurch die anfängliche Verformung und zeitabhängige Relaxation von einzelnen Zellen, die untersucht werden. Die Anwendbarkeit dieses Verfahrens auf die menschliche promyelozytische Leukämie (HL-60-Zellen) nachgewiesen wird. Fahren Zellen durch Mikrometermaßstab Verengungen mit druckgetriebenen Strömung verformen, beobachten wir, dass die menschliche Promyelozyten (HL-60-Zellen) kurzzeitig verschließen die erste Engstelle für eine mittlere Zeit von 9,3 ms vor schneller Passage durch die nachfolgenden constrictIonen mit einer mittleren Laufzeit von 4,0 ms pro Verengung. Dagegen all-trans-Retinsäure-behandelten (Neutrophile-Typ) HL-60-Zellen zu verschließen, die erste Einschnürung für nur 4,3 ms vor Passage durch die nachfolgenden Einschnürungen mit einer mittleren Durchgangszeit von 3,3 msec. Diese Methode kann Einblick in die viskoelastischen Eigenschaften von Zellen zu schaffen, und schließlich zeigen die molekularen Ursachen für dieses Verhalten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veränderungen in der Zellform kritisch in zahlreichen biologischen Kontext. Beispielsweise Erythrozyten und Leukozyten zu verformen durch die Kapillaren, die kleiner ist als ihre eigenen Durchmesser 1 sind. Bei der Metastasierung, müssen Krebszellen durch die engen Zwischenräume sowie gewundenen Gefäßsystem und lymphatischen Netze zu verformen, um an sekundären Standorten 2 Samen. Um das physikalische Verhalten einzelner Zellen zu untersuchen, präsentieren mikrofluidischen Systemen eine ideale Plattform, die individuell auf eine Reihe von Zellverhalten einschließlich ihrer Fähigkeit, durch enge Spalte 3 zu migrieren und zu passiv durch Mikrometermaßstab Verengungen 3 9 verformen studieren. Polydimethylsiloxan (PDMS) Mikrofluidik-Vorrichtungen optisch transparent sind, so dass Zellverformungen mittels Lichtmikroskopie sichtbar gemacht und unter Verwendung von Bildverarbeitungshilfsmittel analysiert werden. Darüber hinaus können Anordnungen von Verengungen genau definiert werden, wodurch Analyse von mehreren Zellen gleichzeitig mit einerDurch dass viele bestehende Techniken 10,11 übersteigt.

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Versuchsprotokoll zur Sondierung Zelle Verformbarkeit mit der "Handy-Deformer" PDMS mikrofluidischen Vorrichtung. Die Vorrichtung ist so ausgelegt, dass die Zellen durch sequentielle Passage Einschnürungen; Diese Geometrie ist in physiologischen Zusammenhängen, wie beispielsweise Lungen Kapillarbett 12 gemeinsam. Um die Zell Verformbarkeit messen, bietet Laufzeit eine bequeme Metrik, die leicht als die Zeit für eine individuelle Zelle dazu, durch eine einzige Engstelle 4,6 erforderlich ist, gemessen. Um einen konstanten Druckabfall über die verengten Kanäle während der Zell Transit zu gewährleisten, verwenden wir druckgetriebenen Strömung. Unser Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zur Einrichtung Konstruktion und Herstellung, Betrieb der Vorrichtung durch Druck angetriebenen Strömungs, Aufbereitung und Darstellung von Zellen, als auch die Bildverarbeitung, um die Zeit für Zellen, die durch eine Reihe von Verengungen verformen messen. Wir sindbeide Geräteausführungen und Vision der Datenverarbeitung als Zusatzcode-Dateien. Als ein repräsentatives Beispiel von Daten, zeigen wir Zelldurchgangszeit durch eine Reihe von Verengungen in Abhängigkeit von der Anzahl der Einschnürungen agiert. Analyse der Zeitskala für Zellen Transit wenn schmale Verengungen einer mikrofluidischen Vorrichtung kann Unterschiede in der Verformbarkeit von einer Vielzahl von Zelltypen 4,5,13 offenbaren. Die hier gezeigte Gerät eindeutig blickt Zelle Transit durch eine Reihe von Mikrometermaßstab Einschnürungen; Dieses Design emuliert den gewundenen Weg, die Zellen zu erleben im Umlauf und ermöglicht auch zusätzliche Sondierung physikalischen Eigenschaften der Zellen, wie zB Entspannungszeit.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mikrofluidik-Geräte-Design-

HINWEIS: Das Gerätedesign hat vier grundlegende Funktionsbereiche: Eingangsöffnung, Zellenfilter, Verengung Array und Austrittsöffnung (Abbildung 1). Der Gesamtaufbau kann auf eine Vielzahl von Zelltypen angewendet werden, mit geringfügigen Anpassungen Dimensionen. Hier vorgesehen sind ein paar grundlegende Gestaltungsempfehlungen zusammen mit Geräteparameter, die wirksam für eine Auswahl von primären und immortalisierten Zellen sind.

  1. Wählen Sie die Breite der Verengung Anordnungskanäle (1B) auf etwa 30-50% des durchschnittlichen Zelldurchmesser ist; Diese Verengung zu Zelle Größenverhältnis führt zu erheblichen Zellverformung aber minimale Verstopfung. Bei einem Zelltyp, die zuvor nicht getestet wurde, ist es ratsam, eine Reihe von Verengung Breiten von ~ 30-50% Design der Zelldurchmesser, um die optimale Breite zu finden. Wie bei vielen Arten von mikrofluidischen Geräten können über 120 Gerätestammformen auf einer Sünde strukturiert werdenGLE 4 Zoll Silicium-Wafer, wodurch ein Array von unterschiedlichen Geräteausführungen in einem einzigen Herstellungsprozess hergestellt werden.
  2. Wählen Sie die Kanalhöhe zumindest 50% der Zelldurchmesser ist; Dies gewährleistet die Zelle in 2 Dimensionen beschränkt. Um die Kanal Zusammenbruch während der Bindung zu verhindern, stellen Sie sicher, dass die Kanalseitenverhältnis ist nicht weniger als 1:10 (Höhe: Breite) in der gesamten Gerät. Für die Kanäle, die dieses Seitenverhältnis überschreiten darf, fügen Stützpfosten, um einen Zusammenbruch zu verhindern. Raumtragpfosten in einem Abstand, der mindestens das Zweifache der Zelldurchmesser, um Zellstrom nicht behindert wird.
  3. Einen Filter in den Eintrittsöffnungen, um Schmutz zu entfernen und zu zerlegen Zellhaufen (Abbildung 1B). Anpassen der Größe und der Abstand der Filterstellen, so dass der Abstand zwischen den Stellen ungefähr gleich einem Zellendurchmesser ist.
    HINWEIS: Die untere Grenze der Strukturgröße ist durch die Auflösung, mit der die Lithographiemaske gedruckt eingestellt. Stellen Sie sicher, dass alle Funktionen innerhalb der reslösung Grenze durch die Maske Lieferanten festgelegt.

2. Lieferungen und Vorbereitung

HINWEIS: Vor Beginn der Versuch, müssen die folgenden Punkte vorbereitet werden. Eine schematische Darstellung der gesamten Konfiguration ist in Abbildung 1 dargestellt.

  1. Herstellung der Gerätestamm Verwendung von Standardtechniken für lithographische Mikro 14,15. Überprüfen Sie, ob die Höhe der strukturierten Merkmale mit einem Profilometer.
    HINWEIS: Bei Master können leicht in einem Reinraum-Anlage hergestellt werden, haben einige Labors kostengünstig Lithografieverfahren zur Verwendung in einem Halb sauberen Umgebung entwickelten 16,17.
  2. Bereiten Sie die Luftquelle für druckgetriebene Strömung mit einem Druckluftbehälter und die Abfolge der Luftregler und Armaturen (1A).
    1. Einrichtung einer Luftversorgungstank und Handregler.
      ANMERKUNG: Eine Zusammensetzung von 5% CO 2 in Luft unterhält eine ähnliche Umgebung wie ein typischer Zellkultur incubator, aber auch andere Gasgemische können ebenfalls verwendet werden.
    2. Einrichtung eines elektronisch gesteuerten Druckregler in-line mit dem Handregler. Verwenden einen elektropneumatischen Wandler zu regeln und eine stabile Druckabfall über den Kanal, mit Druckschwankungen von weniger als 2 kPa. Verwenden Sie den einfachen Code in LabVIEW geschrieben (Ergänzende Informationen) zur Eingabe der gewünschten Druck.
      HINWEIS: Der elektropneumatische Wandler verwendet eine interne Rückkopplungsschleife, um den Ventilausgangsdruck auf den vorgegebenen Druck in der mikrofluidischen Vorrichtung anpassen.
    3. Einrichten einer Druckkammer, um eine Strömung der Zellsuspension zu fahren. Zusammenstellung eines Zellsuspensionskammer von einer Standard-Durchflusszytometer Rohr und einem maschinell bearbeiteten Kappe, die eine druckdichte Abdichtung an dem Rohr erzeugt.
      HINWEIS: Die Druckkammer Kappe enthält zwei Öffnungen: einen Einlass, der mit dem Druckluftbehälter verbunden ist, und einen Auslass, durch die Zellen fließt aus der Druckkammer in der Vorrichtung (Figure 2).
  3. Einrichten eines umgekehrten Mikroskop mit einer Kamera, die eine Erfassungsrate von mindestens 100 Bilder pro Sekunde, um Bilder von den Zellen durch die Verengung Array fließenden einzufangen ausgestattet. Schnittstelle wird die Kamera mit einem Video-Capture-Karte und einem Computer.
  4. Wird eine Stammlösung des oberflächenaktiven Mittels 10% w / w Pluronic F-127 in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), wie die Zugabe einer geringen Menge an F127 zu dem Zellmedium Lösung wird zur Zelladhäsion an PDMS Wände minimieren. Um die F127-Lösung, Vortex und Wärme schonend bei 37 ° C vorbereiten, die F127 aufzulösen. Vor verwenden, übergeben Sie die Lösung durch einen 0,2 um Spritzenfilter und bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die Tensid-Lösung im Voraus als Vortex und Filter wird Blasen, die für mehr als 24 Stunden anhalten wird zu generieren.

3. Mikrofluidik-Geräte-Fertigung

  1. Herzustellen PDMS-Block mit mikrofluidischen Kanälen.
    1. Mix PDMS gründlich einTA-Verhältnis von 1:10 (w / w) Härter zur Basis.
    2. Gießen Sie die Mischung über die Gerätestamm (Schritt 2.1). Degas in einer Glasglocke mit angelegtem Vakuum, bis die eingeschlossenen Blasen verschwinden, oder für ca. 10-20 min.
      HINWEIS: Nach dieser Zeit kann es immer noch Blasen an der Luft-PDMS-Schnittstelle, die normal zu sein; diese werden in der Regel während des Backens zu zerstreuen. Es ist sehr wichtig, sicherzustellen, daß es keine verbleibenden Blasen benachbart zu den Kanälen.
    3. Backen das entgaste Gerät bei 65 ° C für 4 h. Um die Kanäle vor dem Kollaps zu verhindern, backen Sie das Gerät über Nacht zur weiteren Vernetzung der PDMS für ein Gerät mit einem höheren Elastizitätsmodul, die resistenter gegen Kanal-Zusammenbruch ist. Jedoch beachten, dass Back erweitert versprödet auch die PDMS und kann zu Rissbildung beim Stanzen Löcher (Schritt 3.3) führen.
  2. Mikrofluidik-Geräte zu entfernen aus der Urform. Schneiden einzelnen mikrofluidischen Bauteilen aus der PDMS-Block mit einer Rasierklinge und entfernen Sie das Gerät aus der Mastäh. Starten Sie durch leichtes Anheben aus einer Ecke des Geräts; langsam und sanftes Peeling, im Gegensatz zu Aufhebung der PDMS-Block gerade nach oben, reduziert die Belastung auf beiden PDMS und den Master.
  3. Stanzlöcher in der PDMS-Gerät an Anschluss-Ports für den Zugriff zwischen Schlauch und Mikrokanäle erstellen. Erstellen Löcher mit einem Stanzbiopsie, und stanzen von der Kanalseite durch an der Außenseite der Vorrichtung.
    HINWEIS: Eine Biopsie Punch mit einer 0,75 mm Bohrung schafft Löcher, die Schnittstelle perfekt mit Polyetheretherketon (PEEK)-Schlauch (Außendurchmesser = 1/32 "oder 0,79 mm) oder Polyethylenschlauch (PE-20, Außendurchmesser = 0,043" oder 1,09 mm ). Verwenden Sie einen Ringlicht zu helfen, zu visualisieren Löcher in Geräten mit flachen Kanälen 18. Seien Sie sicher, dass die Biopsie Punch ist scharf; nach wiederholter Anwendung die Schnittkante abstumpft und die Biopsie Punch sollten entsorgt und ersetzt werden.
  4. Spülen Sie die PDMS-Gerät mit Isopropanol (HPLC-Qualität), um Staub und Brocken eingereicht von PDMS zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass diegestanzten Löcher sind frei von Fremdkörpern, indem ein stetiger Strom von reinem Isopropanol aus einer Spritzflasche durch die Löcher. Föhnen mit gefilterter Luft. Nach der Reinigung Ort PDMS-Blöcke mit Kanälen nach oben in eine saubere Petrischale auf Sauberkeit Gerät zu erhalten. Falls erforderlich, speichern Geräte in dieser Form bis Bindung.
  5. Reinigen Sie das Glassubstrat durch Spülen mit Methanol (HPLC-Qualität), föhnen mit gefilterter Luft, und auf eine 200 ° C Warmhalteplatte für 5-10 min, um sicherzustellen, das Glas ist absolut sauber und trocken vor der Plasmabehandlung.
    HINWEIS: Das Glassubstrat der Boden jeder Kanal bildet. Typischerweise ein Glasobjektträger genügt, da ein 10X oder 20X Ziel ist ideal zur Abbildung mehrere Kanäle parallel. Für eine höhere Auflösung Bildgebung, verbinden Sie das Gerät an einem Deckglas (# 1.5 Dicke).
  6. Verbinden die PDMS-Gerät auf das Glassubstrat.
    1. Sauerstoffplasma-Behandlung der Kanalseite der PDMS-Block und 1 Seite eines Glasobjektträgers.
      HINWEIS: Wit einem Handabgabeeinheit, mit einem Behandlungszeit von 1 min, aber die Optimierung der Behandlungszeit für jedes Sauerstoff-Plasma-Vorrichtung.
    2. Platzieren der Kanalseite der PDMS auf der behandelten Seite der Glas unmittelbar nach der Behandlung.
    3. Halten Sie durch leichten Druck zusammen für ~ 10 Sekunden, um die Bindung zu fördern. Bake der gesamten Vorrichtung bei einer erhöhten Temperatur (60-80 ° C) für mindestens 15 min auf Haftfestigkeit zu verbessern.

4. Verformen Zellen durch verengte Kanäle

  1. Überprüfen Sie die Mikrofluidik-Vorrichtung unter dem Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Kanäle nicht zusammengebrochen oder gebrochen ist und dass beide Einlass und Auslass Löcher sind direkt in die Gerätekanäle durch die Verwendung eines Low-Power-Objektiv (10-fach). Bestimmen Sie defekte Geräte, indem man die Oberfläche der PDMS mit einer Rasierklinge und für Experimente nutzen sie nicht.
  2. Vorbereitung der Zellkulturproben, die untersucht werden. Kulturzellen unter Standardbedingungen.
    1. Foder beispielsweise Kultur HL-60-Zellen in RPMI-1640-Medium mit 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung und 10% fötalem Rinderserum und 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C ergänzt.
    2. Für adhärenten Zellen, ernten sie durch Trypsinierung und resuspendieren in frischem Wachstumsmedium. Verwenden Sie ein Standard-Protokoll Trypsinierung; zum Beispiel, fügen ~ 0,5 ml Trypsin in einen Kolben mit 25 cm 2 Kulturbereich und resuspendieren in ~ 30 ml frischem Medium. Unterscheiden HL-60-Zellen in neutrophile Typ-Zellen von all-trans-Retinsäure (ATRA) in einer Endkonzentration von 5 uM pro 1 x 10 5 Zellen / ml, wie zuvor beschrieben 19,20.
    3. Zentrifugation der Zellen bei 300 × g für 3 min, sorgfältig den Überstand aspirieren und resuspendieren Zellen an die entsprechende endgültige Dichte in frischem Kulturmedium mit 0,1% v / v F-127.
  3. Zählen Sie die Zellen mit einem Coulter Counter, Hämazytometer oder Durchflusszytometer. Einstellen der Zellsuspension in einer Dichte von 1 × 10 6 bis 5 × 10 6 Zellen / ml. Sobald die Suspensionsdichte festgelegt ist, zu ergänzen, mit rund 0,1% v / v F-127.
    HINWEIS: Die Zelldichte und der Tensidkonzentration muss je nach den besonderen Zellsysteme modifiziert werden; Tabelle 1 stellt eine Aufzeichnung der zuvor verwendeten Konzentrationen an Zellen und F-127 für unterschiedliche Zelltypen.
  4. Zeigen Zellsuspension in einem Durchflusszytometer Rohr und an der Druckkappe. Vor dem Anschluss der Schläuche an die Mikrofluidik-Vorrichtung, bis die Zellsuspension ergibt sich aus der Spitze der Schläuche den Druck auf ungefähr 14-21 kPa und bündig. Dies wird helfen, um Luftblasen in dem Schlauch und der Vorrichtung zu minimieren.
  5. Führen Sie die Spitze des Schlauches, die die Zellsuspension in das Gerät Einlass. Wenn das Gerät mit einem Deckglas geklebt, stellen Sie das Gerät auf einer ebenen, festen Oberfläche wie dem Mikroskoptisch, bevor Sie den Schlauch; das Deckglas ist zerbrechlich und kann sonst brechen.
  6. Legen Sie ein Stück Schlauch into der Ausgangsöffnung und Route in ein Leerrohr für Abfallsammel zB eine leere Falcon-Röhrchen auf der Seite des Mikroskoptisch geklebt. Konsistenz der Gesamtströmungswiderstand der Vorrichtung zwischen den Experimenten, dass der Einlass und der Auslass Schlauch ist mit dem gleichen Durchmesser und etwa die gleiche Länge für jedes Experiment.
  7. Sanft Rampe den Druck auf etwa 28 kPa oder bis die Zellen durch die Kanäle fließen. Positionieren der Vorrichtung, so daß mehrere Kanäle in dem Sichtfeld und sind senkrecht zur Unterseite des Bildschirms. Wenn die Kamera durch Datengröße beschränkt ist, erwerben mehrere Videos, eine ausreichende Anzahl unabhängiger Datenpunkte zu erzeugen. Passen Sie die Bildrate für die gewünschten Datenausgabe wie nötig. Um Änderungen in der Zellform zu erfassen, verwenden Hochgeschwindigkeits-Imaging bei 300 Bildern pro Sekunde (fps); zu Laufzeiten von Zellen zu messen, verwenden Bildraten von etwa 100 fps.

5. Datenanalyse

  1. Öffnen Sie die Datei Master_script.m (Herunterladbare Zusatz Datei) und starten Sie das Programm.
  2. Wählen Sie das erste Video aus dem Windows-Explorer-Fenster, das angezeigt wird analysiert werden. Geben Sie die Framerate für das ausgewählte Video und drücken Sie die Eingabetaste.
    HINWEIS: Eine Figur wird angezeigt, dass der Benutzer aufgefordert, eine rechteckige Fenster Zuschneiden für das erste Video zu wählen.
  3. Auswählen eines Fensters, das alle Kanäle von links nach rechts schneidet, umfasst und die Kanäle nur über den ersten Kolben der Anordnung von Kanälen an der Oberseite und Unterseite (3).
  4. Wählen Sie die Regionen aus der Verengung zugeschnittene Bild. Achten Sie besonders auf eine feste Pixelabstand zwischen den oberen und unteren Fensterrand für jedes Video eingestellt zu halten.
    HINWEIS: Die obere Fensterkante gibt die oberste Verengung und unteren Fensterrand gibt die unterste Einschnürung (Abbildung 4); Zwischen Einschnürungen sind von dieser Benutzereingaben angenähert. Als nächstes zeigt die s der Algorithmusegmentation von Zellen für die ersten 50 Rahmen jedes Video (Bild 5).
  5. Überwachen die linke obere Bild (5A) eng zu bestimmen, ob der Algorithmus genauen Lokalisieren Zellen; eine binarisierten Bild auf der Videoquelle überlagert, um die Position der identifizierten Zellen zu demonstrieren.
    HINWEIS: Die verschiedenen Fenster, (5B-5D) sind für die Code-Diagnose und zeigen die Videobilder nach bestimmten Bildverarbeitungsoperationen.
  6. Wählen Sie das nächste Video aus dem Windows-Explorer-Fenster bearbeitet werden.
    HINWEIS: Der Algorithmus Wiederholen Sie die Schritte 5,2-5,5 für jedes Video ausgewählt.
  7. Wählen Sie Abbrechen, wenn alle gewünschten Videos haben über die Windows-Explorer-Fenster hinzugefügt, um die Funktion, die die Video-Liste vollständig ist weisen.
    HINWEIS: Der Algorithmus wird die restlichen Operationen ohne Benutzereingriff durchführen. Dies wird etwa 1-2 Stunden dauern, abhängig von der Anzahl der Videos bearbeitet und Computer performance. Nach der Fertigstellung wird der Algorithmus ein Histogramm der Laufzeit-Daten zu erzeugen und speichern Sie die Daten im Verzeichnis als MATLAB .mat Datei und einer Microsoft Excel XLS-Datei.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um die Verformbarkeit der verschiedenen Zelltypen, Menschen myeloischen Leukämie-Zellen (HL-60), differenziert neutrophilen Zellen, Maus-Lymphozyten-Zellen und menschlichen Eierstockkrebszelllinien (OVCAR8, HEYA8) untersuchen werden mit der "Handy-Deformer" Mikrofluidik-Technik ausgewertet. Repräsentative Ergebnisse für die Laufzeit des HL-60 und Neutrophilen-Typ HL-60-Zellen zeigen den Zeitplan für eine einzelne Zelle dazu, durch eine Reihe von Engstellen, wie in Abbildung 6 dargestellt. Laufzeit ist f...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier bieten wir eine umfassende experimentelle Verfahren zur Analyse der Verformung von Zellen im Transit durch schnürt mikrofluidischen Kanälen mit druckgetriebenen Strömung. Ein MATLAB-Skript ermöglicht die automatisierte Datenverarbeitung (ergänzendes Material); eine aktualisierte Version des Codes eingehalten wird ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Im weiteren Sinne können die hier vorgestellten Techniken in vielen Zellbasis mikrofluidischen Tests angep...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren bedanken sich bei Lloyd Ung für konstruktiven Input in frühen Versionen dieser Technik anerkennen, Dr. Jeremy Agresti für Druckdeckel Design-Tipps und Dr. Dongping Qi für seine Hilfe bei der Herstellung der Druckkappe. Wir sind dankbar, dass die Labors von M. und P. Teitell Gunaratne für die Bereitstellung einer Vielzahl von Zellproben zum Testen. Wir danken der National Science Foundation (Career Award DBI-1254185), der UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center und der UCLA klinische und translationale Wissenschaft Institut für die Unterstützung dieser Arbeit.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Pluronisches F-127 Block-Copolymer-Tensid Fisher Wissenschaftlich 8409400Hergestellt von BASF, auch über Sigma
PDMS erhältlich Basis- und VernetzerEssex BrownellDC-184-1.1Produkt, das allgemein als Sylgard 184 Elastomer
Oxygen Plasma Discharge Unitwird EnerconDyne-A-Mite 3D Treater
Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0,75 mm)Ted Pella, Inc.15072
Fingertight Ferrule, 1/32"Upchurch ScientificUP-F-113
Fingertight III Verschraubung, 10-32Upchurch ScientificUP-F-300X
Polyetheretherketon (PEEK) Schlauch, Außendurchmesser = 1/32" oder 0,79 mmValcoTPK.515-25M
Polyethylen (PE-20) Schlauch, 0,043" oder 1,09 mmBecton Dickinson 427406
DruckreglerAirgas oder Praxair
Polyurethan-Schlauch, 5/32" ODMcMaster Carr5648K284
SteckverschraubungenMcMaster Carr5111K91
Elektropneumatischer Spannungs-Druck-Wandler OmegaIP413-020
16 Bit, 250 kS/S, 80 Analogeingänge Multifunktions-DatenerfassungNational InstrumentsNI PCI 6225-779295-01
Analogsteckverbinder Block-SchraubklemmeNational InstrumentsSCB-68-776844-01
LabView-Systemdesign-SoftwareNational Instruments
MATLAB-SoftwareThe MathWorks, Inc.Für den MATLAB R2012a-Codeist die Image Processing Toolbox
ShieldedCable von National InstrumentsSHC68-68
bezeichnet erforderlich.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
  2. Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
  3. Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
  4. Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
  5. Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
  6. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
  7. Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174(2011).
  8. Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560(2012).
  9. Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275(2013).
  10. Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
  11. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
  12. Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
  13. Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
  14. Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
  15. Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
  16. Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
  17. Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
  18. Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
  19. Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
  20. Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
  21. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
  22. Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
  23. Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
  24. Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
  25. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
  26. Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
  27. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic DeviceCell DeformabilityPressure Driven FlowMicron Scale ConstrictionsAutomated Image AnalysisHL 60 CellsTransit Time MeasurementPDMS FabricationFlow Cytometry TubeInverted Microscope

Related Articles