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Summary

Es wird ein Verfahren mit visuellen Begleitung für die Durchführung von skalierbaren, Hochdurchsatz-Auswahl aus Phagendisplaykombi synthetische Antikörperbibliotheken gegen Hunderte von Antigenen gleichzeitig beschrieben. Mit dieser parallelen Ansatz haben wir Antikörperfragmente, die eine hohe Affinität und Spezifität für verschiedene Antigene, die in Funktionsstandard Immunoassays weisen isoliert.

Abstract

Die Nachfrage nach Antikörpern, die den Bedürfnissen von Grundlagen- und klinischer Forschung Anwendungen zu erfüllen ist hoch und wird sich dramatisch in der Zukunft zu erhöhen. Es ist jedoch offensichtlich, dass herkömmliche monoklonale Techniken nicht allein bis zu dieser Aufgabe. Dies hat zu der Entwicklung von alternativen Verfahren führte zu der Forderung nach hoher Qualität und erneuerbarer Affinitätsreagenzien an alle zugänglichen Elemente des Proteoms befriedigen. Zu diesem Zweck sind Hochdurchsatzverfahren zur Durchführung von Auswahlen aus Phagendisplay-Bibliotheken synthetischer Antikörper für Anwendungen mit unterschiedlichen Antigenen entwickelt worden und zur schnellen Durchsatz und erfolgreich optimiert. Hierin wird ein Protokoll im Detail, die mit Video-Demonstration zeigt die parallel Auswahl Fab-Phagenklone aus hohe Diversität Bibliotheken gegen Hunderte von Ziele entweder mit einem manuellen 96-Kanal Liquid Handler oder automatisierten Robotersystem beschrieben. Unter Verwendung dieses Protokolls kann ein einzelner Benutzer Hunderte von Antigenen zu erzeugen,Wählen Antikörper, um sie parallel und zu validieren Antikörperbindung in 6-8 Wochen. Hervorgehoben sind: i) eine tragfähige Antigen-Format, ii) Vorauswahl Antigen Charakterisierung, iii) wichtige Schritte, die die Auswahl von spezifischen und hohen Affinität Klone beeinflussen und iv) Formen der Überwachung Auswahl Wirksamkeit und frühzeitig Antikörperklon Charakterisierung. Mit dieser Vorgehensweise haben wir synthetische Antikörperfragmenten (Fabs), viele Zielklassen einschließlich Single-Pass-Membranrezeptoren, sekretierte Proteinhormone und Multi-Domain intrazellulären Proteinen erhalten. Diese Fragmente werden leicht an Volllängen-Antikörpern umgesetzt und validiert worden sind, um eine hohe Affinität und Spezifität aufweisen. Ferner wurden sie nachgewiesen funktionellen in einer Vielzahl von Standard-Immunoassays, einschließlich Western-Blotting, ELISA, zelluläre Immunfluoreszenz, Immunpräzipitation und ähnliche Assays sein. Diese Methodik wird Antikörper Entdeckung zu beschleunigen und letztlich bringen uns näher an die Verwirklichung des Ziels of Erzeugung erneuerbarer, hochwertige Antikörper gegen das Proteom.

Introduction

Mit dem Beginn der Post-Genom-Zeitalter, ist die Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Bindungsreagenzien zur Charakterisierung und zu modulieren Proteine ​​wichtig, neue Forschung und therapeutische Wege eröffnen. Antikörper weiterhin entscheidend für die akademische und industrielle Forscher als Grundlagenforschung und Diagnose- und potenziellen Therapeutika zu sein. Es überrascht nicht, hat es eine beeindruckende Wachstum der Vertrags Antikörper-Entwicklung von Unternehmen, von denen die meisten verlassen sich auf herkömmliche Hybridom-Technologien, um kundenspezifische Antikörper zu erzeugen. Dennoch In-vitro-Selektion unter Verwendung von Phagen präsentierten Antikörperbibliotheken ist immer eine leistungsstarke Alternative Technologie, die einzigartige Vorteile und Erfolg in dem herkömmlichen Technologien kann Einschränkungen ^{1, 2} gegenüber anbieten können.

Angesichts der erheblichen Nachfrage nach qualitativ hochwertigen Antikörpern als Forschungswerkzeuge, zwei zentralen Herausforderungen für die Erzeugung erneuerbarer Antikörper 1) Auswahl Durchsatz und 2) Antigen availability. Einige Gruppen haben nun in vitro Selektionsleitungen auf der Durchsatz erhöht und die Rate der Antikörperidentifizierung gerichtet beschrieben. Diese Beschreibungen detailliert eine Vielzahl von lebensfähigen Ansätzen, die entweder auf voller Länge der Auswahl gehören zielt ^3,4 oder strukturell verwandte Domänen ^5,6,7, entweder mit Wulst-basierten ^6,8 oder plattenbasierte ^3,4 Antigen Immobilisierung Systeme. Darüber hinaus hat die zunehmende Verbreitung der Gensynthese Technologien ⁹ systematische Antigen Generation, insbesondere aus isolierten Domänen, einigermaßen kostengünstig und können die Schwierigkeiten bei der Beschaffung ausreichender Mengen an gereinigtem, in voller Länge Antigen möglicherweise lindern. Durch die Verwendung der beiden Techniken in Tandem, wurde eine in sich geschlossene und skalierbare Antigenerzeugung und Antikörperselektion Pipeline erarbeitet, die die parallele Isolierung von Antikörpern für große Mengen an exprimiertem Antigen Domänen ermöglichen und erleichtern die Entwicklung von Reagenzien für cha würderacterizing ganze Klassen strukturell oder funktionell verwandten Proteinen.

Zu diesem Ziel, eine integrierte Rohrleitung, die Paare in silico Identifizierung exprimierbaren Antigendomänen, Gensynthese, Hochdurchsatz-bakterielle Expression von Antigenen und skalierbare Phagen präsentierten Antikörper Selektionen wurde entwickelt. Diese Pipeline benötigt nur grundlegende Infrastruktur für die meisten Life-Science-Labors (einschließlich Antikörperbibliotheken, die durch Lizenz oder Materialübertragungsvereinbarung immer zur Verfügung stehen), sondern eignet sich auch für den Einsatz im industriellen Maßstab Automatisierung. Unter Verwendung dieses Protokolls ist es möglich, Hunderte von affinitätsmarkierten Antigen-Domänen zu erzeugen, und routinemäßig an viele dieser Antigene zu isolieren, hochspezifische Antikörperfragmente.

Phagen-Display-Technologie hat gezeigt, die Kompatibilität mit einer Vielzahl von rekombinanten Affinitätsreagens Formate einschließlich Fab, scFv, Fv und autonomen Domänen und eine gezeigtenwachsende Zahl von kleinen "alternativen Frameworks" (entworfen Ankyrin Repeat Proteine ​​(DARPins), Fibronektin (Fn), Lipocalin Domains und ^10). Diskussion In diesem Beispiel wird die Isolierung von Fab-Antikörperfragmente beschränkt, obwohl angenommen wird, können diese Verfahren auf andere Arten von Bibliotheken angepasst werden. Mit Hilfe dieser Technologie Fabs mit niedrigen nanomolaren Affinität zu kleinen, markierten Proteindomänen mit Transkriptionsfaktor-Domänen, SH2-Domänen, RNA-bindende Proteine ​​und andere haben erfolgreich ausgewählt, von denen viele zu binden Protein voller Länge und sind funktional in Immunoassays, wie Immunfluoreszenz , Immunpräzipitation und Immunhistochemie. Wichtig ist, dass rekombinantes Bindungs ​​Klone vollständig erneuerbaren und kann von Ausdruck neu generiert werden konstruiert durch bakterielle Produktionsangebot erhöhte Konsistenz, Reproduzierbarkeit und Wirtschaftlichkeit, so dass die Kosten der strengen Klon Überprüfung rechtfertigen.

In diesem Protocol und dazugehörige Video, werden grundlegende Methoden zur Antikörperselektion von Phagen präsentierten Bibliothek unter Verwendung von immobilisiertem Antigen Domänen demonstriert. Dieses besondere Verfahren verwendet mit GST markierten Proteindomänen durch passive Adsorption in Mikrotiterplatten immobilisiert, obwohl auch andere Tags ^11,12,13 und Selektionsformate ^13,14,2 wurden ebenfalls erfolgreich verwendet. Kritische Überlegungen für die Einrichtung und Durchführung von Selektionen mit paralleler Überwachung der Auswahlparameter zu identifizieren und zu isolieren speziell angereicherten klonalen Antikörpern für die Validierung gerichtet sind detailliert.

Protocol

1. Antigen-Generation

HINWEIS: Antigen-Domänen synthetisiert und durch eine Vielzahl von kommerziellen Anbietern in einen geeigneten IPTG-induzierbare Expressionskonstrukt kloniert werden.

1. Transform-Expressionskonstrukte in chemisch kompetente, T1-Phagen resistent, BL21 E. coli-Zellen hergestellt, indem 10 ng von DNA in 20 ul 1X KCM auf Eis kodiert in einer 96-Well-PCR-Platte, gefolgt von der Zugabe von 20 l chemisch kompetente Zellen.
2. Inkubieren der Zell / DNA-Mischung auf Eis für 20 min, bei RT für 10 min und dann auf Eis erneut 2 min vor der Rettung mit 100 ul vorgewärmtem SOB-Medium mit Glukose (SOC) Medien, Abdecken mit einer atmungsaktiven Plattendichtung und Schütteln bei 37 ° C für 1 h bei 200 rpm in einem 2,5 cm Orbitalschüttler.
3. Platte 5 ul von transformierten Zellen auf Luria-Bertani (LB) / Agarplatten, ergänzt mit Carbenicillin (100 g / ml) und wachsen O / N, um einzelne Kolonien zu erhalten, verwendetErzeugung von Glycerin Aktien.
4. Impfen Sie 1 ml 2YT / carb Medien mit 5 ul Glycerin Lager und wachsen 12 Stunden bei 37 ° C in einer 96-Well Tiefbrunnen Block unter Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute in einem 2,5 cm Orbitalschüttler.
5. Inokulieren NZY media15 (ergänzt mit 0,05% Glucose, 2% Lactose, und 100 g / ml Carbenicillin) mit einer Verdünnung von 1:40 dieser Kultur, schüttelt dann für 6-8 Stunden bei 30 ° C und 200 rpm in einem 2,5 cm Orbital Shaker.
6. Pellet Bakterien und reinige antigenen Proteinen in Hochdurchsatz in einer 96-Well-Filterplatte, die 100 & mgr; l Ni NTA-Harz nach vorveröffentlichten protocols16,17.
7. Man bestimmt die Konzentration der gereinigten Proteine ​​mittels Bradford-Farbstoff-Bindungs ​​assay18 und Charakterisierung für die Größe und Reinheit durch Trennung und Visualisierung von 10-50 & mgr; g mit Coomassie-Färbung auf einem SDS-PAGE-Gel (siehe Abbildung 2).
   HINWEIS: In dieser Phase-Proteine ​​können weiter charakterisiert werden durch Methoden, die Proteinaggregation ¹⁹ bewerten </sauf> oder Falten ²⁰ in Abhängigkeit von der Natur des Antigens und den Anforderungen des Selektions Pipeline.

2. Vorbereitung und Titration der Phagen-Bibliothek

1. Wählen Sie eine Einzelkolonie von T1-Phagen-resistenten E. coli-Zellen in 1 ml 2YT-Medium mit 50 ug / ml Tetracyclin versetzt.
2. Nachdem das Zellwachstum wird visuell festgestellt, verdünnte die Kultur in einem größeren Volumen 2YT mit 50 ug / ml Tetracyclin ergänzt, um eine ausreichende Menge von Zellen für eine Infektion zu gewährleisten (im Allgemeinen 45 & mgr; l pro Bibliothek Verdünnung, siehe unten.).
3. Vorbereitung der Bibliothek für die Verwendung durch Ausfällung des Phagen aus dem Speicher-Puffer mit 1 / 5. Band autoklavierter 20% PEG-8000, 2,5 M NaCl (PEG-NaCl) Inkubieren auf Eis für 30 min und Pelletierung fällten Phagen durch Zentrifugation bei 12000 x g.
4. Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren fällt Phagen in einem geeigneten Volumen 1x PBS, pH 7,4, 0,2% BSA und 0,05% Tween (PBT), Einstellen to eine geeignete Phagen-Konzentration für Auswahlen (falls erforderlich), um eine ausreichende Abdeckung sicherzustellen Bibliothek. Siehe Schritt 2.9 und Diskussion.
5. Verdünnen Sie eine 5 ul Phagen Aliquot in 45 ul 1x PBS, pH 7,4, in eine sterile Multiwellplatte, mischen, und eine Reihe von 10-fachen Verdünnungen im gleichen Puffer.
6. Mit 5 ul jeder Phagenverdünnung auf 45 ul T1-Phagen-resistenten E. coli-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase (OD ₆₀₀ = 0,4-0,8) in einem anderen Multiwellplatte, Deckel mit einem atmungsaktiven Dichtung und bei 37 ° C unter Schütteln bei 200 Upm für 30 min in eine 2,5 cm Orbitalschüttler.
7. Platte 5 ul infizierte Zellen aus jeder der Vertiefungen auf ein vorgewärmtes Agarplatte mit 100 g / ml Carbenicillin ergänzt und wachsen O / N bei 37 ° C bis Kolonien sichtbar sind.
8. Berechne den Phagen / ml wie folgt:
   Phagen / ml = Anzahl der Kolonien auf Carbenicillin-Platte in der meisten verdünnten Probe x 200 x 10 ⁱ (wobei i = die maximale numzahl der Verdünnungen in dem Kolonien offensichtlich).
9. Um die Anzahl der beschichteten Antigenvertiefungen zu bestimmen, die Versorgung der Bibliothek Vielfalt zu gewährleisten, wie folgt zu berechnen:
   Zahl der beschichteten Antigenvertiefungen erforderlich =
   Wunsch fachen Abdeckung * Bibliothek Vielfalt
   # Von Phagen pro 100 ul

3. Antikörperauswahl von Phagen-Bibliotheken angezeigt

3.1) Antigen Immobilisierung

1. Zum Einfrieren und Auftauen, die Antigen Qualität beeinträchtigen können und Verdünnungen zu erleichtern, wird eine Stammantigenprotein Platte normiert auf 100x Arbeitskonzentrationen (zB 500 g / ml) und Aliquots in der unverbindlichen 96-Well-Platten zu vermeiden.
2. Bereiten Antigen-beschichteten Platten ab Lager Proteinlösungen einen Tag vor jeder Auswahlrunde durch Verdünnung ab Lager Platten mit PBS.
3. Mantel 96 Vertiefungen hohen Proteinbindungs ​​Polystyrol-Platten mit 100 & mgr; l GST-tagged-Antigen-Protein oder negative Kontrolle protein (GST, BSA, Neutravidin, etc.) bei 5 ug / ml in PBS. Schütteln bei 250 Upm 4 ° CO / N auf einem Schüttler.
4. Entfernen Proteinlösung von dem beschichteten Mikrotiterplatten, blockieren die Antigen-beschichteten und negativen Selektionsplatten mit 200 ul Blockierungspuffer (0,2% BSA in 1x PBS, pH 7,4) hinzugefügt und bei 250 Upm bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden.
5. Nach dem Blockieren waschen Sie die blockiert Protein-beschichteten Platten viermal mit 200 ul 1x PBS pH 7,4 mit 0,05% Tween (PT) Puffer entweder manuell oder mit Hilfe eines automatisierten Mikrotiterplatten-Waschgerät.

3.2) Bibliothek Pre-Clearance und Antigen-Phagen-Inkubation

1. Abbau der Bibliothek von nicht- (oder tag-) spezifische Bindungs ​​Phagen präsentierten Antikörperfragment-Klonen durch Übertragung von 100 ul (10 ¹² Phagen) präparierte Phagenbibliothek in PBT-Puffer zu einer Anzahl von Vertiefungen mit negativen Kontrollprotein oder freien Affinitätsmarker beschichtet Protein (zB GST) äquivalent zu der Anzahl von Zielen und inkubieren Phagenin Vertiefungen für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur mit Schütteln bei 250 UpM.
   HINWEIS: Als eine alternative oder zusätzliche Mittel zur negativen Selektion Inkubation kann auch in Gegenwart eines Überschusses (5-25 uM) lösliche Proteinaffinitätsmarkierung (zB GST) durchgeführt, um weiter zu entfernen Tag-bindenden Klonen und ihre Verwertung bestimmter Ziel werden bindenden Klonen.
2. Überphagenüberstand von negativen Selektion Antigen-beschichteten Platten und Inkubation für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 250 Upm für die Erfassung der spezifischen Bindung Klone.
3. Entfernen ungebundenen Phagen und waschen Vertiefungen der Mikroplatte 8-15 mal mit PT-Puffer entweder manuell oder mit Hilfe eines Mikroplatten-Washer. Überschüssigen Waschpuffer nur vor der Elution.

3.3) Elution, Infektion und Phagenamplifikation

1. Früh am Tag der Auswahl, wählen Sie eine Einzelkolonie von T1-Phagen-resistenten E. coli-Zellen in 1 ml 2YT-Medium mit 50 ug / ml Tetracyclin versetzt und wachsen bei 37 ° C with Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute in einem 2,5 cm Orbitalschüttler oder gleichwertige.
2. Sobald das Zellwachstum wird aufgebaut und mit dem Auge zu erkennen ist, wird die Lautstärke von Medien mit 2YT ergänzt mit 50 ug / ml Tetracyclin, ein ausreichendes Volumen von Zellen für eine Infektion (in der Regel 100 ul pro Auswahl gut) zu gewährleisten.
3. Wachsen die Zellen bis zu einer _OD600 von 0,4-0,8 erreicht ist (ca. 5-7 h), dann zu eluieren gebundenen Phagen werden 100 ul Zellen zu der gewaschenen Antigen Platte und Schütteln bei 37 ° C für 30 min.
4. Hinzufügen M13K07-Helferphagen zu einer Endkonzentration von 1 x ¹⁰ 10 KBE / ml und bei 37 ° C für 45 Minuten mit Schütteln bei 200 Upm.
5. Übertragungszellen von 1,2 ml 2YT mit 150 ug / ml Carbenicillin und 75 & mgr; g / ml Kanamycin in einer 96er Deepschachtblock mit V-Boden und wachsen O / N bei 37 ° C unter Schütteln bei 200 rpm in einem 2,5 cm Orbitalschüttler.

3.4) Phage Vorbereitung und wiederholte Runden von Selection

1. Pellet Bakterien durch Zentrifugation bei 4.000 xg für 15 min bei 4 ° C.
2. Mischen Sie gleiche Volumina des Phagen-Überstände von Replikatplatten in einem Mini-Rohr-96-Well-Mikroplatten-sterilen blauen Kasten, neutralisieren mit ^1/10 Volumen von 10X PBT und mischen. Wiederholen Sie die Selektionsrunden (ab Schritt 3.1.1) für 3-4 Runden oder bis Anreicherung beobachtet (siehe Abschnitte 4 und 7) im Vergleich zur Negativkontrolle Protein.
   HINWEIS: In den ersten Runden der Selektion, wenn bedeutende / nachweisbare Anreicherung ist nicht zu erwarten (dh Runden 1 und 2), kann die Quantifizierung von Ein- und Ausgangs Phagen-Titer (in Abbildung 3 gezeigt, Abschnitt 7 und repräsentative Ergebnisse beschrieben) hilfreich, um sein Mindestphagenkonzentrationen für eine erfolgreiche Auswahl (in Diskussion) beschrieben und sind besser geeignet als gepoolte ELISAs.

4. Charakterisierung von Pooled ELISA

1. Coat 96-Loch hohen Protein-Bindunging Polystyrol-Platten mit 100 & mgr; l GST-tagged Antigenprotein oder negativen Kontrollprotein (GST, BSA, Neutravidin etc.) bei 2 & mgr; g / ml nach Abschnitt 3.1 und Schütteln bei 4 ° CO / N.
2. Entfernen überschüssigen Antigen blockieren die Platte mit 200 ul Blockierungspuffer unter Schütteln für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur bei 250 rpm auf einem Schüttler und wäscht viermal mit 200 ul PT Puffer entweder von Hand oder mit automatisierten Plattenwäschers.
3. Apply 100 ul der Phagenüberstand (Verdünnung von 1: 10-1: 20 in PBT-Puffer), schütteln bei 250 Upm für 15 min bei RT, und waschen Sie die Platte achtmal mit 200 ul Puffer PT.
4. 100 l anti-M13-HRP (1: 5000 in PBT-Puffer). Schütteln bei 200 Upm für 30 min bei RT, dann waschen Sie die Platte sechsmal mit 200 & mgr; PT Puffer und zweimal mit je 200 ul PBS.
5. Apply 100 ul von 1: 1 TMB-Substrat und zu entwickeln, für 5-15 Minuten (oder bis eine wesentliche Farbe entwickelt hat), dann stoppen die Reaktion durch Zugabe von 100 ul 1 MH ₃ </sub> PO ₄ und lesen Sie die Platte bei 450 nm.
6. Im Allgemeinen kann die Anreicherung in Phagenpools in Runden 3-4 als ein Verhältnis der spezifischen Bindung im Vergleich zu nicht-spezifische Bindung beobachtet> 2 (siehe 4) werden
   HINWEIS: Es ist zu beachten, dass informative hohe absolute Bindungssignal auf der Affinitätstag Protein anzeigt Anreicherung tag-spezifische Binder (anstatt Ziel Bindemittel), und das hohe absolute Bindungssignal an der negativen Kontrollprotein zeigt Anreicherung unspezifische oder " sticky "Bindemittel.

5. Clone Auswahl, Sequenzierung und Charakterisierung

5.1) Isolierung der Einzel Fab-Phagen-Klone

1. Um einzelne Klone für die Sequenzierung und Charakterisierung zu isolieren, zu infizieren ^1/10 Volumen des verstärkten Phagen-Pool in den T1-Phagen-resistenten E. coli-Zellen im logarithmischen Wachstumsphase (OD ₆₀₀ = 0,4 bis 0,8) in einem Rundboden-Mikrotiterplatte, Deckel mit einem Breathable Plattendichtung und Inkubation unter Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten bei 37 ° C.
2. Bereiten Sie das 10-fache serielle Verdünnungen in 2YT Medien und Platte auf separaten Agarplatten mit 100 g / ml Carbenicillin ergänzt.
3. Wählen Sie einzelne Kolonien in 450 ul 2YT / carb Medien mit 1 x 10 ⁹ M13K07 Phagen / ml ergänzt und wachsen O / N in einem Mini-Rohr-96-Well-Mikroplatten-sterilen blauen Kasten Inkubation bei 37 ° C unter Schütteln bei 200 Upm.
4. Pellet Bakterien durch Zentrifugieren bei 4.000 × g für 10 min bei 4 ° C.
5. Klonalen Phagenüberstand kann für die Sequenzierung von Fab-Phagen-Klone verwendet werden, oder für (wie in Abschnitt 5.4 beschrieben) klonale Direktbindungs ​​ELISAs auf Spezifität gegen immobilisierten Antigenen zu bestimmen (wie in den Abschnitten 5.3 und ²¹ beschrieben), für die repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 5.

5.2) Die Expression des Fab-Klonen zur Charakterisierung

1. Im Anschluss an das Klonen, um eine entsprechende Expression Vektor (siehe Diskussion), nehmen einzelne E. coli-Kolonien mit Ausdruck Konstrukten transformiert, um 1 ml 2YT / Carb-Medien in einer 96-Deepwell-Platte mit einem sterilen Zahnstocher oder Pipettenspitze und wachsen 12-16 h bei 37 ° C unter Schütteln bei 200 Upm. Dies kann entweder manuell oder mit einem automatisierten Kolonie-Picker erfolgen.
2. Transfer 40 ul wachsenden Kultur zu 1,5 ml NZY Medium mit Glukose / Laktose / Glycerin in einer 96-Deepwell-Block nach der Methodik des Studier et al ergänzt. ¹⁵
   HINWEIS: Alternativ können die Zellen für 3-4 h (OD 0,8-1,0) bei nicht-ergänzten und die Proteinexpression durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert gezüchtet werden.
3. Decken Sie die Kultur-Block (n) mit einer atmungsaktiven Dichtung und Express Fab-Klone für 6-8 Stunden bei 30 ° C unter Schütteln bei 200 Upm. Spin-Platten bei 4.000 × g für 15 min pelletiert bakteriellen Zellen, den Überstand entfernen, Abdeckplatten mit einer Foliendichtung und gefrier Pellets bei -20 ° C bis zur Lyse.
4. Befreien ausgedrückt Fabs aus gesammelten Pellets mit 100 ul Lysepuffer (Tris-HCl 50 mM, 200 mM NaCl, 1,25% Triton X-100 pH 8,0 mit 1 mg / ml Lysozym und 10 U Benzonase / ml Kultur und Protease-Inhibitoren) und Schütteln für 2 h bei 4 ° C.
5. Entfernen von Zelltrümmern durch Zentrifugation bei 4.000 xg für 15 min bei 4 ° C und sammeln Rohlysat Stand zur Verwendung in anfängliche Charakterisierung der Spezifität von ELISA-Platten (siehe Abschnitt 5.3).

5.3) Clone Charakterisierung durch direkte Bindung Klonale Fab ELISA

1. Immobilisierung von Antigenen, wie in Abschnitt 3.1 beschrieben statt Aliquotierung 30 ul 2 ug / ml Antigen in PBS in die Vertiefungen einer Platte mit 384 Vertiefungen. Quad-basierte Layouts Antigen in der Platte können Reagenztransfer erleichtern bei der Verwendung von 96-Kanal-basierte Abgabeköpfen. Gemäß Abschnitt 3.1 zu waschen und Block-ELISA-Platten.
2. Cleared Lysate von gesammelt Abschnitt 5.2 kann direkt an immobilisierte Antigen für eva angewendet werdenwertung der Bindung. Inkubiere 30 ul Lysat pro Well für 15 min bei RT mit Schütteln bei 200 Upm.
   HINWEIS: Gereinigtes Fab-Klon-Protein kann alternativ durch Verdünnen auf 10 ug / ml in PBT-Puffer und 30 ul Anwenden jedes Klons zu blockierten Vertiefungen Antigen oder negativen Kontrollprotein (GST, BSA, etc.) enthält, und die Entwicklung beschrieben in der gleichen Weise verwendet werden unten. Alternativ können Fab-Phagen auch durch Verdünnen von 10 & mgr; l Phagenüberstand verwendet werden, in 20 ul PBT-Puffer (in Abschnitt 5.1 beschrieben) (1: 3) und Erfassen mit anti-M13-HRP-Antikörper (in den Schritten 4.4 – 4.5)
3. Überschüssiges Lysat und wasche Brunnen entweder manuell oder mit Hilfe eines automatisierten Platten gewaschen 8x mit 100 ul Puffer PT und überschüssige Puffer.
4. Inkubiere 30 ul einer 1: 5000-Verdünnung von sekundären anti-FLAG-Antikörper in PBT-Puffer für 30 min bei RT mit Schütteln bei 200 Upm.
5. Waschen, zu entwickeln und zu quantifizieren, nach §§ 4,3 bis 4,5.
   HINWEIS: Repräsentative Ergebnisseveranschaulicht sowohl spezifische als auch nichtspezifische Bindung Klone werden in 5 gezeigt.

5.4) Clone Sequencing

1. Bereiten Sie ein PCR-Mastermix, wie in Tabelle 2 angegeben.
2. Add 2 ul der entsprechenden PCR-Matrize (entweder Phagenüberstand oder resuspendierten Einzel Phagemid enthaltenden Bakterienkolonie) zu 20 ul PCR-Mastermix mit den entsprechenden Primern in Vertiefungen einer PCR-Platte vorbereitet.
   HINWEIS: Separate Mastermixen sind für die Sequenzierung der beiden schweren und leichten Kette Gene erforderlich.
3. Führen Sie die PCR-Reaktion mit den in Tabelle 2 aufgeführten Parameter – PCR-Einstellungen.
4. Verifizieren Erfolg der PCR-Reaktion durch Mischen von 5 ul der fertig Reaktion mit Ladepuffer auf einem 1% Agarosegel mit DNA-Visualisierung Fleck und Bildgebung auf einem 300 nm-Transilluminator ergänzt.
5. Add 2 ul des PCR-Produkts auf 10 ul sterilem Wasser mit 0,2Ul jeder Exonuclease shrimp alkalischer Phosphatase und bei 37 ° C für 20 min, gefolgt von Inaktivierung des Enzyms bei 80 ° C für 10 min, um überschüssige Primer in Vorbereitung für die Sequenzierung zu entfernen.

6. Skalierung für die automatisierte Auswahl

6.1) Die Pipetten-basierte Liquid Handling

1. Bereiten Sie eine 1% (w / v) Bromphenolblau in Wasser und entfernen unlösliche Partikel mit einer 0,45 ml-Filter.
2. Um den linearen Bereich der Absorption auf der Plattenlesegerät ermitteln, bereiten eine 1: 1000 Verdünnung der 1% Bromphenolblau-Lösung in Wasser, und fahren Sie mit zweifachen Reihenverdünnungen (16 Verdünnungen insgesamt).
3. Übertragen Sie 100 ul jeder Verdünnung auf eine flache Unterseite 96 Well-Platte und die Extinktion bei 590 nm. Grundstück absolute Absorption gegen Verdünnungsfaktor und wählen Sie eine Verdünnung im mittleren bis oberen Ende des linearen Bereichs für nachfolgende Tests.
4. Fügen Bromphenolblau zu Wasser oder auf die tatsächliche Lösungdas wird auf der Grundlage der im vorherigen Schritt in einem ausreichenden Volumen zum Pipettieren zu drei 96-Well-Platten ausgewählt Verdünnung plus das Totvolumen in dem Behälter zu pipettieren.
5. Kalibrieren Sie einen Einkanal-Pipette, um das Testvolumen durch Pipettieren von Wasser auf einer Analysenwaage zu liefern (100 ul Wasser wiegt 100 mg bei RT.)
6. Verwendung der kalibrierten Pipette übertragen die Testmenge der gefärbten Lösung, um mindestens drei Wells einer Flachboden-96-Well-Platte und lesen ihre Absorptionen bei 590 nm, in dreifacher Ausführung.
7. Wiegen Sie drei leere Flachboden-96-Well-Platten auf einer Analysenwaage und notieren ihre Massen.
8. Pipette Testvolumen aus dem Reservoir zu jeder von drei Platten mit 96 Vertiefungen und Messen ihrer Absorption bei 590 nm, in dreifacher Ausführung.
9. Wiegen Sie jede Platte und die Berechnung der Massendifferenz.
10. Erstens, auszuwerten, ob die Extinktionen in jeder Vertiefung innerhalb des Toleranzbereichs uniform (z. B. +/- 5%) und ob sie mit th sinde Absorption von Hand-Pipettieren mit dem kalibrierten Pipetman erhalten. Wenn bestimmte Kanäle konsequent über- oder unter liefern (zum Beispiel siehe Abbildung 6), folgen Sie Reparaturverfahren und wiederholen Sie den Bewertungsverfahren, bis alle Kanäle liefern einheitliche Bände.
11. Zweitens, wenn alle Kanäle bestätigt einheitlichen Mengen liefern, überprüfen Sie die Richtigkeit der diesem Volume durch Berechnung des durchschnittlichen Massendifferenz, pro Well. Zum Beispiel wird ein perfekt kalibrierten Flüssigkeit Handler-Set für 100 ul 9,60 g Wasser pro Platte oder 0,10 g Wasser pro Vertiefung zu liefern. Wenn das reale Volumen geliefert wird konsequent über oder unter dem beabsichtigten Volumen, so kann ein Korrekturfaktor angewendet werden, dh, Programmier 110 ul, um tatsächlich liefern 100 ul.
    HINWEIS: Bei geringen Mengen, beispielsweise 10 & mgr; l, zu verwenden zehnmal Bromphenolblau in gefärbten Lösung und pre-Aliquot von 90 ul Wasser zu der 96-Well-Platten mit der Hand, um sicherzustellen, dass die ab-sorbances sind messbar und Fall im linearen Bereich.

6.2) Automatische Plattenwäsche

1. Immobilisieren, positive und negative Kontrollzielproteine ​​in getrennten Vertiefungen der 96-Well-Mikroplatten (zwei Platten für jede Bedingung getestet werden), wie in Abschnitt 3.1 beschrieben.
2. Blockieren nicht-spezifischer Bindungsstellen durch Inkubation mit Blockierungslösung für eine Stunde bei RT.
3. In identischen 100 ul-Proben eines 10 ¹³ KBE / ml ziel bindenden Fab-Phagenlösung in PBT in alle Vertiefungen in allen Platten und Inkubation unter leichtem Schütteln bei RT für 2 h.
4. Nach jeder Bedingung, eine Platte für Infektion und Titration und eine Platte für den ELISA waschen zwei Platten.
5. Beurteilung der Wirksamkeit des Wasch durch direkte Infektion in Bakterien und Titration (wie in Abschnitt 3.3 beschrieben (ohne M13K07 hinaus) und 7.2.1) oder die Entwicklung mit anti-M13-HRP-Antikörper und kolorimetrischen Substrat (wie in Abschnitt 4 beschrieben).
6. Phagen-Titer from spezifische Klone wird oft im Bereich von 10 ⁵ bis 10 ⁷ Phagen / ml Ausbeute aus einem immobilisierten Protein, gegen das der Klon spezifisch bindet. Einige der verbleibenden Bindung zu negativen Kontrollprotein (beispielsweise BSA) zu erwarten ist und die allgemein mit 10 ² bis 10 ⁵ Phagen / ml beobachtet werden, jedoch sehr niedrige Titer (dh., <10 ¹⁾ zu strenge Wasch Signal, das beeinträchtigen können eine Auswahl.
7. Für bindenden Phagen durch ELISA bestimmt, vergleichen Sie die absolute Bindung Signale für positive und negative Kontrollproteine ​​zu bestimmen, ob Roboter Wasch entspricht etablierten Handwaschergebnisse (Abbildung 7).

6.3) Platte Waschmaschine Dekontamination

1. Um zu starten, führen Sie die Dekontaminationsprotokoll getestet werden.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, mindestens die doppelte Gesamtleitungsvolumen, und füllen und genießen Sie den Scheibenkopf für 5 min in 0,5% Natriumhypochlorid, frisch verdünnten from handelsübliche Bleiche (typischerweise 6% Natriumhypochlorit).
2. Prime und genießen Sie den Scheibenkopf für 5 min in sterile (autoklaviert) Wasser und schließlich, Prime das System, bis die Leitungen mit Luft gefüllt.
3. Prime die Linien mit sterilem Wasser oder Waschpuffer.
4. Einmal zu waschen eine sterile 96-Well-Mikroplatten, aus Scheibe entfernen und Dichtung mit sterilen Plattendichtung. Dies ist die Pre-Kontaminationskontrolle Platte.
5. Aliquot 100 ul O / N amplifizierten Phagen Kulturüberstand zu allen Wells einer 96-Well-Platte.
6. Einmal zu waschen den Phagen enthaltenden Platte und dann von der Scheibe entfernen, und die Dichtung mit einer Kunststofffolie oder Plattendichtung. Dies ist die Kontaminationskontrolle Platte.
7. Führen Sie die Dekontaminationsprotokoll getestet. In diesem Beispiel wiederholen Sie die Schritte 6.3.1 und 6.3.2.
8. Einmal waschen sterile Mikro, dann von Scheibe und Dichtung entfernen. Dies ist die Dekontamination Testplatte.
9. Platte 50 ul der log-Phase E. coli zu Titerplatten; dies ist die vorge Infection Steuerplatte.
10. Entsiegeln vorge Verunreinigungen, Verschmutzungen und Dekontaminations Platten mit 96 Vertiefungen und 100 ul E. coli in der Log-Phasen-Wachstumsphase in alle Vertiefungen, mit neuen Tipps für jede Vertiefung.
11. Versiegeln und bei 37 ° C für 30 Minuten bei 200 Upm.
12. Platte 50 & mgr; l der infizierten Zellen von drei zufälligen Vertiefungen jeder Platte mit 96 Vertiefungen zu 10 cm 2 YT / Carb Platten und Inkubieren bei 37 ° CO / N.
13. Dann werden 50 & mgr; l der infizierten Zellen aus allen Vertiefungen jeder Platte tiefe Well-Platten mit 1 ml 2YT plus 100 g / ml Carbenicillin pro Well wachsen O / N bei 37 ° C.
14. Wiederholen Sie die Dekontaminations Protokoll und lassen Sie die Scheibe Linien trocknen.
    HINWEIS: Kein O / N-Wachstum auf Platten oder in Flüssigmedium sollte sich auf die Pre-Infektionskontrolle, Pre-Kontaminationskontrolle oder Dekontamination Testplatten zu beachten. Viele Kolonien und das Wachstum sollte auf der Kontaminationskontrolle Platte beobachtet werden; wenn nicht, keine Rückschlüsse auf die Wirksamkeit desDekontaminationsprotokoll vorgenommen werden können. Im Idealfall wird die Dekontaminations Platten keine Kolonien und keine O / N Wachstum in jeder der Vertiefungen in den O / N-Platten zu ergeben. Die Stringenz der Dekontaminations Protokoll kann mit höherer Bleichkonzentrationen erhöht werden, längere Haltezeiten und zusätzliche Zyklen.

7. Input / Output Titrationen

7.1) Eingangs Phage Titrationen

1. Verdünnen Sie eine 5-ul-Aliquot des Phagen auf 50 ul mit steril filtrierten PBS und mischen.
2. Bereiten serielle 10-fache Verdünnung in sterilfiltriertem PBS auf 10 ¹⁰ unter Verwendung von Mehrkanal-Pipette oder ein 96-Kanal-Pipette.
3. Impfen Sie 5 ul der verdünnten Phagen in 45 ul des T1-Phagen-resistenten E. coli-Zellen in der Log-Wachstumsphase (OD 0,6-0,8) und Inkubation mit einer atmungsaktiven Dichtung für 30 min bei 37 ° C abgedeckt.
4. Platte 5 ul von infizierten Zellen auf einer LB / Agarplatte mit 100 ug / ml Carbenicillin und inkubieren O / N a supplementiertt 37 ° C.
5. Die Phagen-Konzentration kann aus dem die meisten verdünnten Probe, bei der Kolonien erscheinen nach den Berechnungen in Abschnitt 2.8 geschätzt werden.

7.2) Ausgangs Phage Pitrations

1. Nach Elution von plattengebundene Phagen durch Zugabe von E. coli-Zellen, verdünnte ein 5 ul Aliquot der Phagen-infizierten Zellen zu 50 & mgr; l 2YT-Medium mit autoklaviert
2. Bereiten serielle 10-fache Verdünnung in autoklaviert 2YT-Medium bis 10 ⁶ unter Verwendung einer Mehrkanal-Pipette oder 96-Kanal-Pipette.
3. Platte 5 ul von infizierten Zellen auf einer Agarplatte mit 100 ug / ml Carbenicillin ergänzt und inkubieren O / N bei 37 ° C.
4. Die Phagen-Konzentration kann aus dem die meisten verdünnten Probe, bei der Kolonien erscheinen nach den Berechnungen in Abschnitt 2.8 geschätzt werden.
   HINWEIS: In beiden Fällen (dh Ein- und Ausgang Phagen-Titer, der Vergleich mit Koloniezahlen sowohl Tetracyclin (Gesamt cell Nummer) und Kanamycin (Helfer-Phagen-Titer) auch informativ.

Representative Results

Discussion

Bei der Durchführung von in vitro-Antikörper-Selektionen, die zwei primäre Determinanten Auswahl Erfolg sind 1) die Isolierung von gut gefalteten Antigenziele zur Auswahl auf und 2) die Verfügbarkeit einer hohen Funktionsvielfalt Antikörperbibliothek. In vielen Fällen kann die Verfügbarkeit ausreichender Mengen von gut gefalteten Protein voller Länge nicht limitierend sein. Ein Ansatz zur Überwindung dieser Einschränkung ist, Domains von Bioinformatik-Analyse ²² identifiziert und zur Insertion synthetisiert in einen bakteriellen Expressionsvektor mit einer geeigneten Affinitätsmarker zu verwenden.

Es gibt eine Vielzahl von Variablen, die in biotechnologischen Anwendungen verwendet werden, um die Löslichkeit zu erhöhen, die Reinigung zu erleichtern und zu stabilisieren instabile Domänen. ¹¹ der Fähigkeit, nahezu synthetisieren beliebige Insertionssequenz ermöglicht eine äußerst vielseitige Antigen Generation Plattform. Obwohl die GST-getaggte Format ist weit verbreitet, haben erfolgreiche Ergebnisse vorhermit Hexahistidin, Fc, Heiligenschein, Maltose Bindeprotein und ortsspezifische Biotinylierung Tags erhalten und es wird angenommen, dass unzählige andere Affinitätsmarker können zur Verwendung in einer ähnlichen Plattform optimiert werden. Allerdings können Affinitätstags sowohl nützlich als auch unbeabsichtigte negative Folgen in Downstream-Anwendungen ¹¹ und sollte gründlich vor dem Aufbau einer Pipeline auf der Grundlage einer bestimmten Format untersucht werden.

Oft neuen Benutzer die Frage, wie man die Qualität eines Antikörperbibliothek beurteilen zu stellen und wenn es keine einfache Antwort, sollte man versuchen, mehrere Schlüsselfunktionen zu beurteilen (ob natürlich oder synthetisch), einschließlich Gesamt Vielfalt relativen Anzeigeebenen, die Art der und der Umfang der Randomisierung (dh Bibliotheksdesign gegen Bibliothek Inhalte durch Sequenzierung bestimmt) und die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Antikörpers gegen die vorgesehene Anwendung. Obwohl über den Rahmen dieses Protokolls eine detailliertere treatment dieser Features und wie sie die Selektion von Antikörpern beeinflussen können hier ^2,23 gefunden werden. Kenntnis der Bibliothek Vielfalt insbesondere wichtig, eine ausreichende Abdeckung der Vielfalt bei Auswahl gewährleisten. In der Regel ist ein Phage Konzentration, die 100-1.000 Kopien jeder Phagenklon in der Bibliothek bietet wünschenswert und sollte sicherstellen, dass alle richtig positiv in der Bibliothek vorhanden Bindemittel wiederhergestellt werden können. Jedoch unspezifische Bindung des Phagen an Oberflächen dramatisch über 10 ¹³ Phagen / ml, und für sehr unterschiedliche Bibliotheken Mikroplatte mehr als ein einzelnes gut pro Antigen kann erforderlich sein, um eine ausreichende Deckung zu gewährleisten. Andererseits, wenn die Eingabebibliothek zu verdünnt ist, die absolute Konzentration der wahren positiven Bindemittel wird so weit unter dem KD (typischerweise nM), dass sie nicht wiedergewonnen werden können. Angesichts dieser Beschränkungen Phagenbibliotheken sollte allgemein ^{12-13 Oktober} Phagen / ml für die erste Runde der Auswahl resuspendiert werden.0; Bei dieser Konzentration eine 100 l-Aliquot des Phagen eine 1,000-100 fachen Abdeckung eines Diversity-Bibliothek 10 ⁹ -10 ¹⁰ und kann routine Ausbeute bindenden Klonen zu unterschiedlichen Antigenen. Bei geringeren Konzentrationen, oder erhöhte Vielfalt, kann es erforderlich sein, die Anzahl der Vertiefungen von Antigen, gegen in der ersten Runde ausgewählt zu erhöhen (siehe Abschnitt 2.9). Nach 1 abzurunden, jedoch die meisten der nicht-Bindungs ​​Diversität der Bibliothek entfernt worden ist; Überdeckung der Runde 1 Ausgang Vielfalt ist meist leicht zu erreichen mit einem einzigen gut. Bei Parallel Selektionen in 96-Well-Platten, kann dies die Anzahl von Antigen an nur einem erforderlichen Selektionsplatten, die auf die erste Runde zu reduzieren.

Während der eigentlichen Selektionen können Phagentitration objektive Messungen zur Charakterisierung und Überwachung der Fortschritte bieten und gleichzeitig dazu beitragen, um Problembereiche besonders in den ersten Runden der Selektion festzustellen, wo die Anreicherung nicht aus, umnachgewiesen werden. Dies kann bei der Skalierung von Auswahlmöglichkeiten zu Protokoll Leistung zu bestimmen besonders nützlich sein. Generell Eingangs Phagen-Titer (dh naiven Bibliothek oder nach der Amplifikation des eluierten Phagen) sollte (10 ¹² -10 ¹³ Phagen / ml) zwischen den Runden relativ konstant anfallen, mit schlechten Zellwachstum / low Phagen-Titer zeigt eine mögliche Kontamination und / oder schlechte Ausgang der letzten Runde an. Obwohl Ausgangs Phagen-Titer werden voraussichtlich während der Anreicherung in späteren Runden der Selektion zu erhöhen, wird ein Bereich von 10 ³ bis 10 ⁵ KBE / ml in den ersten zwei Runden erwartet. Eine Abweichung von diesem Bereich kann mögliche Probleme bei der Auswahl wie Verschmutzung oder Über Waschstringenz anzuzeigen. In späteren Selektionsrunden (dh den Runden 3 und 4), kann die Anreicherung von Klonen, die spezifisch an das Zielantigen durch gepoolte ELISAs, die die Bindung des Phagenpool Maßnahme gegen sowohl Ziel-Antigen und negative beurteilenKontrollprotein (siehe Abschnitt 4).

Nach 3-4 Runden der Selektion (: Negativkontrolle Proteinsignalverhältnis von 2: oder einmal Anreicherung an Zielprotein ein Zielantigen erreicht hat 1 oder höher im Vergleich zum Hintergrund-Protein), werden infizierten Bakterienzellen ausplattiert, um einzelne Kolonien Phagemid zur Sequenzierung zu isolieren , erstmalige Beschreibung und das Klonen, wenn nötig. Zu diesem Zeitpunkt ist es sehr ratsam, Fab-Phagen konvertieren Fab bevor weitere Charakterisierung zu befreien. Obwohl Fab-Phagen für Erstbeschreibung durch Verdünnung 10 ul der Phagenüberstand verwendet werden in 20 ul PBT-Puffer und den Nachweis mit anti-M13-HRP-Antikörper (in den Schritten 4.4 – 4.5) (Kapitel 5.1), in unserer Erfahrung, Bindungseigenschaften im wesentlichen in überall von 5-20% der Klone auf Befreiung ändern aus der Phagenpartikel und vorzeitige Wandlung kann Probleme mit falschen Positiven zu vermeiden. Die spezifische Methodik für die Umsetzung verwendet werden auf der uniqu abE Architektur des Phagemid und steht daher nicht mit hier explizit behandelt werden. Bei den am häufigsten verwendeten Vektoren, kann dies im Allgemeinen durch 1) Transformation des gereinigten Phagemid (oder Phagemid-Pool) in einer zuständigen nicht Suppressor E. bewerkstelligt werden coli-Stamm, wie HB2151 oder 55244, wenn ein Amber Stop (TAG) Codon greift das Fab und pIII-Protein, 2) das Einführen eines Amber-Stopcodon zwischen den Fab und pIII-Proteine ​​die Expression von löslichen Antikörperfragmente in einem nicht-Suppressorstamm zulassen oder 3) durch Klonierung Immunglobulin-Gene (aus einzelnen Phagemid oder Phagemid-Pool), um einen geeigneten Expressionsvektor. Zur Auswahl und Merkmale weiter zu rationalisieren, können gepoolt Klonierungsverfahren wirksames Mittel bieten für die Umwandlung verbindlich Klone en masse in den Expressionskonstrukten, die beide eliminiert das Potenzial für falsch-positive Bindung von Fab-Phagenpartikel und wo Ausdruck Lysate werden zur frühzeitigen Charakterisierung verwendet, auch die Kosten und den Aufwand der Reinigungkann zunächst vermieden werden.

Für Klone direkt von Bibliothek F (in ²⁴ beschrieben) isoliert, können variable Antikörperdomänen mit 1-2 & mgr; l Phagenüberstand als Matrize zur PCR-Amplifikation der Komplementarität bestimmenden Regionen (CDRs) (siehe Tabelle 2 für Werkstoffe der Bibliothek F-gerichtete Primer sequenziert ). Unter Verwendung dieser Primer, werden die schweren und leichten Kette variablen Regionen Produkte von ~ 700 und ~ 500 bp ergeben, jeweils für alle drei CDRs. Grundierungen sind Glühen Websites für M13-Primer, so dass Produkte können nach der Bereinigung sequenziert werden (wie in Abschnitt 5.4.5 beschrieben) mit Standard-Primer in den meisten Sequenzierungskernanlagen. Alternativ zum Fab-Phagen-Pools, die in einen Expressionsvektor in E. kloniert wurden und transformiert direkt coli zur Expression können einzelne Kolonien isoliert und in 15 ul 2YT und 1-2 & mgr; l der Zellsuspension direkt als Vorlage für einzelne C verwendet resuspendiertolony PCR unter Verwendung geeigneter Primer.

Automatisieren Auswahlen Optimierung und Validierung von mehreren wichtigen Roboterfunktionen erfordern. In der Regel müssen die Pipettenbasis Liquid Handling präzise und konsistent über alle 96 Kanäle sein, Plattenwäsche muss ungebundenen Phagen effizient ohne Strippen adsorbierten Antigen oder gebundene Fab-Phagen aus der Selektionsplatte entfernen. Effektive Dekontamination des Plattenwäscher ist auch notwendig, zwischen den Runden, damit die Anreicherung und effektive Gegenselektion und zwischen aufeinanderfolgenden Auswahl um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Zur Optimierung der Hochdurchsatz-Auswahlverfahrens haben einfachen Ansätzen zur Bewertung dieser Funktionen, die zuvor verwendet wurden und werden im Folgenden detailliert und im Protokoll beschrieben.

Um die Konsistenz der von allen Kanälen eines Flüssigkeitsabgabe / Saugkopfes gelieferten Mengen zu bewerten, wird eine farbige Lösung für ein Flachboden-96-Well-Platte und dem absorban pipettiertce in jeder Vertiefung auf einem Plattenlesegerät gemessen. Ein Chromophor wie Bromphenolblau ist hilfreich für Färbelösungen ähnlich denen für echte Selektionen verwendet, um die Effekte unterschiedlicher Oberflächenspannung und Kohäsionseigenschaften auf für Volumen zu beurteilen. Nach Bestätigung, daß alle Kanäle Abgabe konsistente Mengen kann die Genauigkeit des gesamten abgegebenen Volumens durch Messung der Masse der Flüssigkeit auf jede Platte übertragen bestimmen.

Automation der Plattenwäsche, um ungebundene Klone zu entfernen erfordert vor allem eine Optimierung der Geschwindigkeit, mit der Waschpuffer ist, verzichtet werden, und die Anzahl der Wäschen eingesetzt werden. Eine sinnvolle Art der Auswertung dieses Parameters von Positivkontrollen (Fab-Phagen-bindenden Klonen), um die Effekte des Variierens der Abgabegeschwindigkeit und / oder der Anzahl der Waschungen, um festzustellen, ob 1) adsorbierte Antigen oder gebundene Phagen beurteilt wird durch Waschen entfernt zu strenge oder 2) nicht-spezifische Bindung an nicht-verwandten Proteinen ist übermäßige due zu Bedingungen, die nicht streng genug sind zu waschen. Rest / gebundene Phagen können entweder durch Infektion in Bakterien und Überzug für Einzelkoloniezahlen oder durch ELISA unter Verwendung von für Antikörper Affinitätsmarkierungen oder Phagenhüllproteine ​​Sekundärantikörper nachgewiesen und quantifiziert werden. Negative Kontrollen werden verwendet, um Restmengen an nicht-bindenden Fab-Phagen zu bewerten, um Proteine ​​oder spezifische Bindungs ​​Fab-Phagen an nicht-verwandten / Hintergrund-Proteine, die hoch sein können, wenn Waschen ist nicht streng genug zielen. In diesem Fall verwendet man als Kontrolle für nicht-spezifische Bindung und einem Anti-FLAG-Antikörper, die ein FLAG-Epitop-Markierung auf dem Fab-Phagen als Positivkontrolle erkennt immobilisierten BSA. Wir verglichen acht und sechzehn Waschzyklen mit dem Roboter gegenüber dem Waschen mit der Hand, mit einer mittleren Durchflussrate, um zu zeigen, dass diese Techniken waren äquivalent. Alternativ Mess Ein- und Ausgangs Phagen-Titer (siehe Abschnitt 7) während der laufenden Auswahl kann auch helfen, um Feineinstellungen in den Waschparameter vorzunehmen. </p>

Schließlich muss die Dekontamination von Plattenscheiben zur Auswahl verwendet effektiv, um Verschleppung von Phagen aus früheren Selektionen zu beseitigen. Nach unserer Erfahrung ist frisch verdünnten 0,5% Natriumhypochlorit ist schnell, effektiv und kostengünstig. Detergentien wie SDS sind auch wirksam, erfordern jedoch viel mehr ausgedehntes Waschen aus dem System zu entfernen. Prüfen Reagenz Kompatibilität für das System vor allen Tests. Dekontaminations beurteilen, testen wir die Anwesenheit von Rest Phagen in Lösungen durch die Fluidik-System verarbeitet und Interpretation der Ergebnisse gemäß Tabelle 3.

Zusammenfassend stellt dieses Protokoll ein skalierbares Verfahren zur Isolierung von Fabs aus kombinatorischen Bibliotheken, die von parallel in vitro Auswahl an Proteindomänen und bietet Verfahren zur Validierung eines automatisierten Phagenselektionssystem. Kosten und Infrastruktur Barrieren, die umfangreiche Tierhaltungen darstellen können gemildert, da diese Methode nicht neuly auf die Immunisierung von Tieren. Ferner wird durch die Integration von Antigen-Antikörper-Generation mit Phagen-Auswahl, Qualität Faktoren, die Einfluss auf Erfolgs Auswahl leichter überprüft und angepasst. Wenn der Zeitrahmen von Antigen-Expression, um die Auswahl und anfängliche Charakterisierung ist in der Größenordnung von 6-8 Wochen kann ein reaktionsProduktionsSystem realisiert werden. Antikörper aus In-vitro-Selektionen isoliert sind beide leicht modifiziert (aufgrund der Genotyp-Phänotyp-Kopplung) und erneuerbare und erfordert nur gespeichert DNA des Expressionskonstrukts wiederholt und reproduzierbar neu generieren Antikörper. Schließlich durch die zeigen, dass dieses Protokoll kann entweder mit einem quasi-manuelle oder vollautomatische Ansatz, der eine speziell angefertigten, Roboter-Auswahl System verwendet durchgeführt werden, kann der Durchsatz skalierbare und zugänglich für kleine akademischen und industriellen Labors gleichermaßen.

Mit den oben beschriebenen Hochdurchsatzverfahren und die Bibliothek F synthetische Antikörperbibliothek ²⁴ </sup> hoher Affinität (niedrig nM) und Spezifität Fab-Antikörperfragmente können routinemßig erhalten werden und funktionsfähig sind in einer Vielzahl von immun Anwendungen einschließlich Western-Blotting, Immunpräzipitation und Immunfluoreszenz von sowohl in vitro – und in situ es ausdrücklich Proteinen. Obwohl Erfolgsraten für eine gegebene Auswahl wird sowohl auf die Qualität (Reinheit foldedness, Monodispersionsgrad etc.) der Antigenziele sowie die Qualität und die Vielfalt der Antikörperbibliothek ab, es wurde gefunden, daß 25 bis 80 beobachtet überall % der Antigene werden Bindemittel für Hochdurchsatz-Auswahl zu erhalten. Wichtig ist, darauf hinzuweisen, dass die Klone mit der Fähigkeit, Zielfunktion modulieren kann auch häufig ausgewählt werden. Diese Bibliothek wurde unter Verwendung eines vollständig humanen Rahmen, der diese Antikörper zugänglich potentielle therapeutische Anwendung ²⁵ ist konstruiert und unterstreicht damit die Bedeutung dieser Pipeline als eine alternative Vorgehensweise für die Erzeugung von Affinitätsreagenzien mit breiter BasisWert.

Zusammenfassend wird die Robustheit und Vielseitigkeit der Ansatz in diesem Protokoll vorge weiterhin in die Optimierung, Industrialisierung und ultimative weit verbreiteten Einsatz dieser Technologie als eine praktikable Mittel zur Erreichung des langfristigen Ziel der Erzeugung von Affinitätsreagenzien für praktisch alle Mitglieder unterstützen das menschliche Proteom.

Materials

MATERIALS
New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker	Eppendorf	M1282-0004
Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system	Anachem Ltd	LIQ-96-200
Microplate shaker	VWR	12620-926
ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge	Thermo Product	75004525
ELx405 Select Deep Well Microplate Washer	Biotek	ELX405USD
Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot	S&P Robotics
Plastic conical Falcon tube: 50 ml	VWR	21008-178
Plastic conical Falcon tube: 15 ml	VWR	89039-668
Axygen 1.7 ml microcentrifuge tubes	Corning	MCT-175-L-C
96-well/384-well Maxisorp plate	Sigma	M9410-1CS
Corning 96-well V-bottom deep-well block	Corning	3960
Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box	Corning	AXY-MTS-06-C-R-S
Breathable adhesive plate sealing film	VWR	60941-084
REAGENTS
Name	Company	Catalog Number
polyethylene glycol	Bioshop	PEG800.1
yeast extract	Bioshop	YEX401.1
bio-tryptone	Bioshop	TRP402.1
N-Z amine	Sigma	C7290
glucose	Sigma	G8270-1KG
lactose	Bioshop	LAC234
glycerol	Bioshop	GLY001.500
carbenicillin 	Bioshop	CAR544.10
kanamycin	Bioshop	KAN201.25
tetracycline 	Bioshop	TET701.25
Tween 20	Bioshop	TWN510.500
monobasic potassium phophate	Bioshop	PPM302.1
dibasic sodium phosphate	Anachemia	84486-440
sodium chloride	Bioshop	SOD001.10
potassium chloride	Bioshop	POC308.1
calcium chloride	Bioshop	CCL302.500
magnesium sulphate	EMD	MX0070-1
magnesium chloride	Bioshop	MAG510.500
NH<sub>4</sub>Cl	Amresco	0621-1KG
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>	Bioshop	SOS513.500
agar	Bioshop	AGR001.500
SybrSafe DNA gel stain	Invitrogen	S33102
phosphoric acid	Acros Organics	201140010
lysozyme	Bioshop	LYS702.25
benzonase	Novagen	71205
Triton X-100		Bioshop	TRX506.500
protease inhibitor cocktail tablets	Roche	11 836 170 001
Ni-NTA resin&nbsp;	Qiagen	1018240
1,000x helper phage (M13K07) stock (10<sup>13</sup> phage per ml)	NEB	N0315S
HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP).	GE Healthcare	27-9241-01
TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> peroxidase substrate&nbsp;	KPL	50-76-00
dNTPs	Biobasic	DD0056
Taq polymerase	Genscript	E00007
Exonuclease	GE Healthcare&nbsp;	EZ0073X-EZ
Shrimp alkaline phosphatase	GE Healthcare	E70092Z-EZ