Method Article

Skalierbare High Throughput Auswahl aus Phagen-Antikörperbibliotheken angezeigt Synthetische

DOI:

10.3791/51492

⸱

January 17th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Recombinant Antibody Network, 2The Banting and Best Department of Medical Research, University of Toronto, 3Antibiome Center, University of California, San Francisco at Mission Bay, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Chicago

In This Article

Summary

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Es wird ein Verfahren mit visuellen Begleitung für die Durchführung von skalierbaren, Hochdurchsatz-Auswahl aus Phagendisplaykombi synthetische Antikörperbibliotheken gegen Hunderte von Antigenen gleichzeitig beschrieben. Mit dieser parallelen Ansatz haben wir Antikörperfragmente, die eine hohe Affinität und Spezifität für verschiedene Antigene, die in Funktionsstandard Immunoassays weisen isoliert.

Abstract

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Die Nachfrage nach Antikörpern, die den Bedürfnissen von Grundlagen- und klinischer Forschung Anwendungen zu erfüllen ist hoch und wird sich dramatisch in der Zukunft zu erhöhen. Es ist jedoch offensichtlich, dass herkömmliche monoklonale Techniken nicht allein bis zu dieser Aufgabe. Dies hat zu der Entwicklung von alternativen Verfahren führte zu der Forderung nach hoher Qualität und erneuerbarer Affinitätsreagenzien an alle zugänglichen Elemente des Proteoms befriedigen. Zu diesem Zweck sind Hochdurchsatzverfahren zur Durchführung von Auswahlen aus Phagendisplay-Bibliotheken synthetischer Antikörper für Anwendungen mit unterschiedlichen Antigenen entwickelt worden und zur schnellen Durchsatz und erfolgreich optimiert. Hierin wird ein Protokoll im Detail, die mit Video-Demonstration zeigt die parallel Auswahl Fab-Phagenklone aus hohe Diversität Bibliotheken gegen Hunderte von Ziele entweder mit einem manuellen 96-Kanal Liquid Handler oder automatisierten Robotersystem beschrieben. Unter Verwendung dieses Protokolls kann ein einzelner Benutzer Hunderte von Antigenen zu erzeugen,Wählen Antikörper, um sie parallel und zu validieren Antikörperbindung in 6-8 Wochen. Hervorgehoben sind: i) eine tragfähige Antigen-Format, ii) Vorauswahl Antigen Charakterisierung, iii) wichtige Schritte, die die Auswahl von spezifischen und hohen Affinität Klone beeinflussen und iv) Formen der Überwachung Auswahl Wirksamkeit und frühzeitig Antikörperklon Charakterisierung. Mit dieser Vorgehensweise haben wir synthetische Antikörperfragmenten (Fabs), viele Zielklassen einschließlich Single-Pass-Membranrezeptoren, sekretierte Proteinhormone und Multi-Domain intrazellulären Proteinen erhalten. Diese Fragmente werden leicht an Volllängen-Antikörpern umgesetzt und validiert worden sind, um eine hohe Affinität und Spezifität aufweisen. Ferner wurden sie nachgewiesen funktionellen in einer Vielzahl von Standard-Immunoassays, einschließlich Western-Blotting, ELISA, zelluläre Immunfluoreszenz, Immunpräzipitation und ähnliche Assays sein. Diese Methodik wird Antikörper Entdeckung zu beschleunigen und letztlich bringen uns näher an die Verwirklichung des Ziels of Erzeugung erneuerbarer, hochwertige Antikörper gegen das Proteom.

Introduction

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Mit dem Beginn der Post-Genom-Zeitalter, ist die Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Bindungsreagenzien zur Charakterisierung und zu modulieren Proteine ​​wichtig, neue Forschung und therapeutische Wege eröffnen. Antikörper weiterhin entscheidend für die akademische und industrielle Forscher als Grundlagenforschung und Diagnose- und potenziellen Therapeutika zu sein. Es überrascht nicht, hat es eine beeindruckende Wachstum der Vertrags Antikörper-Entwicklung von Unternehmen, von denen die meisten verlassen sich auf herkömmliche Hybridom-Technologien, um kundenspezifische Antikörper zu erzeugen. Dennoch In-vitro-Selektion unter Verwendung von Phagen prä....

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Protocol

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1. Antigen-Generation

HINWEIS: Antigen-Domänen synthetisiert und durch eine Vielzahl von kommerziellen Anbietern in einen geeigneten IPTG-induzierbare Expressionskonstrukt kloniert werden.

  1. Transform-Expressionskonstrukte in chemisch kompetente, T1-Phagen resistent, BL21 E. coli-Zellen hergestellt, indem 10 ng von DNA in 20 ul 1X KCM auf Eis kodiert in einer 96-Well-PCR-Platte, gefolgt von der Zugabe von 20 l chemisch kompetente Zellen.
  2. Inkubieren der Zell / DNA-Mischung auf Eis für 20 min, bei RT für 10 min und dann auf Eis erneut 2 min vor der Rettung mit 100 ul vorgewärmtem SOB-Medium mit Glukose (SOC) Medi....

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Results

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Das hier beschriebene Protokoll verwendet worden, um Antikörperfragmente zu einer Vielzahl von sowohl strukturell und funktionell verwandten Antigen-Domänen, von kombi Phagen präsentierten Fab-Bibliotheken, die parallel zu isolieren. Probleme, die Antigen Verfügbarkeit bezogen in silico Identifizierung exprimierbaren Antigen-Domänen, die geeignet sind für die Antikörper-Selektion 23 umgangen werden können, in vielen Fällen durch. Durch Kopplung an Antikörper-Antigen-Expression Auswahl im gleichen Labor

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Discussion

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Bei der Durchführung von in vitro-Antikörper-Selektionen, die zwei primäre Determinanten Auswahl Erfolg sind 1) die Isolierung von gut gefalteten Antigenziele zur Auswahl auf und 2) die Verfügbarkeit einer hohen Funktionsvielfalt Antikörperbibliothek. In vielen Fällen kann die Verfügbarkeit ausreichender Mengen von gut gefalteten Protein voller Länge nicht limitierend sein. Ein Ansatz zur Überwindung dieser Einschränkung ist, Domains von Bioinformatik-Analyse 22 identifiziert und zur Insertion synthe.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

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Wir möchten die NIH Gemeinsamen Fonds anerkennen - Protein Einfangreagenzien Programm für die Finanzierung der Entwicklung des rekombinanten Antikörpers Netzwerk Antikörperselektion und Charakterisierung Pipeline und der kanadischen Stiftung für Innovation zur Finanzierung Kauf des Roboterauswahl Plattform.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MATERIALIEN
New Brunswick Innova44 stapelbarer Inkubator-SchüttlerEppendorfM1282-0004
Liquidator 96-Kanal manuelles Tisch-PipettiersystemAnachem LtdLIQ-96-200
Mikrotiterplatten-SchüttlerVWR12620-926
ThermoScientific Sorvall ST-40 TischzentrifugeThermo Produkt
ELx405 Select Deep Well Mikrotiterplatten-WaschmaschineBiotekELX405USD
Kundenspezifischer automatisierter Phagenauswahlroboter mit hohem DurchsatzS& P Robotics
Konisches Falcon-Röhrchen aus Kunststoff: 50 mlVWR21008-178
Konisches Falcon-Röhrchen aus Kunststoff: 15 mlVWR89039-668
Axygen 1,7 ml MikrozentrifugenröhrchenCorningMCT-175-L-C
96-Well/384-Well-Maxisorp-PlatteSigmaM9410-1CS
Corning 96-Well-Deep-Well-Blockmit V-BodenCorning3960
Axygen Mini-Tube 96-Well, sterile Mikroplatte, Blue Box, CorningAXY-MTS-06-C-R-S Atmungsaktive
Klebeplatte, DichtungsfolieVWR60941-084
REAGENZIEN
, Name, Unternehmen, Katalognummer
, Polyethylenglykol,BioshopPEG800.1
HefeextraktBioshopYEX401.1
Bio-TryptonBioshopTRP402.1
N-Z AminSigmaC7290
GlukoseSigmaG8270-1KG
LaktoseBioshopLAC234
GlycerinBioshopGLY001.500
Carbenicillin BioshopCAR544.10
KanamycinBioshopKAN201.25
Tetracyclin BioshopTET701.25
Tween 20BioshopTWN510.500
monobasisches KaliumphophatBioshopPPM302.1
zweibasisches NatriumphosphatAnachämie84486-440
NatriumchloridBioshopSOD001.10
KaliumchloridBioshopPOC308.1
CalciumchloridBioshopCCL302.500
MagnesiumsulfatEMDMX0070-1
MagnesiumchloridBioshopMAG510.500
NH4ClAmresco0621-1KG
Na2SO4Bioshop SOS513.500
AgarBioshopAGR001.500
SybrSafe DNA-Gel-FärbungInvitrogenS33102
PhosphorsäureAcros Organics201140010
LysozymBioshopLYS702.25
BenzonaseNovagen71205
Triton X-100BioshopTRX506.500
Protease-Inhibitor-Cocktail TablettenRoche11 836 170 001
Ni-NTA-Harz Qiagen1018240
1.000x Helferphagen (M13K07) Stamm (1013 Phagen pro ml)NEBN0315S
HRP konjugierter M13-spezifischer Antikörper (anti-M13-HRP).GE Healthcare27-9241-01
TMB-Substrat: Mischen Sie gleiche Volumina TMB und H2O2 Peroxidase-SubstratKPL50-76-00
dNTPsBiobasicDD0056
Taq-PolymeraseGenscriptE00007
ExonukleaseGE Gesundheitswesen EZ0073X-EZ
Alkalische Phosphatase für GarnelenGE HealthcareE70092Z-EZ
75004525, ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
  2. Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
  3. Schofield, D. J., et al.

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Phage DisplayAntibody SelectionHigh ThroughputSynthetic LibrariesFab PhageAntigen ImmobilizationParallel SelectionLiquid HandlerRobotic AutomationELISA Validation

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