Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus Escherichia coli

Zusammenfassung

Elastin-ähnliche Polypeptide sind stimuliresponsiven Biopolymeren mit Anwendungen von rekombinanten Proteinreinigung zu Drug Delivery. Dieses Protokoll beschreibt die Reinigung und Charakterisierung von Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Peptid-oder Protein-Fusionen aus Escherichia coli unter Verwendung der unteren kritischen Lösungstemperatur Phasenübergangsverhalten, wie eine einfache Alternative zur Chromatographie.

Zusammenfassung

Elastin-ähnliche Polypeptide sind sich wiederholende Biopolymere, die eine untere kritische Lösungstemperatur Phasenübergangsverhalten zeigen, bestehende als lösliche Unimere unterhalb einer charakteristischen Übergangstemperatur und Aggregation in Mikrometer-Skala Koazervate über ihren Übergangstemperatur. Das Design des Elastin-ähnliche Polypeptide auf der genetischen Ebene erlaubt eine genaue Steuerung ihrer Sequenz und Länge, die den thermischen Eigenschaften bestimmt. Elastin-ähnliche Polypeptide in einer Vielzahl von Anwendungen einschließlich der Biosensorik, Tissue Engineering und Drug-Delivery, wobei die Übergangstemperatur und Biopolymer Architektur des ELP kann für die spezielle Anwendung von Interesse abgestimmt werden verwendet. Ferner die untere kritische Lösungstemperatur Phasenübergangsverhalten von Elastin-ähnlichen Polypeptide können ihre Reinigung durch ihre thermische Reaktion, so daß ihre selektive Koazervation und Wiederauflösung ermöglicht die Entfernung der löslichen und unlöslichen Verunreinigungens nach Expression in Escherichia coli. Dieser Ansatz kann für die Reinigung von Elastin-ähnliche Polypeptide allein oder als Reinigungswerkzeug für Peptid-oder Proteinfusionen in dem rekombinanten Peptide oder Proteine ​​genetisch mit Elastin-ähnlichen Polypeptid-Tags angehängt werden können, ohne gereinigt werden verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt die Reinigung von Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Peptid-oder Protein-Fusionen und diskutiert grundlegenden Charakterisierung Techniken des thermischen Verhaltens des reinen Elastin-ähnlichen Polypeptid-Produkte abzuschätzen.

Einleitung

Elastin-ähnlichen Polypeptide (ELP) stellen Biopolymere der Wiederholungspenta VPGXG wobei X die Gast Rückstand, eine beliebige Aminosäure außer Prolin. ELPs weisen untere kritische Lösungstemperatur (LCST) Phasenübergangsverhalten, so daß eine homogene Lösung ELP wird in zwei Phasen beim Erhitzen auf ihre LCST, die üblicherweise die inverse Umwandlungstemperatur (T _t) in der ELP Literatur ¹ bezeichnet wird trennen. Die beiden Phasen werden von einer sehr verdünnten ELP Kügelchen Phase und einer ELP reichen Sedimentphase zusammen. Das ESP reichen Sediment wird auf einer kurzen Zeitskala auf die Aggregation der ELP-Ketten in Mikrometer große Partikel, die anschließend zusammenwachsen ist. Dieses Verhalten tritt über einen Bereich von einigen Grad Celsius und ist in der Regel reversibel, wie eine homogene Lösung nach der Rückkehr auf eine Temperatur unterhalb T _t gewonnen.

ELPs werden typischerweise in Escherichia coli (E. coli) synthetisiert from ein künstliches Gen, das in ein Expressionsplasmid ligiert wird. Dieses Plasmid wird dann in einen transformierten E. coli-Zelllinie, die optimal für die Proteinexpression. Wir haben ausschließlich die T7-lac pET-Vektorsystem zur Expression einer Vielzahl von ELP in E. coli, obwohl andere Expressionssysteme in Hefe ^{2-4, 5} Pilze und Pflanzen ^6-8 wurden auch von anderen Forschern genutzt. Eine Reihe von Ansätzen existieren, um genetisch konstruieren wiederholende ELP Gene, einschließlich rekursive gerichtete Ligation (RDL) ^9, rekursive gerichtete Ligation von Plasmid-Rekonstruktion (Pre-RDL) ¹⁰ und überlappen Erweiterung Rolling-Circle-Amplifikation (OERCA) ^11. Die Fähigkeit, ELPs auf der genetischen Ebene zu konstruieren bietet die Möglichkeit, rekombinante DNA-Techniken zu verwenden, um ELP mit einer Vielzahl von Architekturen (z. B. Monoblöcke, Diblock, Triblock, etc.), die mit weiteren funktionellen hängt werden kann erstellenPeptiden und Proteinen. Kontrolle auf der genetischen Ebene auch sichergestellt, dass jeder ELP ist mit der genauen Länge und Zusammensetzung von seiner genetischen Plasmid-Vorlage vorgegeben ausgedrückt und bietet perfekt monodisperse Biopolymer Produkte.

Die thermischen Eigenschaften der einzelnen ELP hängen von intrinsischen Parametern an das Biopolymer wie sein Molekulargewicht (MW) und Reihenfolge, als auch extrinsische Faktoren, einschließlich der Konzentration in der Lösung und der Gegenwart von anderen Kosoluten, wie Salze. Die Länge der ELP ¹² und seinen Gästen Restzusammensetzung ^{1, 13, 14} sind zwei orthogonalen Parameter in ELP-Design, die verwendet werden können, um die T _t, wobei hydrophobe Gast Rückstände und mehr Kettenlängen führen zu geringeren T _t s zu steuern, während hydrophile Gast Rückstände und kürzere Kettenlängen führen zu höheren T _t s. ELP-Konzentration umgekehrt proportional zu der T _t, wobei Lösungen von gr bezogenenEsser ELP Konzentration niedrigere T _t s ^12. Die Art und Konzentration der Salze beeinflussen die ELP-T _t, bei denen die Wirkung von Salzen folgt der Hofmeister-Reihe ^15. Kosmotropen Anionen (Cl ^- und höher auf der Hofmeister-Serie) senken die ELP _{T t} und steigender Salzkonzentration verstärkt diesen Effekt. Diese inneren und äußeren Parameter können eingestellt werden, um das thermische Verhalten in einem Zieltemperaturbereich, der für eine bestimmte Anwendung eines ELP erforderlich zu erhalten.

Der Stimulus-responsive Verhalten ELPs ist nützlich für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Biosensorik ^{16, 17, 18} Tissue Engineering und ^{Drug-Delivery-19, 20.} Außerdem, wenn ELPs werden Peptide oder Proteine ​​auf der genetischen Ebene verschmolzen, das ESP kann als einfache Reinigungs-Tag dazu dienen, eine kostengünstige Batch-Verfahren zur Reinigung von rekombinantem pep bietenGezeiten oder Proteine, die keine ^{21-Chromatographie} erfordert. Modifikation der Reinigungsprozess wird sichergestellt, dass die Aktivität des Peptids oder Proteins an die ELP fusioniert gehalten. Peptid oder Protein ELP-Fusionen können für Anwendungen, in denen die ELP-Tag ist nützlich ^{22, 23} oder alternativ, wenn das freie Peptid oder Protein erforderlich ist, kann eine Protease-Erkennungsstelle zwischen dem Peptid oder Protein und ELP eingefügt werden, gereinigt werden. Die Entfernung des ELP-Tag kann dann durch Verdauung mit kosten Protease oder einer Protease ELP-Fusion, wobei letztere bietet die zusätzliche Leichtigkeit der Verarbeitung als letzte Runde der ELP Reinigung kann das ESP-Tag-und Protease-ELP-Fusion aus dem Zielpeptid oder trennen erreicht werden Protein in einem Schritt ^{24, 25.} Das folgende Protokoll beschreibt die Reinigung Verfahren zur ELPs und Peptid oder Protein ELP-Fusionen durch ihre thermischen Eigenschaften und erörtert grundlegende Techniken zur Charakterisierungdie thermische Reaktion der ELP-Produkte.

Protokoll

1. ELP Expression

1. Impfen 3 ml steriler Terrific Broth Medien mit einer DMSO-Stamm oder Agar-Platte Kolonie von E. coli geeignet zur Proteinexpression, das den gewünschten ELP-kodierenden Plasmid unter der Kontrolle des T7-lac-Promotor enthält. Fügen Sie den entsprechenden Antibiotikum und bei 37 ° C über Nacht (O / N) unter ständigem Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute.
2. 1 ml des O / N-Kultur auf 1 L des Terrific Broth sterile Medium in einem 4-l-Kolben. Fügen Sie den entsprechenden Antibiotikum und bei 37 ° C für 24 h unter ständigem Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. HINWEIS: Die "leaky" Baseline-Ausdruck mit der T7-lac-Promotor gesehen ist ausreichend für eine hohe Expression von vielen ELPs wenn die Kultur wird für 24 Stunden inkubiert. Jedoch kann eine weitere herkömmliche Ansatz verwendet werden, wobei die Proteinexpression durch die Zugabe von 0,2-1 mM Isopropyl-beta-D-thiogalactosid (IPTG) induziert wird, wenn die optische Dichte der Kultur 0,6 erreicht.
3. Übertragung der Kultur von dem 4-l-Kolben mit einem 1-L-Zentrifugenflasche und Zentrifuge bei 4 ° C für 15 min bei 2.000 x g.
4. Überstand verwerfen. HINWEIS: Wenn mehr als 1 l Kultur angebaut wird sie durch das Hinzufügen eines weiteren Liter Kultur zum Pellet-und Wiederholen von Schritt 1.3 kondensiert werden. Bis zu 2 l Kultur kann in einem Zellpellet kondensiert werden.
5. Resuspendieren des Pellets in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), Wasser oder anderen gewünschten Puffer zu 45 ml der Zellsuspension und in ein konisches 50 ml-Rohr zu erreichen.

2 ELP Reinigung:. Vorbereitende Schritte und erste Runde der Inverse Transition Cycling

1. Beschallen den Zellpellet resuspendiert für insgesamt 9 min in Zyklen von 10 s 'on' und 20 sec "Aus" bei einer Ausgangsleistung von 85 W, während die Probe auf Eis. Kurz damit die Probe auf Eis abkühlen und wiederholen Sie den 9 min Zyklus noch einmal. HINWEIS: Wenn die ELP wird erwartet, dass eine sehr geringe T _t haben die "Aus"-Intervall kann bis zu 40 Sekunden erhöht werden, um die Erwärmung der Lösung auf oberhalb T _t zu vermeiden.
2. Transfer des Lysats in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden.
3. 2 ml 10% (w / v) Polyethylenimin (PEI) für jeden Liter Kultur und schütteln zu mischen. HINWEIS: PEI ein positiv geladenes Polymer, das bei der Kondensation von negativ geladenen genetische Verunreinigungen hilft. Führen Sie diesen Schritt nicht, wenn der ELP negativ geladen ist, wie das PEI auch kondensieren und entfernen Sie die ELP Produkt.
4. Zentrifuge bei 4 ° C für 10 min bei 16.000 x g.
5. Den Überstand in ein sauberes 50 ml Rundbodenzentrifugenröhrchen und entsorgen Sie die Pellets.
6. Optional "backen out" Schritt: Inkubation der Probe bei 60 ° C für 10 min auf Proteinverunreinigungen zu denaturieren und dann übertragen auf 4 ° C oder auf Eis, bis das ESP vollständig aufgelöst. Zentrifuge die Probe bei 4 ° C für 10 min bei 16.000 x g. Den Überstand in einem clean 50 ml Rundbodenzentrifugenröhrchen und entsorgen Sie die Pellets. HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt nicht, wenn ein Peptid oder Protein an die ELP fusioniert und wird voraussichtlich in den Zustand der erhöhten Wärme denaturieren. Dies kann bewirken, dass der Übergang zum Wärme ELP-irreversibel werden oder können die Aktivität des fusionierten Einheit zu zerstören.
7. Induzieren die ELP Übergang mit der Zugabe von kristallinem NaCl (nicht mehr als 3 M). Alternativ können Natrium-Citrat (0,3 M nicht überschreitet) für ESPs, die eine höhere _{T t} s oder niedrigen Renditen haben verwendet werden. HINWEIS: Die Lösung sollte bewölkt drehen einmal das Salz gelöst hat, das die Phasentrennung von ELP aus der Lösung. Sehr hydrophil ELPs mit hoher T _t s kann einige Grad der Erwärmung in Kombination mit der Zugabe von Salz, um die Phasentrennung des ELP in dieser vorläufigen Induktion der ELP Übergang zu induzieren.
8. Zentrifugieren bei Raum temperatue (RT) für 10 min bei 16.000 xg (Hot Spin). HINWEIS: Eine ELP Pellet sollte be beobachtet, dessen Größe von der Expressionsausbeute des ESP. Diese ELP Pellet auf den ersten undurchsichtig erscheinen, aber nach dem Abkühlen wird es schein erscheinen und kann in der Farbe braun sein. Das ESP-Pellet wird farbloser geworden als Reinigungserlös und Verunreinigungen entfernt werden.
9. Überstand verwerfen und fügen Sie 1-5 ml gewünschten Puffer zum Pellet. Das Pellet durch Pipettieren und das Röhrchen bei 4 ° C drehen Hinweis: Das erforderliche Volumen an Puffer von der Größe der Pellets ab ELP und damit die Ausbeute an ELP Expression, in dem eine ausreichende Menge des Puffers sollte hinzugefügt werden, um die Wiederauflösung der ELP Pellet zu ermöglichen. ELP mit hohem Cysteingehalt profitieren Reinigung in Wasser mit 10 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphin-Hydrochlorid (TCEP-HCl) bei pH 7 bis Disulfid-Interaktionen mit kontaminierenden Proteine ​​zu eliminieren. ELPs mit hoher Ladungsinhalt profitieren von Reinigung bei einem pH-Wert eingestellt werden, um ihre Ladung zu neutralisieren und zu reduzieren electrostatic Wechselwirkungen mit verunreinigenden Proteinen.
10. Übertragen Sie die resuspendierten ELP-Lösung in 1 ml Aliquots in sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
11. Zentrifuge bei 4 ° C für 10 min bei 16.000 × g (Kaltrotations). Eine kleine Pellet von unlöslichen Verunreinigungen sind zu beachten.
12. Den Überstand in ein sauberes Röhrchen und entsorgen Sie die Pellets.

. 3 ELP Reinigung: Nachfolgende Runden von Inverse Transition Cycling

1. Induzieren die ELP-Übergang mit Wärme und / oder der Zugabe von NaCl. Proben können auf einem Heizblock oder in einem Wasserbad für 15 min bei einer Temperatur oberhalb der T _T inkubiert werden. Wenn jedoch die ELP an ein Protein fusioniert ist (was die Verwendung von Wärme) oder wenn die ELP eine hohe T _t, die nicht mit Wärme allein erreicht werden kann, einer 5 M NaCl-Lösung zugegeben werden tropfenweise zu induzieren ELP Übergang. HINWEIS: Die Lösung sollte trüb, was auf die Phasentrennung des ELP aus der Lösung.
2. Zentrifuge für 10 min bei 16.000 xg (Hot Spin). Wenn Wärme in Schritt 3.1 verwendet, führen diese Zentrifugationsschritt bei einer Temperatur oberhalb derjenigen, die benötigt wurde, um die ELP Übergang zu induzieren. Wenn allein NaCl wurde in Schritt 3.1 verwendet, führen Sie diesen Schritt Zentrifugation bei RT. HINWEIS: Eine ELP Pellet zu beachten.
3. Überstand verwerfen, fügen 500-750 ul gewünschten Puffer und das Pellet durch Pipettieren und das Röhrchen bei 4 ° C drehen
4. Zentrifuge bei 4 ° C für 10 min bei 16.000 × g (Kaltrotations). Eine kleine Pellet von unlöslichen Verunreinigungen sind zu beachten.
5. Den Überstand in ein sauberes Röhrchen und entsorgen Sie die Pellets.
6. Die Schritte 3.1 bis 3.5, bis keine Verunreinigung Pellet wird in Schritt 3.4 festgestellt.

4. Post-Reinigung Verarbeitung (optional)

1. Wenn gewünscht, dialysiert die Probe gegen einen geeigneten Puffer, um überschüssiges Salz aus dem gereinigten ELP Lösung zu entfernen. HINWEIS: ELPs die lyophilisiert werden sollgegen ddH ₂ OO / N bei 4 ° C dialysiert
2. Falls gewünscht, lyophilisieren die ELP für Langzeitlagerung durch Einfrieren der Lösung bei -80 ° C für 30 min vor der Lyophilisierung O / N. HINWEIS: Die Lyophilisierung sollte nicht für ELP mit anhängenden Proteine ​​verwendet werden.
3. Wenn gewünscht, wieder frei Peptid oder Protein aus einem Peptid oder Protein ELP-Fusion durch Entfernen der ELP tag:
   1. Verdauen das Peptid oder Fusionsprotein ELP mit biotinyliertem Protease (wie durch den Hersteller empfohlen Protease) oder mit einer Protease ELP Fusions entsprechend der Proteasestelle gentechnisch zwischen dem Peptid oder Protein und ELP gestalten.
   2. Entfernen Sie gegebenenfalls die biotinylierten Protease unter Verwendung von Streptavidin-modifizierten Perlen (wie von der Protease-Anbieter empfohlen).
   3. Induziert den Übergang des ELP abgespalten und / oder Protease-ELP-Fusions durch tropfenweise Zugabe von 5 M NaCl-Lösung.
   4. Zentrifuge bei RT für 10 min bei 16.000 x g. HINWEIS: Eine ELP Pellet zu beachten.
   5. Sammeln Sie den Überstand und entsorgen Sie die ELP Pellets. Dialysiere den Überstand gegen einen gewünschten Puffer oder eine Filterzentrifuge, einen Pufferaustausch durchzuführen, um die hohe Salzkonzentration von der reinen Peptid-oder Proteinlösung zu entfernen.
   6. Bestätigen Sie die vollständige Spaltung der freien Peptid oder Protein aus der ELP-Tag durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE).

5 Charakterisierung:. SDS-PAGE

1. Vorbereitung ELP Proben für SDS-PAGE durch Mischen von 10 ul ELP in Wasser mit 10 ul Probenpuffer, der 2-Mercaptoethanol verdünnt. HINWEIS: 40 ug von ELP ist oft ausreichend, um die Größe und Reinheit des ELP Produkt zu testen.
2. Inkubieren der Probe bei 100 ° C für 2 min und geladen auf einem Polyacrylamid-Gel zusammen mit einem passenden Proteinleiter dann.
3. Die Elektrophorese bei 180 V, bis der Farbstoff das Ende des Gels (etwa 45 min) nähert.
4. Färben Sie dieGel mit 0,5 M CuCl _2-Lösung für 5 min, während die Schwing. HINWEIS: ELPs werden typischerweise nicht durch Coomassie-Brilliant-Blue-Färbung sichtbar gemacht, wie einige ELP-Sequenzen nicht mit diesem Farbstoff interagieren. Coomassie Brilliant Blue interagiert primär mit Argininresten und interagiert mit anderen schwach basischen Reste Histidin-und Lysin-Resten und aromatischen-Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin ^26. Somit ELPs und Peptid oder Protein ELP-Fusionen mit Coomassie Brilliant Blue angefärbt werden, wenn ihre Primärsequenz eine ausreichende Anzahl dieser spezifischen Resten.
5. Stellen Sie sicher, dass die MW der ELP-Band entspricht der theoretischen MW von der ELP-Gen und keine Fremdschadstoff Bänder vorhanden sind, erwartet. ANMERKUNG: Manche ELPs migrieren mit einem scheinbaren MW bis zu 20% höher als erwarteten MW ^{9, 27.}

6. Charakterisierung:. Matrix-assisted Laser Desorption /Ionisation Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS)

1. Vorbereiten eines ELP-Lösung in 50% wässrigem Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt, um eine ELP-Konzentration von etwa 25 uM zu erreichen. HINWEIS: Diese Lösung sollte frei von Salz, so ELP müssen gegen H ₂ O dialysiert werden nach der Reinigung.
2. Vorbereitung einer Matrixlösung, gesättigter Sinapinsäure in 50% wässrigem Acetonitril mit 0,1% Trifluoressigsäure.
3. 1 ul der Lösung ELP bis 9 &mgr; l der Matrix-Lösung, um ein ELP-Konzentration von ungefähr 2,5 pmol / &mgr; l zu erreichen. ANMERKUNG: Diese Mischung kann weiter mit Matrixlösung verdünnt werden, um die MALDI-TOF-Signal zu optimieren.
4. Kaution 1-2 ul ELP-Matrix-Gemisch auf eine Metallplatte MALDI und lassen Sie den Ort vollständig trocknen.
5. 5-10 erhalten Spektren mit MALDI-TOF, um die Masse zu bestimmen, um Verhältnis (m / z) des ESP zu laden und schließen die gemessene MW.

7. Characterization: Temperatur-programmierte Turbidimetrie und dynamische Lichtstreuung

1. Bestimmen Sie die _{T t} der ELP durch Temperatur-programmierte Trübungsmessung:
   1. Verdünnungsreihe (z. B. 5-100 &mgr; M) von ELP-Lösungen im gewünschten Puffer.
   2. Verwendung eines temperaturgesteuerten UV-Vis-Spektrophotometer, wird die optische Dichte (OD) bei 350 nm über einen Bereich von Temperaturen (z. B. 20-80 ° C) bei einer Aufheizrate von 1 ° C / min. HINWEIS: Wenn kein Anstieg der OD gesehen kann der T _t die obere Temperaturgrenze des Geräts übersteigt. Die scheinbare T _t kann durch die Zugabe von NaCl verringert werden. Starten Sie bei 1 M NaCl und erhöhen in Schritten von 0,5 M bis der ELP Übergang innerhalb einer messbaren Temperaturbereich festgestellt.
   3. Verifizierung der Reversibilität der ELP Übergang durch Messung der Abnahme der OD über den gleichen Temperaturbereich mit einer Abkühlungsgeschwindigkeit von 1 ° C / min.
   4. Bestimmen Sie die _{T t} des homoPolymer ELP durch Identifizieren der Wendepunkt der Trübung Profil (OD aufgetragen gegen die Temperatur). ANMERKUNG: Diese Temperatur kann leicht von der Ableitung der OD-Kurve, wobei die Temperatur, die dem Maximum der Ableitung wird als _t definiert werden. Komplexere ELP Architekturen komplizierter Trübung Profile angezeigt und sollte weiter untersucht werden, wie in Abschnitt 7.2 beschrieben.
2. Weitere Charakterisierung von ESPs, die komplexer thermischen Eigenschaften (zB ELP Diblock-Copolymere, die Selbstorganisation in kugelförmige Mizellen) angezeigt wird durch dynamische Lichtstreuung (DLS) erreicht:
   1. Bereiten Sie einen ELP-Lösung in der gewünschten Puffer und die Probe durch einen Filter mit einer Porengröße von 20 bis 450 nm. HINWEIS: Die Auswahl der Filterporengröße wird auf der Anwesenheit, Größe und Stabilität von ELP Baugruppen in Lösung ab. Die kleinste führbar Filterporengröße ist bevorzugt, Verunreinigungen, wie zu eliminierenStaub, die die Qualität der DLS-Messungen verringern. Eine größere Filterporengröße verwendet, wenn bedeutende Widerstand erlebt, wenn Gabe eines ELP-Lösung durch kleinere Filterporengrößen werden.
   2. Messung des hydrodynamischen Radius (R _H) über einen Bereich von Temperaturen, die zu einer Region von Interesse in dem Profil identifiziert Trübung entspricht. HINWEIS: ELP Unimere haben typischerweise einen R _H <10 nm, Nanopartikel-Baugruppen haben ein R _H ~ 20-100 nm und Aggregate eine R _H> 500 nm aufweisen. Jeder Anstieg der R _H sollte zu einer Erhöhung der OD bei 350 nm durch UV-Vis-Spektrophotometrie als Funktion der Temperatur, die proportional zu der Größe der Teilchen, gemessen entsprechen.

Ergebnisse

Hier beschreiben wir repräsentative Ergebnisse für die Reinigung und Charakterisierung eines ELP-Homopolymer und einem ELP-Diblockcopolymer. Nach 24 h Expression in E. coli-Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt und durch Beschallung lysiert. Typischerweise wird eine kleine Änderung in der Farbe erfolgt nach der Beschallung bestätigt ausreichende Zell-Lyse (Fig. 1A). Nach der Zugabe von PEI sind genomische Komponenten und Zelltrümmer durch Zentrifugation gesammelt, Abtrennen eines großen Pellets von unlöslichen Verunreinigungen aus der löslichen ELP im Überstand (Fig. 1B). ELP wird durch inverse Übergang Radfahren (ITC), die die LCST-Verhalten ausgenutzt, um die ELP aus löslichen und unlöslichen Verunreinigungen (Fig. 2) ²⁸ getrennt, gereinigt. Der Phasenübergang des ELP wird durch die Zugabe von Wärme und / oder Salz ausgelöst. Zentrifugation führt zur Bildung eines Pellets am Boden der Röhre, die eine aus der ELPnd einige unlösliche Verunreinigungen (Abbildung 1C). Diese Schritt-bezeichnet eine heiße Spin-Rückwürfe lösliche Verunreinigungen im Überstand, während die ELP-Pellet wird beibehalten und in kaltem Puffer. Die resolubilisierten ELP wieder bei 4 ° C zentrifugiert, Diese Schritt-bezeichnet eine kalte Spin-Würfen das Pellet der unlöslichen Verunreinigungen während der Überstand mit löslichen ELP wird beibehalten. Die Wiederholung des Zyklus abwechselnd heiß und kalt Spins erhöht die Reinheit des ELP, aber auf Kosten der leicht rückläufigen Ertrag, als Rest ELP während jeder Runde ITC in Zentrifugenröhrchen und Pipettenspitzen verloren.

Erfolgreiche Reinigung von ELP-und Peptid-oder Protein-Fusionen ELP wird durch SDS-PAGE bestätigt. Kleinen Portionen während des Reinigungsprozesses genommen zeigen die progressive Reinigung von ELP aus dem E. coli-Lysat. ELP im rohen E. überexprimiert coli-Lysat und Schadstoffe verringern Witzh aufeinanderfolgenden Runden der ITC (Abbildung 3). Gereinigtes ELP erscheint als eine einzige Bande in der Nähe der vorhergesagten theoretischen MW.

Das ESP _{T t} wird durch temperaturprogrammierte Trübungsmessung aus. Die Trübung Profil eines ELP-Homopolymer weist einen einzigen starken Anstieg der OD bei 350 nm (etwa 2,0 Einheiten über dem Ausgangswert für einen ELP-Konzentration von 25 uM) (Abbildung 4A). Kühltrübungs Scans bestätigen die reversible Natur der ELP Übergang als die OD wieder auf den Ausgangswert zurück, wenn die Temperatur unterhalb der T _t (4B) verringert. ELP-Diblock-Copolymere zeigen ein komplexeres Profil Trübung im Vergleich zu ELPs Homopolymer ist. Die OD erhöht typischerweise ersten 0,1-0,5 Einheiten über der Grundlinie, nach der die OD erhöht sich deutlich auf 2,0 Einheiten über der Basislinie (Fig. 5A). DLS-Messungen liefern Informationen über die Änderung in R _H in Bezug auf Temperatur, Co rroborating die gewonnenen Informationen aus der Trübung Profil (5B).

Abbildung 1. Preliminary ELP Reinigung. Nach 24 Stunden des Ausdrucks, E. coli-Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt und in PBS resuspendiert. sind a) Zellen durch Ultraschallbehandlung, die durch eine kleine Änderung in der Farbe, so dass das Lysat dunkelt nach der Beschallung. B) nach Zugabe von PEI-DNA-Verunreinigungen zu kondensieren, ist das Lysat begleitet wird lysiert zentrifugiert und ein großes Pellet der unlöslichen Trümmer aus löslichen ELP im Überstand. C) getrennt Die ELP Übergang wird mit der Zugabe von Wärme und / oder Salz und Zentrifugation bildet eine durchschein ELP Pellet induziert.ank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Inverse Gangs Radfahren. ELP mittels dessen LCST-Verhalten von löslichen und unlöslichen Verunreinigungen gereinigt. (2) beginnend mit dem ELP-reiche Lysat (1) die ELP-Übergang mit der Zugabe von Wärme und / oder Salz und dem ELP induziert wird durch Zentrifugation (hot Spin) getrennt. Die ELP Pellet zurückgehalten (3a) während der Überstand, der lösliche Verunreinigungen verworfen wird (3b). Das ESP in kaltem Puffer (4) resuspendiert und erneut bei 4 ° C (Kaltrotations) zentrifugiert (5). Das Pellet, das unlösliche Verunreinigungen verworfen (6a), während der Überstand, der lösliche ELP beibehalten wird (6b). Zyklen von abwechselnd heiß und kalt Spins werden wiederholt, bis die gewünschte Reinheit erreicht ist, wie bei festSDS-PAGE. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. SDS-PAGE-Analyse von ELP Reinigungsprodukte. Erfolgreiche Reinigung eines ELP wird durch SDS-PAGE bestätigt. Überexprimiert ELP ist in der rohen E. offensichtlich coli-Lysat nach der Beschallung (2). Nach der Zugabe von PEI und Zentrifugation der löslichen ELP weitgehend im Überstand (3) zurückgehalten, obwohl einige ELP in der Pellet verworfen unlöslicher Verunreinigungen hat (4). Überstand nach dem ersten Heiß Spin enthält bedeutende Mengen von löslichen Verunreinigungen (5). Überstand nach dem ersten Kaltrotations zeigt eine gute Trennung von ELP von unlöslichen Verunreinigungen (6). Zusätzliche Zyklen heißem (7) und calt Spins (8) entfernen restliche lösliche und unlösliche Verunreinigungen jeweils bis zur endgültigen Heiß (9) und Kaltrotations (10) Überstände weisen keine fremden kontaminierenden Banden bestätigt zufriedenstellende Reinheit des ELP Produkt. Diese ELP-Homopolymer, mit einer Folge von SKGPG-(VGVPG) _80-Y, hat eine erwartete Molekulargewicht von 33,37 kDa. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4. Charakterisierung von ELP-Homopolymer durch temperaturprogrammierte Turbidimetrie. Die ELP-T _t wird durch Überwachen der OD bei 350 nm, während die Temperatur mit einer Geschwindigkeit von 1 ° C / min. A) ELP Homopolymere weisen einen einzigen scharfen Anstieg fest OD, dass defines ihre T _t bei einer gegebenen Konzentration. B) Die Reversibilität der ELP Übergang wird durch Überwachen der OD bei 350 nm von weniger als 25 μ M Lösung, während die Verringerung der Temperatur, bei der Reversibilität wird durch die Rückkehr der OD auf die Grundlinie bestätigt verifiziert. Diese ELP-Homopolymer hat die Sequenz SKGPG-(VGVPG) _80-Y. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. Charakterisierung von ELP Diblockcopolymer durch Temperatur-programmierte Trübungsmessung und dynamische Lichtstreuung. ELPs, die Nano-Selbstorganisation zu unterziehen, wie ELP Zweiblockcopolymere, die Selbstorganisation in kugelförmige Mizellen, Ausstellungs komplexer Trübung Profilen. B) DLS-Messungen bestätigen das Verhalten der Trübung Profil für ein gefolgert zeigt Lösung bei 25 &mgr; M durch Information über die Änderung in R _H in Bezug auf die Temperatur. Hier wird der ELP Unimeren hat eine R _H ~ 8 nm und die Mizellen eine R _H ~ 25 nm auf. Diese ELP Diblockcopolymer die Sequenz GCGWPG-(VGVPG) ₆₀ - (AGVPGGGVPG) _30-PGGS. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

ELPs bieten eine kostengünstige und Chromatographie freie Mittel der Reinigung durch Ausbeutung ihrer stimuliresponsiven Phasenverhalten. Dieser Ansatz nutzt die LCST-Verhalten von ESPs und Peptid-oder Protein ELP-Fusionen, sowohl lösliche und unlösliche Verunreinigungen nach der Expression von genetisch kodierten ELPs in E. beseitigen coli. Diese Leichtigkeit der Reinigung verwendet werden, um ELP für eine Vielzahl von Anwendungen zu erzeugen, oder für die Reinigung von rekombinanten Peptide oder Proteine, in denen die ELP als Reinigungs-Tags, die mit Nachreinigung der Verarbeitung entfernt werden kann, handeln nutzt werden.

ELP Reinigung beinhaltet vorbereitenden Schritte, um die Lyse von E. coli und entfernen genomischen und unlösliche Zelltrümmer aus dem rohen Lysat Kultur (Fig. 1), gefolgt von der Entfernung der restlichen löslichen und unlöslichen Verunreinigungen durch ITC (Abbildung 2). Zentrifugation nach dem Auslösen der ELP Übergang von der ADDIvon Wärme oder Salz trennt die ELP von löslichen Verunreinigungen im Überstand, in einem Schritt bezeichnet eine heiße Spin. Nach Resolubilisieren der ELP wird die Lösung wieder auf eine Temperatur unterhalb der T _t zentrifugiert, um unlösliche Verunreinigungen zu entfernen Pellet wird in einem Schritt ein Kaltrotations bezeichnet. Abwechselnd heiß und kalt Spins verbessert die Reinheit des ELP-Lösung mit jedem Zyklus, gegen einen kleinen Aufpreis zu erhalten. Reinigungsausbeuten hängen von ELP-T _t, die Länge und verschmolzen Peptide oder Proteine. Normalerweise ergibt dieses Protokoll 100 mg gereinigtes ELP pro Liter E. coli-Kultur, aber die Renditen können bis zu 500 mg / l zu erreichen bis Die endgültige Reinheit der ELP Produkt durch SDS-PAGE (Fig. 3) bestätigt. Der MW des gereinigten ELP sollte eng mit der theoretischen MW von der ELP-Gen kodiert entsprechen. Wandern jedoch einige ELPs in SDS-PAGE mit einem scheinbaren Molekulargewicht von bis zu 20% höher als erwarteten MW ^{9, 27.} Genauere Analyse der ELPMW kann durch MALDI-TOF-MS, das auch zusätzliche Informationen über die Reinheit des ELP Produkt zusammen mit orthogonalen analytische Techniken, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) zur Verfügung stellen kann erreicht werden.

Nach der Reinigung wird die ELP _{T t} durch Temperatur-programmierte Trübungsmessung gemessen. Diese Technik überwacht die OD eines ELP-Lösung, während die Temperatur erhöht wird. Die T _t ist konzentrationsabhängig, so ist es ratsam, eine Konzentrationsreihe, die für die beabsichtigte Anwendung des ESP zu charakterisieren. Für ELP Homopolymere die Trübung Profil eine einzige starke Zunahme, die der ELP Übergang entspricht aus Unimeren bis Mikrometermaßstab Aggregate (Abbildung 4A). Die T _t wird als die Temperatur entsprechend dem Wendepunkt der Trübung Profil genau dem Maximum der ersten Ableitung der OD hinsichtlich Temperatur bestimmt wird. Die Reversibilität derELP Phasenübergang wird durch eine Abnahme der OD bestätigt die Basislinie, wenn die Temperatur unterhalb der T _t (4B) verringert. Die Trübung Profil mit zunehmender und abnehmender Temperaturrampen werden in Größe und Kinetik durch Absetzen des ELP Koazervate und variable Hysterese von ELP Resolubilisierung abweichen. Peptid oder Protein ELP-Fusionen ähnlich LCST-Verhalten aufweisen, auf diese Weise, wobei das Peptid oder Protein fusioniert an die ELP beeinflußt die T _t. Für ELP Protein-Fusionen der Übergang ist reversibel unter der Schmelztemperatur des Proteins. Während temperaturprogrammierte Turbidimetrie ist ein ausgezeichnetes Verfahren für die anfängliche thermische Charakterisierung von ELP-Produkte, alternative Techniken, wie z. B. Differential Scanning Calorimetry (DSC), kann auch verwendet werden, um die ELP-T _t zu messen.

ELPs mit komplexeren Architekturen Ausstellung komplizierter thermische Verhalten, das auch durch Temperatur-progra charakterisiert werden könnenMMEd Trübungsmessung. ELP-Diblock-Copolymere, beispielsweise, eine charakteristische Trübung Profil entsprechend ihrer Temperatur-gesteuerte Selbstorganisation in sphärische Mizellen in ihrer kritischen Temperatur Mizellenbildung. Für solche ELP Diblockcopolymere der OD 0,1-0,5 Einheiten über der Grundlinie, die den Übergang von Unimere Micellen, wonach eine starke Zunahme der OD (bis 2,0 Einheiten über dem Ausgangswert) bei einer höheren Temperatur zeigt die Bildung von Mikrometer-Maßstab erhöht typischerweise zuerst Aggregate (5A). Weitere Informationen über Temperatur ausgelöste selbstorganisierten Strukturen ELP mit DLS, eine Technik, die die _R-H von ELP Baugruppen misst in Lösung erhalten. Änderungen in der R _H zustimmen eng mit Veränderungen in OD mit Trübungsmessung (5B) gemessen. ELP Unimere typischerweise eine _H R <10 nm, während Nanopartikel Baugruppen weisen eine R _H ~ 20-100 nm und Aggregate weisen eine R _H > 500 nm aufweisen. Weitere Informationen über selbstorganisierte ELP Nanopartikel wie Aggregationszahl und Morphologie, können durch statische Lichtstreuung oder kryogene Transmissionselektronenmikroskopie ^{17, 23, 29} erhalten werden.

Durch die Einstellbarkeit der ELP thermischen Eigenschaften wird ein Bereich von T _t s von verschiedenen Designs ELP erhalten. Es ist wichtig, im Auge zu behalten, dass die inhärente _{T t} wird die Optimierung des Reinigungsprotokoll für jeden ELP, wo extrem niedrigen oder hohen T _t s die meisten Änderungen an diesem Standardprotokoll erfordern beeinflussen. ELPs mit extrem hohen Übergangstemperaturen können für die Reinigung mit diesem Ansatz ungeeignet sein. Wenn das Design neuartiger ELPs und Peptid oder Protein ELP-Fusionen kann die thermische Antwort des ELP gefährden, kann eine einfache Histidin-Tag für alternative Reinigung durch immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie enthalten. ZusätzlichEigenschaften des ELP-Sequenz kann verlangen, Modifikation dieses Protokoll, wenn der Gast Rückstand wird geladen. Manipulation des Puffers pH-Wert kann als eine Methode, um die Gesamtladung des ELP in dem Bemühen, elektrostatische Wechselwirkungen mit Verunreinigungen zu beseitigen ändern ¹⁷ verwendet werden. Darüber hinaus ist dieses Protokoll für die speziellen Umstände des ELP-Fusionen mit Peptiden und Proteinen, wenn geeignete Maßnahmen getroffen werden, um sicherzustellen, dass der Reinigungsprozess nicht die Aktivität des fusionierten Einheit stören geeignet. Hinweise in der gesamten Protokoll über solche Änderungen dienen dazu, die Reinigung von ELP, die diese Herausforderungen in Bezug auf _{T t,} Ladung, oder Fusions Anliegen präsentieren kann lenken.

Die Reinigung von ELP durch ihre LCST-Verhalten stellt eine einfache und Chromatographie freien Ansatz, um die Mehrheit der ELP und Peptid-oder Protein ELP-Fusionen in E. ausgedrückt reinigen coli. Die hier zusammengefassten Protokoll ermöglicht die Reinigung of ELPs an einem einzigen Tag mit Hilfe von Geräten, die in den meisten biologischen Laboratorien ist. Die Leichtigkeit der Reinigung von ELP und ihre Fusionen wird, hoffen wir, ermutigen eine ständig wachsende Vielfalt der ELP Entwürfe für neue Anwendungen in den Materialwissenschaften, Biotechnologie und Medizin.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
pET-24a(+) pET-25b(+)	Novagen	69749-3 69753-3	T7-lac Expressionsvektoren mit Resistenz gegen Kanamycin (pET-24) oder Ampicillin (pET-25).
Ultra BL21 (DE3) kompetente Zellen	Edge BioSystems	45363	Kompetente E. coli für die rekombinante Proteinexpression.
Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media	MO BIO Laboratories	12105	Media wird in DI H2O rekonstituiert und vor der Verwendung autoklaviert.
Isopropyl-beta-D-thiogalactosid (IPTG)	Gold Biotechnology	I2481C	IPTG wird in DI H2O rekonstituiert, sterilfiltriert und Kulturen zugesetzt, um eine verstärkte Expression zu induzieren.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Tablette	Calbiochem	524650	Diese PBS-Tabletten erhalten, wenn sie in 1 l DI H2O gelöst werden, einen 10 mM Phosphatpuffer mit 140 mM NaCl und 3 mM KCl mit einem pH-Wert von 7,4 bei 25 μC.
Polyethylenimin (PEI)-Lösung (~50 % w/v)	MP Biomedicals	195444	PEI wird als 10%ige (w/v)-Lösung in deionisiertem H2O hergestellt.
Nalgene Oak Ridge Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen, 50 ml	Thermo Scientific	3138-0050	Diese Röhrchen mit rundem Boden halten einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation von 30-50 ml stand.
Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP-HCl)	Thermo Scientific	20491	Eine Stammlösung von TCEP-HCl wird bei 100 mM in DI H2O hergestellt und auf pH 7,0 eingestellt. Bei ELPs mit hohem Cysteingehalt wird die Stammlösung dieses Reduktionsmittels dem ELP-Pellet zugesetzt, um 10 mM in H2O zu erreichen.
Ready Gel Tris-HCl Gel, 4-20% Polyacrylamid Gel mit linearem Gradienten, 10 Well, 30 μ l	Bio-Rad Laboratories	161-1105	Diese linearen Gradientengele bieten eine gute Visualisierung von ELPs mit einem Bereich von MWs.
Kupferchlorid-Dihydrat (CuCl2· 2H2O)	Fisher Scientific	C454-500	Eine gefilterte 0,5-M-Lösung wurde für die negative Färbung von Tris-HCl-Polyacrylamid-Gelen hergestellt.
Anotop 10 Spritzenfilter: 0,02 μ m 0,1 μ m 0,2 μ m	Whatman	6809-1002 6809-1012 6809-1022	Diese Spritzenvorsatzfilter mit einem Durchmesser von 10 mm ermöglichen die Vorbereitung kleiner Volumina für DLS-Messungen.
Millex-HV Filter: 0,45 μ m	EMD Millipore	SLHVX13NK	Diese Spritzenvorsatzfilter mit einem Durchmesser von 13 mm ermöglichen die Herstellung kleiner Lösungsvolumina mit großen Nanopartikelanordnungen für DLS-Messungen.