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Methodenartikel
Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Menschen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) haben ein großes Potenzial für die Untersuchung menschlichen embryonalen Entwicklung, für die Modellierung menschlichen Krankheiten in die Schüssel und als eine Quelle von transplantierbaren Zellen für regenerative Anwendungen nach der Krankheit oder Unfälle. Neuralleiste (NC)-Zellen sind die Vorläufer für eine Vielzahl von adulten somatischen Zellen, wie Zellen des peripheren Nervensystems und Glia, Melanozyten und mesenchymalen Zellen. Sie sind eine wertvolle Quelle der Zellen, um Aspekte der menschlichen embryonalen Entwicklung, einschließlich Zellschicksal Spezifikation und Migration zu untersuchen. Eine weitere Differenzierung der NC-Vorläuferzellen in terminal differenzierten Zelltypen bietet die Möglichkeit, menschliche Krankheiten zu modellieren in vitro untersuchen Krankheitsmechanismen und erzeugen Zellen für die regenerative Medizin. Dieser Artikel stellt die Anpassung eines derzeit in vitro Differenzierung Protokoll für die Ableitung von NC-Zellen aus hPSCs. Dieses neue Protokoll erfordert 18 Tagen unterschiedrentiation ist Feeder-frei, einfach skalierbare und hoch reproduzierbare unter humanen embryonalen Stammzellen (hES) Linien sowie menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Linien. Beide alten und neuen Protokolle ergeben NC-Zellen gleicher Identität.
Einleitung
Menschliche embryonale Stammzellen (hES) und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) haben immense Potenzial gezeigt, insbesondere für die Untersuchung und die künftige Behandlung von Krankheiten des Menschen, für die weder gut noch Tiermodellen primären Gewebe zur Verfügung. Anwendungsbeispiele für den HES / hiPSC Technologie sind die folgenden: Zellen von besonderem Interesse kann von hESC / hiPSCs für die regenerative Medizin in unbegrenzter Menge 1 erzeugt werden. Zellen von Patienten, die eine spezifische Krankheit hergestellt und verwendet, um in vitro Krankheitsmodellen 2,3 einzurichten. Solche Krankheitsmodelle kön....
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Protokoll
1. Herstellung von Nährmedien, beschichtetes Geschirr und Wartung von hPSCs
1.1 Medien-Vorbereitung
Hinweis: Filtern Sie alle Medien für die Sterilisation und bei 4 ° C im Dunkeln bis zu 2 Wochen. Reagenz Namen, Firmen-und Katalognummern werden in der Werkstoff-Tabelle aufgeführt.
- DMEM/10% FBS: Kombinieren 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep und 5 ml L-Glutamin.
- HES-Medium: Kombinieren 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml L-Glutamin, 5 ml Pen / Strep, 10 ml MEM Mindest essentiellen Aminosäuren-Lösung, 1 ml β-Mercaptoethanol. Werden 10 ng / ml FGF-2 nach dem Filtern des Me....
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Ergebnisse
Die beiden wichtigsten Verbesserungen der R-NC-Protokoll über die MS5-R-NC-Protokoll 11 der Feeder-frei, definiert Differenzierungsbedingungen und die allgemeine Verkürzung der Zeitbedarf. MS5 Feeder-Zellen sind 13 Maus-Knochenmark-abgeleiteten Stromazellen, die gezeigt haben, neuronale Differenzierung von hES-Zellen 14 zu unterstützen. HESCs kultiviert auf MS5 Feeder-Zellen bei einer Dichte Form epithelialen Strukturen niedrig und neuronalen Rosetten 15, an der Peripherie der.......
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Diskussion
Für die erfolgreiche Differenzierung von R-NC-Zellen, die aus menschlichen embryonalen Stammzellen / hiPSCs die folgenden Überlegungen sollten gemacht werden. Es ist kritisch, unter sterilen Kulturbedingungen jederzeit arbeiten. Insbesondere ist es wichtig, hpSC Kulturen für Mykoplasmen regelmäßig zu prüfen, da diese Kontamination erfolgreich Differenzierung behindern, aber nicht ohne weiteres visuell in hpSC Kulturen. Die R-NC Differenzierung sollte bei 90-100% Zelldichte eingeleitet werden; niedriger Zelldichte wirkt .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.
Danksagungen
Und dem Tri-institutionellen Stammzellen-Initiative (Starr-Stiftung); Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium für fortgeschrittene Forschende des Schweizerischen Nationalfonds und durch Zuschüsse aus NYSTEM (C026447 C026446) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Ersatz | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Los sollte getestet werden |
| L-Glutamin | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Gibco-Life Technologies | 15140-122 | ||
| MEM Lösung für essentielle Aminosäuren | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxisches |
| rekombinantes humanes FGF basic (FGF2) | R& D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 Pulver | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glukose | Sigma | G7021 | |
| Natriumbicarbonat | Sigma | S5761 | |
| APO humanes Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Humaninsulin | Sigma | I2643 | |
| Putriscindihydrochlorid | Sigma | P5780 | |
| Selenit | Sigma | S5261 | |
| Progesteron | Sigma | P8783 | |
| Matrigelmatrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin Hydrobromid | Sigma | P3655 | |
| Maus Laminin-I | R& Ampere; D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronektin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 Dihydrochlorid | Tocris-R& D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R& D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbinsäure | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R& D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | F& Technik D Systems | 423-F8 | |
| Maus rekombinanter Schalligel (SHH) | R& D Systems | 464SH | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Rekombinante EGF | F& Technik D Systems | 236EG | |
| Gelatine (PBS ohne Mg/Ca) | hauseigene | ||
| Antikörper: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | Charge sollte getestet werden |
| Anti-p75 mIgG1 (Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | Charge sollte getestet werden |
| APC Ratte Anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | Charge sollte getestet werden |
| AlexaFluor 488 Ziege Anti-Maus IgG1 | Invitrogen | A21121 | Charge sollte getestet werden |
| Anti Oct4 mIgG2b (verwendet in 1:200 Verdünnung) | Santa Cruz | sc-5279 | Charge sollte getestet werden |
| Material/Ausrüstung: | |||
| Embryonale Fibroblasten der Maus (7 Millionen Zellen/Fläschchen) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Zellkulturschalen: 10 cm und 15 cm Platten, Zentrifugenröhrchen, FACS-Röhrchen, Pipetten, Pipette Tipps | |||
| Hämatozytometer | |||
| Glas-Zellkulturzentrifuge | |||
| Zellkultur-Inkubator (CO2, feuchtigkeits- und temperaturgesteuert) | |||
| Laminar-Flow-Haube für Zellkulturen mit eingebettetem Mikroskop | |||
| Biosicherheitshaube | für Zellkulturen | ||
| Zellsortiermaschine, i.e. MoFlo | |||
| Inverses Mikroskop | |||
| 1 ml TB Spritze 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Zellheber Polyethylen | Corning Incorporated | 3008 |
Referenzen
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.
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Nachdrucke und Genehmigungen
