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Methodenartikel

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

14K Aufrufe

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DOI:

10.3791/51609

⸱

22. Mai 2014

 ,  ,  , 
1Developmental Biology, Center for Stem Cell Biology, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 2St. Giles Laboratory of Human Genetics of Infectious Diseases, The Rockefeller University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Neuralleiste (NC)-Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hpSC) abgeleitet haben ein großes Potenzial für die Modellierung menschlichen Entwicklung und Krankheit und für die Zell-Ersatz-Therapien. Hier ein Feeder-freie Adaption des derzeit weit verbreitet In-vitro- Differenzierungsprotokoll für die Ableitung von NC-Zellen aus hPSCs dargestellt.

Zusammenfassung

Menschen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) haben ein großes Potenzial für die Untersuchung menschlichen embryonalen Entwicklung, für die Modellierung menschlichen Krankheiten in die Schüssel und als eine Quelle von transplantierbaren Zellen für regenerative Anwendungen nach der Krankheit oder Unfälle. Neuralleiste (NC)-Zellen sind die Vorläufer für eine Vielzahl von adulten somatischen Zellen, wie Zellen des peripheren Nervensystems und Glia, Melanozyten und mesenchymalen Zellen. Sie sind eine wertvolle Quelle der Zellen, um Aspekte der menschlichen embryonalen Entwicklung, einschließlich Zellschicksal Spezifikation und Migration zu untersuchen. Eine weitere Differenzierung der NC-Vorläuferzellen in terminal differenzierten Zelltypen bietet die Möglichkeit, menschliche Krankheiten zu modellieren in vitro untersuchen Krankheitsmechanismen und erzeugen Zellen für die regenerative Medizin. Dieser Artikel stellt die Anpassung eines derzeit in vitro Differenzierung Protokoll für die Ableitung von NC-Zellen aus hPSCs. Dieses neue Protokoll erfordert 18 Tagen unterschiedrentiation ist Feeder-frei, einfach skalierbare und hoch reproduzierbare unter humanen embryonalen Stammzellen (hES) Linien sowie menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Linien. Beide alten und neuen Protokolle ergeben NC-Zellen gleicher Identität.

Einleitung

Menschliche embryonale Stammzellen (hES) und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) haben immense Potenzial gezeigt, insbesondere für die Untersuchung und die künftige Behandlung von Krankheiten des Menschen, für die weder gut noch Tiermodellen primären Gewebe zur Verfügung. Anwendungsbeispiele für den HES / hiPSC Technologie sind die folgenden: Zellen von besonderem Interesse kann von hESC / hiPSCs für die regenerative Medizin in unbegrenzter Menge 1 erzeugt werden. Zellen von Patienten, die eine spezifische Krankheit hergestellt und verwendet, um in vitro Krankheitsmodellen 2,3 einzurichten. Solche Krankheitsmodelle können dann für große Wirkstoff-Screening auf der Suche nach neuer Wirkstoffe 4 sowie die Prüfung vorhandener Arzneimittel auf Wirksamkeit und Toxizität 5 eingesetzt werden. In-vitro-Krankheitsmodelle können zur Identifikation von neuen Krankheitsmechanismen führen. Für alle Anwendungen der HES / iPS-Technologie ist es wichtig, mit spezifischen arbeiten, gut zu definierenin der Krankheit von Interesse betroffen d Zelltypen. So ist die Verfügbarkeit von festen und reproduzierbare in vitro Differenzierung Protokolle von entscheidender Bedeutung für alle Anwendungen der hESC / hiPSC Technologie. Protokolle sind wünschenswert, die minimale Variabilität, Zeitaufwand, Mühe, Schwierigkeiten und Kosten sowie maximale Reproduzierbarkeit unter hESC / hiPSC Linien und verschiedene Forscher zeigen.

Neuralleiste (NC)-Zellen entstehen während der Wirbel Neurulation zwischen der Epidermis und dem neuronalen Epithel. Sie vermehren sich und wandern weitgehend in den sich entwickelnden Embryo und führen zu einer beeindruckenden Vielfalt der Nachkommen Zelltypen, einschließlich Knochen / Knorpel, kraniofazialen Skeletts, sensorische Nerven, Schwann-Zellen, die Melanozyten, glatte Muskelzellen, enterischen Neuronen, autonome Nervenzellen, chromaffinen Zellen , Herzscheidewand-Zellen, Zähne und Nebennieren / Schilddrüsenzellen 6. Somit NC-Zellen sind eine attraktive Zelltyp für die Stammzellfeld und wichtig für dieModellierung einer Vielzahl von Erkrankungen, wie Morbus Hirschsprung 7, familiärer Dysautonomie 8 sowie Krebserkrankungen, wie Neuroblastomen 9. Darüber hinaus bieten sie die Möglichkeit, Aspekte der menschlichen Embryonalentwicklung in vitro zu studieren.

Die derzeit verfügbaren und weit in vitro Differenzierung Protokoll für die Ableitung von NC-Zellen von hES 10,11 aufgebracht erfordert bis zu 35 Tage der Differenzierung und es beinhaltet neurale Induktion auf Stromazellen Feeder-Zellen, wie Zellen, MS5 und somit schlecht unter definierten Bedingungen durchgeführt. Zwar kann es sein skaliert, um große Mengen von NC-Zellen zu erzeugen, beispielsweise zum Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening-4 erforderlich ist, ist dieser arbeits-und kostenintensiv. Darüber hinaus geht es um Hand Passagieren neuronaler Rosetten, die schwer zu reproduzieren können und damit unterliegt der Gesamtvariabilität, insbesondere, wenn es um eine Vielzahl von menschlichen embryonalen Stammzellen oder hiPSC angewendet wirdLinien. Hier wird die schrittweise Ableitung NC-Zellen in einem 18-Tage-Protokoll, das frei von Feederzellen ist gezeigt. Dieses Verfahren ist kürzer und definiert als das aktuell verwendete Protokoll. Darüber hinaus ist es sehr robust bei der Erzeugung NC-Zellen unter verschiedenen hiPSC Linien. Wichtig ist, wird gezeigt, dass die NC-Zellen durch beide Protokolle ergab entstehen an der Grenze von neuralen Rosetten (im Folgenden als Rosette-NC oder R-NC). Die Verwendung eines der beiden Protokolle abgeleiteten Zellen morphologisch identisch aussehen, können sie die gleichen NC-Marker exprimieren und Cluster zusammen in der Microarray-Analyse. NC-Zellen mit dem neuen Protokoll (R-NC) abgeleitet sind funktional, ähnlich wie NC-Zellen mit dem alten Protokoll (MS5-R-NC), so dass sie wandern können und weiter zu differenzieren zu Neuronen abgeleitet. Daher können die Zellen gleichzeitig mit den MS5-R-NC-Zellen verwendet werden. Die R-NC-Zelle-Protokoll für die Ableitung von NC-Zellen, die aus menschlichen embryonalen Stammzellen / iPS nützlich für alle Anwendungen der HES / iPS-Technologie, die die NC-Linie sein.

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Protokoll

1. Herstellung von Nährmedien, beschichtetes Geschirr und Wartung von hPSCs

1.1 Medien-Vorbereitung

Hinweis: Filtern Sie alle Medien für die Sterilisation und bei 4 ° C im Dunkeln bis zu 2 Wochen. Reagenz Namen, Firmen-und Katalognummern werden in der Werkstoff-Tabelle aufgeführt.

  1. DMEM/10% FBS: Kombinieren 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep und 5 ml L-Glutamin.
  2. HES-Medium: Kombinieren 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml L-Glutamin, 5 ml Pen / Strep, 10 ml MEM Mindest essentiellen Aminosäuren-Lösung, 1 ml β-Mercaptoethanol. Werden 10 ng / ml FGF-2 nach dem Filtern des Mediums.
    ACHTUNG: β-Mercaptoethanol ist giftig, das Einatmen, Verschlucken und Hautkontakt.
  3. KSR-Differenzierungsmedium: Kombinieren 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-Glutamin, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM Mindest essentiellen Aminosäuren-Lösung und 1 ml β-Mercaptoethanol.
  4. N2-differentiatiauf mittel: Lösen Sie 12 g Pulver in DMEM/F12 980 ml ​​dH 2 O, 1,55 g Glucose hinzuzufügen, 2 g Natriumbicarbonat und 100 mg APO menschliches Transferrin. Mix 2 ml dH 2 O mit 25 mg Humaninsulin und 40 ul 1 N NaOH, die aufgelöste Lösung für das Medium. 100 l Putrescin-dihydrochlorid, 60 ul Selenit, 100 ul Progesteron und bringe das Volumen auf 1 L mit dH 2 O.

1.2 Beschichtung der Kulturschalen

  1. Matrigel-Beschichtung: Tauwetter 1 ml eingefroren Matrigel aliquoten durch Pipettieren von 19 ml DMEM/F12 über den aliquoten bis es sich aufgelöst hat. Klumpen entfernen, indem man es durch ein 40 um-Sieb und Zellplatte 8 ml/10 cm Schüssel. Geschirr Inkubation für 1 h bei RT. Saugen Sie den Matrigel unmittelbar vor dem Ausplattieren der Zellen.
    Hinweis: schnell arbeiten mit Matrigel, da es bei Temperaturen über 4 ° C verklumpen
  2. PO / Lam / FN-Beschichtung: 10 ml 1x PBS mit 15 ug / ml Poly-L-Ornithin Hydrobromid auf eine 10 cm-Schale. Inkubieren Sie die Schale über Nacht bei 37 ° C Waschen Platten mit 1x PBS einmal und fügen 10 ml/10 cm Schale aus 1x PBS mit 2 ug / ml Maus-Laminin-I und 2 pg / ml Fibronektin. Die Gerichte Inkubation über Nacht bei 37 ° C Vor der Beschichtung der Zellen, die Lösung vollständig zu entfernen und lassen die Platten gründlich trocknen bei RT für 15-20 min durch Stehen sie bis auf die Gewebekultur Haubenwand ohne den Deckel auf.
    Hinweis: Die Gerichte völlig trocken und bereit für die Zellbeschichtung, wenn man Kristallstrukturen auf der Oberfläche (sichtbar durch das Auge) zu sehen. Die Platten können bei Raumtemperatur für einige Stunden in diesem trockenen Zustand gehalten werden. PO / Lam / FN Gerichte haben bis 2 Tage vor der Zeit vorbereitet werden. In Notfällen können Lam / FN für nur 2-4 Stunden inkubiert werden. Dies kann jedoch suboptimal Differenzierung / Überlebensergebnisse riskieren.

1.3 Wartung von hPSCs

Hinweis: hPSCs auf 0,1% Gelatine und mitotisch inaktivierten embryonalen Maus-Fibroblasten (M gehaltenEF) im HES-Medium, ergänzt mit 10 ng / ml FGF-2, wie zuvor beschrieben 10,12. Die Zellen sollten alle 6-8 Tage aufgeteilt werden.

  1. Mantel eine 10-cm-Spiegel mit 8 ml 0,1% Gelatine (in 1x PBS ohne Magnesium oder Calcium) bei RT für 5 min.
  2. Tauen Sie gefrorene MEFs schnell in einem 37 ° C Wasserbad. In 1 Million MEFs auf 10 ml DMEM/10% FBS.
  3. Saugen Sie die Gelatine und die Platte die Zellen. Inkubieren bei 37 ° C für mindestens 6 Stunden.
  4. Saugen Sie den DMEM/10% FBS aus dem vorbereiteten MEF Platte, Waschplatte mit 1x PBS und einmal mit 10 ml HES-Medium mit 10 uM Y-27632-dihydrochlorid ergänzt. Das Medium zum Aufwärmen bei 37 ° C für 20 min.
    Anmerkung: Für die manuelle Aufspaltung hPSCs einer Steril mit einem eingebetteten Mikroskop verwendet wird. Jedoch können die Zellen unter Verwendung von geeigneten alternativen Verfahren passagiert werden.
  5. Unter einer Steril mit einem eingebetteten Mikroskop lösen einzelnen Kolonien mit einem Zellheber und lassen Sie sie schweben.
  6. Verwenden Sie ein1-ml-Spritze, um die schwimmende Kolonien absaugen und versenden Sie sie auf den frischen, warmen MEF Platte. Übertragen etwa ein Viertel der Zellen in die neue Schale. Bei 37 ° C.
  7. Feed-Zellen täglich mit frischen HES Medium.

2. Überzug von hPSCs für Differenzierung

Hinweis: hPSCs aufgeteilt werden soll oder überzogen für die Differenzierung, wenn die Kolonien groß sind, aber immer noch scharfe Kanten haben, mit so wenig wie möglich zu differenzierenden Zellen an ihren Grenzen (siehe Abbildung 1B). Wenn die Zellen unter Verwendung manueller Passage aufrechterhalten die Kolonien groß genug, um leicht mit dem Auge gesehen werden kann. Um das richtige Gefühl für diese Zeit Punkt kann man einen separaten hpSC Gericht für zwei Wochen ohne Passagieren warten und beobachten, wie die Zellen zu erreichen und geben den idealen Zeitpunkt für die Passage / zu differenzieren sind.

  1. Bereiten 10 cm Gerichte mit Matrigel 1 Stunde vor Beginn der Differenzierung. Erfolgreiche Matrigel Beschichtung kannmit 4-facher Vergrößerung überprüft.
  2. Wenn die hPSCs bereit sind, aufgeteilt werden, saugen Sie den mittel-und 4 ml 0,05% Trypsin-EDTA zu den Zellen.
  3. Schütteln Sie die Schüssel horizontal für 2 min kräftig, bis man die MEFs als Einzelzellen Abheben der Platte unter dem Mikroskop zu sehen. Die hpSC Kolonien bleiben als Kolonien befestigt.
  4. Sofort und gründlich absaugen Trypsin und lassen die Platte stehen bei RT für 2-4 min.
  5. 2 ml HES-Medium auf die Platte und mit einer Pipette P1000, nehmen die Zellen.
    Hinweis: Wenn die Zellen nicht von der Oberfläche leicht angehoben werden, kann die Platte leer bei RT für weitere 2-3 min inkubiert werden.
  6. Übertragen Sie die Zellen, die 8 ml HES-Medium mit 10 uM Y-27632-dihydrochlorid ergänzt.
  7. Saugen Sie den Matrigel aus einer zuvor hergestellten 10 cm Schüssel. Platte die Zellen in einem Verhältnis 1:1 oder 1:2 (zum Beispiel: Die Zellen aus einem 10-cm-Spiegel sind in zwei 10 cm-Schalen aufgeteilt) auf die Matrigel Platte. Bei 37 °C über Nacht.
    Hinweis: Diese Beschichtung sollte in etwa 100.000 Zellen / cm 2 führen.

3. Induktion der Differenzierung Neural

Hinweis: Die Differenzierung eingeleitet (Tag 0), wenn die Zellen 90-100% konfluent (siehe Fig. 1C), üblicherweise am folgenden Tag. Wenn der genaue Konfluenz noch nicht erreicht ist, können die Zellen täglich mit HES-Medium zugeführt werden, bis sie bereit zur Differenzierung. Alternativ kann die Anfangszahl der plattierten Zellen erhöht werden.

  1. Am Tag 0 bis 3, füttern die Zellen täglich mit 10 ml/10 cm austeilen KSR-Differenzierungsmedium mit 0,1 uM LDN193189 und 10 uM SB431542.
  2. Am Tag 4 und 5 Futter die Zellen mit 75% KSR-Differenzierungsmedium und 25% N2-Differenzierungsmedium enthält sowohl LDN193189 und SB431542.
  3. Am Tag 6 und 7 Futter die Zellen mit 50% KSR-Differenzierungsmedium und 50% N2-Differenzierungsmedium sowohl LDN193189 und SB4 enthalten31542.
  4. Am Tag 8 und 9 Futter die Zellen mit 25% KSR-Differenzierungsmedium und 75% N2-Differenzierungsmedium enthält sowohl LDN193189 und SB431542.
  5. Am Tag 9 und 10 bereiten PO / Lam / FN Gerichte wie in 1.2.2 für Replattierung der Zellen am Tag 11 angedeutet.
  6. Am Tag 10 Futterzellen mit N2-Differenzierungsmedium enthält LDN193189 und SB431542.

4. Replattierung in Tröpfchen für NC-Daten

  1. Am Tag 11 absaugen Lam / FN von den zuvor hergestellten Platten und sie vollständig trocknen bei RT für 20-30 min, wie in 1.2.2 erläutert zu lassen.
  2. Entfernen Sie das Medium aus den differenzierenden Zellen, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und 1x 8 ml accutase/10 cm Schüssel. Inkubation für 20 min bei 37 ° C.
  3. Die Verwendung eines Handys Heber, nehmen die Zellen und resuspendieren sie in Accutase mit einer 5 ml Pipette. Die Suspension in einem 15-ml-Tube.
  4. 5 ml 1 × PBS und drehen die Zellen 5 min bei 114 x g.
  5. Resuspendieren der Zellen in 10 ml 1x PBS. Um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten, filtern sie durch eine 40 um Zellsieb und zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer oder gleichwertige Technik.
  6. Dreh die Zellen nach unten und resuspendieren sie in N2-Differenzierungsmedium, das 200 uM Ascorbinsäure (AA), 20 ng / ml BDNF, 100 ng / ml FGF8, 20 ng / ml SHH, 10 uM Y-27632 Dihydrochlorid bei der Konzentration von 100.000 -150.000 Zellen/10 ul.
  7. Mit ein Wiederholungs-Pipetten, Platte 10 ul Tröpfchen nahe beieinander, ohne sie zu berühren auf die getrocknete PO / Lam / FN 15 cm Gerichte.
    Hinweis: Ein 10-cm-Spiegel von differenzierten Zellen führt in der Regel etwa 2-3 mal 15 cm Geschirr oder ca. 100 x 10 cm ul droplets/15 Gericht.
  8. Lassen Sie die Tropfen stehen bei RT für 20-30 min, dann sehr vorsichtig (nicht zu stören die Tropfen) 30 ml N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y und bei 37 ° C
  9. Am Tag 12 sorgfältig füttern die Zellen mit 20 ml/15 cm Schale N2/AA/BDNF/FGF8/SHH.
  10. Von day 14-17 füttern die Zellen jeden zweiten oder dritten Tag mit N2/AA/BDNF/FGF8.
  11. Am Tag 16 und 17 vorzubereiten PO / Lam / FN Platten NC-Zellen nach FACS-Sortierung Ausstrich.

5. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) von NC-Zellen

Anmerkung: Die Vorbereitung der Zellen für die FACS erfordert etwa 2 Stunden.

  1. Am 18. Tag entfernen Medium, waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS in die Schüssel und fügen Sie 12 ml Accutase. Die Zellen für 20 min bei 37 ° C.
  2. Die Verwendung eines Handys Heber, nehmen die Zellen von der Oberfläche und lassen Sie sie schweben. Pipettieren Sie die Zellen in Suspension mit einer 5 ml Pipette, übertragen Sie sie auf einer 50-ml-Tube und 30 ml 1x PBS. Dreh die Zellen 5 min bei 114 x g.
  3. Verwendung einer P1000-Pipette resuspendiert die Zellen in 1 ml 2% FBS / HBSS (HBSS enthält 15 mM HEPES). Hinzufügen von 19 ml 2% FBS / HBSS, und die Zellen filtriert durch ein 40 &mgr; m Zellsieb um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten. Die Zellen auf Eis inkubieren 15 min für die Antikörper-Blocking und dann zählen sie mit einer Zählkammer.
  4. Dreh die Zellen nach unten und wieder zu suspendieren sie bei der Konzentration von 10 Millionen Zellen / ml in 2% FBS / HBSS.
  5. Beiseite 1 Million Zellen, die jeweils für die ungefärbten, single-gefärbt (HNK-1 nur und nur p75) und sekundären Antikörper gefärbt nur (APC nur und nur 488) FACS steuert.
  6. In 5 ul der HNK-1 und 5 ul p75 primären Antikörper pro 10 Millionen Zellen in 1 ml Suspension auf die richtigen Proben und Inkubation für 20 min auf Eis.
  7. Waschen der Zellen in 10 ml 1x PBS (Zentrifuge 5 min bei 114 × g) und Resuspendieren der Zellen in 1 ml 2% FBS / HBSS. In 2 ul APC und 1 ul von 488 sekundären Antikörper pro 10 Millionen Zellen in 1 ml Suspension auf die richtigen Proben und Inkubation für 20 min auf Eis im Dunkeln.
    Hinweis: APC und 488 sind die sekundären Antikörper verwendet hier für das HNK-1-und p75-Färbung auf.
  8. Die Zellen werden in 10 ml 1x PBS zweimal resuspendiert 10 Millionen Zellen in 500 &mgr; l2% FBS / HBSS mit DAPI (0,5 ng / ul) oder alternativ entsprechende Live-Cell-Fleck auf toten Zellen von der FACS-Analyse auszuschließen.
  9. Übertragen Sie die Proben auf FACS-Röhrchen eignen.
  10. Bereiten FACS-Röhrchen mit 0,5 ml 2% FBS / HBSS für Zellsammlung.
    Hinweis: Die Zellen und das Entnahmeröhrchen auf Eis im Dunkeln während des Sortier Zeit gehalten.
  11. Mit Hilfe eines Zellsortiermaschine mit Laser, die DAPI, APC und 488 sortieren DAPI-/HNK-1 + / P75 + doppelt positiven Zellen erkennen kann.
    Hinweis: Zubereitungszeit und die Handhabung der Zellen führt zu einem geringen Prozentsatz des Zelltods, ermöglicht DAPI Flecken toten Zellen und damit nur diese Zellen aus der sortierten Population auszuschließen. Jede Alternative Live / Dead-Färbung funktioniert genauso gut für diesen Zweck. DAPI selbst nicht Zytotoxizität verursachen in der Live-Zellpopulation.

6. Replattierung der sortierten Zellen, NC Wartung und Erweiterung

Hinweis: FACS sortierten Zellen sollten Hand seinführte mit besonderer Sorgfalt, um eine optimale Überleben zu sichern. Halten Sie sie auf Eis, bis sie Neubelegung. Vortexen nicht oder pipettieren sie barsch. Die Zellen können durch Schwenken der Röhre resuspendiert werden.

  1. Nach FACS-Sortierung, zählen die NC-Zellen, dann drehen sie auf und resuspendieren in N2-Differenzierungsmedium mit 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF und 10 uM Y-27632 dihydrochlorid in dem Volumen und gegebenenfalls ergänzt, um sie bei 30.000 Zellen Ausstrich / 10 ul Tröpfchen.
  2. Gründlich trocken zuvor hergestellten PO / Lam / FN-Platten und Platten etwa 50-70 Tropfen pro 10 cm Schale. Lassen Sie die Gerichte stehen bei RT für 20-30 min.
  3. 20 ml/10 cm Gericht N2/FGF2/EGF/Y-27632 Sehr vorsichtig hinzufügen, ohne die Tropfen zu stören. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C.
  4. Füttern Sie die Zellen alle 2-3 Tage mit N2/FGF2/EGF.
    Hinweis: NC-Zellen erweitert oder agiert etwa alle 4-5 Tage oder, wenn sie beginnen häufen sich in den Tröpfchen.
  5. Um Durchgang die NC-Zellen, entfernen Sie das Medium, wash die Zellen einmal mit PBS und 1x 8 ml accutase/10 cm Schüssel. Inkubation für 20 min bei 37 ° C.
  6. Pipettieren Sie die Zellen von der Platte mit einer 5 ml Pipette und übertragen Sie sie auf einem 15-ml-Tube. In 6 ml 1x PBS.
  7. Dreh die Zellen 5 min bei 114 x g.
  8. Resuspendieren der Zellen in N2-Differenzierungsmedium mit 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF und 10 uM Y-27632-dihydrochlorid um 20.000 Zellen/10 ul Tröpfchen ergänzt haben.
  9. Ausstrich die Zellen in 10 ul Tröpfchen auf getrocknet PO / Lam / FN-Platten. Lassen Sie die Gerichte stehen bei RT für 20-30 min.
  10. Vorsichtig 20 ml/10 cm Gericht N2/FGF2/EGF/Y-27632. Bei 37 ° C.
    Anmerkung: NC-Zellen aufrechterhalten oder für bis zu 2 Wochen als relativ homogene Vorläuferpopulation expandiert werden. Längere Kultur kann dazu führen, in diverse Nachkommen Zelltypen differenzieren.

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Ergebnisse

Die beiden wichtigsten Verbesserungen der R-NC-Protokoll über die MS5-R-NC-Protokoll 11 der Feeder-frei, definiert Differenzierungsbedingungen und die allgemeine Verkürzung der Zeitbedarf. MS5 Feeder-Zellen sind 13 Maus-Knochenmark-abgeleiteten Stromazellen, die gezeigt haben, neuronale Differenzierung von hES-Zellen 14 zu unterstützen. HESCs kultiviert auf MS5 Feeder-Zellen bei einer Dichte Form epithelialen Strukturen niedrig und neuronalen Rosetten 15, an der Peripherie der...

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Diskussion

Für die erfolgreiche Differenzierung von R-NC-Zellen, die aus menschlichen embryonalen Stammzellen / hiPSCs die folgenden Überlegungen sollten gemacht werden. Es ist kritisch, unter sterilen Kulturbedingungen jederzeit arbeiten. Insbesondere ist es wichtig, hpSC Kulturen für Mykoplasmen regelmäßig zu prüfen, da diese Kontamination erfolgreich Differenzierung behindern, aber nicht ohne weiteres visuell in hpSC Kulturen. Die R-NC Differenzierung sollte bei 90-100% Zelldichte eingeleitet werden; niedriger Zelldichte wirkt ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Danksagungen

Und dem Tri-institutionellen Stammzellen-Initiative (Starr-Stiftung); Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium für fortgeschrittene Forschende des Schweizerischen Nationalfonds und durch Zuschüsse aus NYSTEM (C026447 C026446) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMGibco-Life Technologies11965-092
Fötales Rinderserum (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
DMEM/F12Gibco-Life Technologies11330-032
Knockout Serum ErsatzGibco-Life Technologies10828-028Los sollte getestet werden
L-GlutaminGibco-Life Technologies25030-081
Gibco-Life Technologies15140-122
MEM Lösung für essentielle AminosäurenGibco-Life Technologies11140-050
β-Mercaptoethanol Gibco-Life Technologies21985-023toxisches
rekombinantes humanes FGF basic (FGF2)R& D Systems233-FB-001MG/CF
Knockout DMEMGibco-Life Technologies10829-018
DMEM/F12 Pulver Invitrogen12500-096
GlukoseSigmaG7021
NatriumbicarbonatSigmaS5761
APO humanes TransferrinSigmaT1147
Humaninsulin SigmaI2643
PutriscindihydrochloridSigmaP5780
SelenitSigmaS5261
ProgesteronSigmaP8783
MatrigelmatrixBD Biosciences354234
Poly-L Ornithin HydrobromidSigmaP3655
Maus Laminin-IR& Ampere; D Systems3400-010-01
FibronektinBD Biosciences356008
Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/mlStem Cell Technologies7013
Trypsin-EDTA Gibco-Life Technologies25300-054
Y-27632 DihydrochloridTocris-R& D Systems1254
LDN193189Stemgent04-0074
SB431542Tocris-R& D Systems1614
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Ascorbinsäure SigmaA4034
BDNFR& D Systems248-BD
FGF8F& Technik D Systems423-F8
Maus rekombinanter Schalligel (SHH)R& D Systems464SH
HBSSGibco-Life Technologies14170-112
HEPESGibco-Life Technologies1563-080
Rekombinante EGFF& Technik D Systems236EG
Gelatine (PBS ohne Mg/Ca)hauseigene
Antikörper:
Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgMSigmaC6680-100TSTCharge sollte getestet werden
Anti-p75 mIgG1 (Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor)Advanced Targeting SystemsAB-N07Charge sollte getestet werden
APC Ratte Anti-mIgMBD Parmingen550676Charge sollte getestet werden
AlexaFluor 488 Ziege Anti-Maus IgG1 InvitrogenA21121Charge sollte getestet werden
Anti Oct4 mIgG2b (verwendet in 1:200 Verdünnung)Santa Cruzsc-5279Charge sollte getestet werden
Material/Ausrüstung:
Embryonale Fibroblasten der Maus (7 Millionen Zellen/Fläschchen)GlobalStemGSC-6105M
Zellkulturschalen: 10 cm und 15 cm Platten, Zentrifugenröhrchen, FACS-Röhrchen, Pipetten, Pipette Tipps
Hämatozytometer
Glas-Zellkulturzentrifuge
Zellkultur-Inkubator (CO2, feuchtigkeits- und temperaturgesteuert)
Laminar-Flow-Haube für Zellkulturen mit eingebettetem Mikroskop
Biosicherheitshaubefür Zellkulturen
Zellsortiermaschine, i.e. MoFlo
Inverses Mikroskop
1 ml TB Spritze 27Gx1/2BD Biosciences309623
Zellheber PolyethylenCorning Incorporated3008
Penicinlin/Streptomycin

Referenzen

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Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen
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