Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur seriellen Probenahme von Femurknochenmark (BM), ohne dass Mäuse getötet werden müssen. Dieses Verfahren ermöglicht Längsschnittstudien der BM-Zusammensetzung von Mäusen im Zeitverlauf und ermöglicht den seriellen Zugang zu Zellen innerhalb des BM für ex vivo- und Transplantationsstudien.
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Methodenartikel
Oberschenkelknochenmark-Aspiration im Live-Mäuse
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die serielle Probenahme der zellulären Zusammensetzung des Knochenmarks (BM) ist ein routinemäßiges Verfahren, das für die klinische Hämatologie von entscheidender Bedeutung ist. Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes schrittweises technisches Verfahren für ein analoges Verfahren an lebenden Mäusen, das eine serielle Charakterisierung von im BM vorhandenen Zellen ermöglicht. Dieses Verfahren ermöglicht Studien, die darauf abzielen, das Vorhandensein von exogen verabreichten Zellen im BM von Mäusen nachzuweisen, wie dies beispielsweise in Xenotransplantat-Studien der Fall wäre. Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren die Entnahme und Charakterisierung von Zellen, die mit dem BM angereichert sind, wie z. B. hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs), ohne dass Mäuse getötet werden müssen. Angesichts der Tatsache, dass die zelluläre Zusammensetzung des peripheren Blutes nicht unbedingt die Proportionen und Arten der im Knochenmark vorhandenen Stamm- und Vorläuferzellen widerspiegelt, sind Verfahren, die den Zugang zu diesem Kompartiment ermöglichen, ohne dass die Mäuse beendet werden müssen, sehr hilfreich. Die Anwendung der femoralen Knochenmarkaspiration wird hier für die zytologische Analyse von Knochenmarkzellen, die durchflusszytometrische Charakterisierung des hämatopoetischen Stamm-/Vorläuferkompartiments und die Kultivierung von sortierten HSPCs, die durch femorale BM-Aspiration gewonnen wurden, im Vergleich zur konventionellen Knochenmarkentnahme veranschaulicht.
Einleitung
Alle Blutzellen stammen aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs). Verfahren, die den Zugang zum Knochenmark (BM) ermöglichen, dem Ort der überwiegenden Mehrheit der HSCs bei Mäusen und Menschen, ohne dass Tiere getötet werden müssen, bieten eine Ressource zur seriellen Überwachung der Quelle der Hämatopoese. Das übergeordnete Ziel des hier beschriebenen Verfahrens besteht darin, ein detailliertes Protokoll für die Probenahme von BM-Zellen aus dem Oberschenkelknochen lebender Mäuse bereitzustellen, das repräsentatives Material für die Zellen liefert, das durch konventionelle Ernte von BM-Zellen durch Tötung der Mäuse gewonnen würde. Der Vorteil dieses Verfahrens gegenüber der herkömmlichen Entnahme von BM-Zellen besteht darin, dass dieses Verfahren keine Tötung von Mäusen erfordert und daher eine Längsschnittuntersuchung des Knochenmarkkompartiments von Mäusen im Laufe der Zeit ermöglicht.
Obwohl dieses Verfahren zur Knochenmarkaspiration bei Mäusen in einer Reihe von Studien verwendet und bereits beschrieben wurde (siehe Sundberg et al. Für einen historischen Rückblick1) wurden bisher keine formalen Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Veranschaulichung dieser Technik veröffentlicht. Dieses Protokoll ermöglicht die routinemäßige Serienprobenahme des BM zu Zwecken wie der Beurteilung der Transplantation von Zellen, die exogen in die Maus eingeführt wurden, in den BM (wie dies in Xenotransplantat-Studien der Fall wäre, z. B.2,3), der Analyse des Chimärismus im BM zum Vergleich mit dem des peripheren Blutes (wo die Ergebnisse nicht unbedingt kongruent sind), der Überwachung der Häufigkeit bestimmter Zelltypen, die normalerweise im Knochenmark angereichert sind, wie z. B. hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen; und Entnahme von BM-Zellen für ex vivo-Kulturen und/oder Transplantationen. Darüber hinaus kann die Bestimmung des Knochenmarkgehalts in Mausmodellen hämatologischer Erkrankungen sehr nützlich sein, da die Aspiration bei der Beurteilung der hämatologischen Krankheitslast zu Zeitpunkten hilfreich ist, zu denen die Erkrankung im peripheren Blut möglicherweise nicht offensichtlich ist3-5. Darüber hinaus kann diese Technik verwendet werden, um das Ansprechen hämatologischer Erkrankungen im Knochenmark auf Arzneimittel zu bewerten, die in therapeutischen Studien verabreicht wurden. Daher ist das hier beschriebene Verfahren ideal für Forscher, die Zugang zu hämatopoetischen Knochenmarkzellen von Mäusen für zytologische Analysen, durchflusszytometrische Analysen, In-vitro-Kultivierungen und/oder In-vivo-Transplantationsstudien erhalten möchten, ohne dass die Mäuse geopfert oder geschädigt werden müssen.
Das hier beschriebene Protokoll für die Probenahme von BM ist der Technik, die für die intrafemorale Injektion von Material direkt in die Knochenmarkhöhle verwendet wird, sehr ähnlich3,6. Der Hauptunterschied besteht darin, dass dieses Protokoll das Verfahren zur Entnahme von Zellen aus dem Knochenmark detailliert beschreibt, im Gegensatz zur direkten Instillation von Material in den Knochenmarkhöhlenraum, wie es bei der intrafemoralen Injektion der Fall ist.
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Protokoll
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUCs) am Memorial Sloan-Kettering Cancer Center genehmigt.
1. Aspiration von Knochenmark (BM) Zellen aus dem Femur
- Anesthetize die Maus, die Oberschenkelknochenmarkpunktion mit Isofluran (1-4%) mit einer Genauigkeit Verdampfer verabreicht unterziehen wird. Narkosetiefe sollte alle 5-10 min durch die Beobachtung, dass es keine Veränderung der Atemfrequenz mit chirurgischen Manipulation und / oder Ohr, Zehen und Schwanz Prise verbunden überwacht werden während des gesamten Verfahrens. Anästhesie mit Isofluran induziert und auch während des gesamten Verfahrens mit Isofluran aufrechterhalten. Ein Bezugs vorprozessualer Dosis von Buprenorphin in einer Dosis von 0,05-0,1 mg / kg subkutan alle 6-12 Stunden können verwendet werden, um Schmerzen, die mit dem Verfahren als adj zugeordnet verhindernUNCT zu der Carprofen.
- Anwenden Augensalbe für die Augen der Maus nach der Induktion der Anästhesie von Hornhaut Trocknen zu verhindern.
- Das Fell wird vorsichtig von einem Hautbereich etwa 150% größer als die Fläche des beabsichtigten Aspiration Seite abgeschnitten. Lose Fell mit einem feuchten Gaze entfernt. Bitte halten Sie die Maus auf einem umlauf warmem Wasser Pad oder andere sichere thermostatisch gesteuerte Oberfläche zu Unterkühlung während des Verfahrens zu verhindern.
- Desinfizieren Sie die gesamte Bein mit der Oberschenkelknochen, die Streben mit drei Sätzen von Wechsel Peelings (abwechselnd entweder mit einem PVP-Jod (Betadine) oder Chlorhexidin (Nolvasan) Peeling und 70% igem Alkohol oder 70% Ethanol getränkten Gaze Schwämme) unterzogen werden.
- Befeuchten Sie ein 0,5 ml Tuberkulin-Spritze (Volumen: 0,5 cm ³; Weite: 27,5 G) mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), bevor Absaugen des BM. Füllen Sie die Spritze mit 200-500 ul PBS und sofort vertreiben die PBS. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2-3 times.
- Halten Sie das Schienbein gebogen vom Oberschenkelknochen durch Drücken der Tibia entweder mit dem Ringfinger oder dem fünften Finger. Zu bestätigen, dass eine geeignete Anästhesieebene erreicht ist. Die Spritze wird mit dem Daumen und dem Zeigefinger gehalten wird. Dies ermöglicht die Kondylen ausgesetzt sein und erleichtert das Einführen der Nadel.
- Nach Benetzung der Spritze und stechen Sie die Nadel durch die Patellasehne, sodass die Nadel sicher zwischen den beiden Kondylen des Oberschenkelknochens eingelegt. Durch Halten der Diaphyse der Nähe der Epiphyse des Femurs mit dem Daumen und dem Zeigefinger wird die Nadel in den Schaft des Oberschenkelknochens leicht eingeführt.
- Schwenken der Nadel nach außen und oben, so daß sie parallel mit der Achse des Femurs ist. Diese Maßnahme erleichtert Abruf von Knochenmark Inhalte aus dem Femurschaft.
- Drehen Sie die Nadel im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn und schieben Sie sie langsam in die Oberschenkelmarkhöhle. Überprüfen Sie die korrekte Positionierung der Nadel durch leichtes Bewegen des syRinge seitlich.
- Ziehen Sie die Nadel Kolben zurück, wodurch Unterdruck, während Sie die Nadel hin und her in der BM Höhle. Hinweis: Das Volumen des angesaugten BM ungefähr 5 &mgr; l entspricht, die typischerweise 0,4-0,8 x 10 &sup6; mononukleare Zellen sein. Erfolgreiche Aspiration wird visuell durch das Auftreten von Blut in der Spitze der Nadel in der Basis der Spritze bestätigt werden. Wenn kein Blut in der Spritze gesehen ist es wahrscheinlich, daß ein kleiner Knochen oder Gewebefragment in der Nadel stecken. Dies kann von der Nadel durch Bewegen des Kolbens nach oben und unten in PBS (dies ist ein Grund, warum der Spritze sollte mit PBS vor dem Absaugen des BM vorgefüllt werden) entfernt werden. Wenn das Gewebe nicht aus der Spritze verdrängt werden, verwenden Sie eine neue Nadel und Spritze (wieder nass die Spritze mit 200-500 ul PBS).
- Sobald BM erfolgreich von der Oberschenkelknochen angesaugt, entfernen Sie die Nadel und Spritze aus dem Oberschenkelknochen und Maus.
- Bewegen saugten BM zu einem Mikrozentrifugenröhrchen prmit 500 ul PBS efilled. Für die meisten Anwendungen, die BM-Zellen sollten dann auf Eis bis zur weiteren Verarbeitung, wenn möglich gehalten werden.
- Nach Abschluss des Verfahrens, verwalten Analgetikum mit Carprofen 5 mg / kg subkutan. Entfernen Sie dann mit der Maus aus der Narkose und legen Sie auf einem Heizkissen, bis vollständig erholt. HINWEIS: Es sollte keine Komplikationen oder Stress erlebt nach der Aspiration Verfahren, wenn es richtig gemacht ist.
- Vor der Rückkehr Mäuse mit dem Gehäuse-Bereich, sicherzustellen, dass sie in der Lage, ambulate und Nahrung und Wasser zu erreichen sind. Beachten Sie die Mäuse auf Anzeichen von Stress oder Infektionen nach dem Eingriff in der nächsten 24 Stunden. Symptome sind: konstant Blutungen, Anämie, Lethargie. Wenn eines dieser Zeichen sind nach dem Eingriff zu sehen ist, sollte das Tier (e) eingeschläfert werden. Hinweis: BM Aspiration / Probenahme kann wiederholt werden, aber der Vorgang wiederholen sollte auf der gegenüberliegenden Oberschenkelknochen wiederholt Trauma der gleichen Bein verhindern, durchgeführt werden. Es gibt wenig Informationen über die frequency dass BM Aspiration durchgeführt werden. Oberschenkelknochenmarkpunktion ist in der Regel nicht häufiger als alle 2 Wochen wiederholt.
2. Beurteilung der Zellgehalt in Aspirated BM Cells
- Pellet-Zellen aus BM Aspiration und in ein Mikrozentrifugenröhrchen durch Zentrifugation bei 300 g für 5 min abgerufen bei 4 ° C oder RT.
- Saugt den Überstand und das Pellet in 500 &mgr; l von roten Blutkörperchen ACK-Lysepuffer ("Ammoniumchlorid-Kalium" Lysepuffer).
- Die Zellen in rot Zelllysepuffer Inkubation für 10 min und dann 1 ml PBS und Spin-Down der Mischung wieder bei 300 g für 5 min bei 4 ° C oder RT. Hinweis: Die roten Blutkörperchen lysiert Pellet besteht nun aus BM mononukleären Zellen. Diese können für FACS-Färbung, Zellzählung, Transplantation, Zytospin Analyse und / oder einer anderen Nutzung (wie BM-Zellen von Mäusen geerntet geopfert würde verwendet werden) resuspendiert werden.
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Ergebnisse
Oberschenkel BM Aspiration von einer Live-C57/B6 Maus wurde genutzt, um BM mononuklearen Zellen, gefolgt von herkömmlichen BM Ernte der gleichen Maus nach der Opfer zu erhalten. BM mononukleären Zellen durch die beiden Verfahren erhalten wurden dann mit (1) zytologische Analyse der BM-Zellen untersucht, (2) Bestimmen der relativen Häufigkeit von hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen (HSPCs) und (3) ex-vivo-Kultur von sortierten HSPCs. Im letzteren Experiment linien negativen Sca1 + c-Kit wurden + (LSK)...
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Diskussion
Serien BM Anspruch ist ein Routineverfahren entscheidend für die klinische Untersuchung von hämatologischen Erkrankungen beim Menschen. Die Fähigkeit, einen analogen seriellen Abtastung BM in Mäusen für die Charakterisierung der zellulären Zusammensetzung und Bestandteile BM gesamten langwierigen Experimente ebenfalls sehr wertvoll. Dieses Verfahren ist nützlich für die Charakterisierung von HSPC, ohne Einbußen bei der Maus, sondern auch zum Nachweis der Anwesenheit von zusätzlichen Zelltypen im Knochenmark in Fällen, i...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
O.A.-W. wird unterstützt durch einen NIH K08 Clinical Investigator Award (1K08CA160647-01), einen U.S. Department of Defense Postdoctoral Fellow Award in Bone Marrow Failure Research (W81XWH-12-1-0041), das Josie Roberston Investigator Program und einen Damon Runyon Clinical Investigator Award mit Unterstützung der Evan's Foundation.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Rinderserumalbumin | PAA | K41-001 | |
| ACK Lysepuffer | Hausgemacht | in 1 L. pH 7,2 ~ 7,4 einstellen und steril filtrieren mit 0,22 μ m Vakuumfilter. | |
| 8,3 g Ammoniumchlorid | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g Kaliumbicarbonat | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μ l 0,5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0,5 ml Tuberkulinspritze 27,5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| Steriles Zellsieb 70 μ m | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isofluran, USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| Nadel mit stumpfem Ende | Stemcell Technologies | 28110 | |
| PrecisionGlide-Nadel 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| 3 ml Spritze Luer-Lok-Spitze | Becton Dickinson 309657 | ||
| Platte, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurde, 6 Well | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm 5 ml Tuben | Becton Dickinson | 352054 | FACS Färbung |
| 12 x 75 mm 5 ml Gefäße mit Cello-Sieb-Kappe | Becton Dickinson | 352235 | FACS Färbung |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | ||
| Ly-6G und Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | ||
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | Für Methocellulosekultur |
| Carprofen | Crescent Chemical Unternehmen | C11045850 | 1 Dosis (5 mg/kg) |
| Durchflusszytometer, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube Tierarztsalbe (sterile Vaseline-Augensalbe) | Dechra-US | 17033-211-38 |
Referenzen
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
- Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
- Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
- Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).
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