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Methodenartikel

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

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⸱

DOI:

10.3791/51669

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6. August 2014

 ,  , 
1Light Microscopy Core Facility, NHLBI/NIH, 2Hematology Branch, NHLBI/NIH

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

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Zusammenfassung

Kombinatorische 5 fluoreszierenden Proteinen markiert von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen in vivo ermöglicht klonalen Tracking über die konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, die einen Einblick in die Knochenmark blutbild Architektur während der Regeneration. Dieses Verfahren ermöglicht nicht-invasive Abbildung von Schicksal spektral kodierten HSPCs abgeleiteten Zellen in intaktem Gewebe für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation.

Zusammenfassung

Wir entwickelt und validiert eine Fluoreszenzmarkierung Methode zur Verfolgung von klonalen hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo Blutbildung zu studieren mit der Maus-Knochenmark-Transplantation experimentellen Modell. Genetische kombinatorische Markierung mit lentiviralen Vektoren fluoreszierende Proteine ​​(RP) kodiert, aktiviert das Zellschicksal Mapping durch moderne Mikroskopie. Vektoren fünf verschiedenen Rahmenprogrammen codiert Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato und mCherry wurden verwendet, um gleichzeitig zu transduzieren HSPCs, Schaffung einer vielfältigen Farbpalette markierten Zellen. Imaging mittels konfokaler / Zwei-Photonen-Mikroskopie Hybrid ermöglicht die gleichzeitige hochauflösende Beurteilung der eindeutig gekennzeichneten Zellen und deren Nachkommen in Verbindung mit strukturellen Komponenten der Gewebe. Volumenanalysen über große Flächen zeigen, dass spektral kodierten HSPC-abgeleiteten Zellen nicht-invasiv in verschiedenen intakten Geweben, einschließlich Knochenmark nachgewiesen werden (BM) Für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation. Live-Studien die Kombination von Video-Multirate und konfokaler Zeitraffer-Bildgebung in 4D zeigen die Möglichkeit der dynamischen zellulären und klonalen Tracking in quantitativer Weise.

Einleitung

Die Produktion von Blutzellen, genannt Hämatopoese durch eine kleine Population von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) gehalten. Diese Zellen befinden sich im Knochenmark (BM) in einer komplexen Mikroumgebungs Nische, bestehend aus Osteoblasten, Stromazellen, Fettgewebe und Gefäßstrukturen, die alle in der Steuerung der Selbsterneuerung und Differenzierung 1,2 gebracht. Als intakte BM traditionell unzugänglich direkte Beobachtungen wurde, bleibt die Wechselwirkungen zwischen HSPC und ihre Mikroumgebung in vivo weitgehend charakterisiertes. Bisher haben wir eine Methodik, um die 3D-Architektur von intakten BM mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie und Reflexion 3 zu visualisieren. Wir gekennzeichnet Ausbau der EGFP-markierte HSPCs in der BM, aber die Verwendung von nur einer einzigen FP ausgeschlossen Analyse der Regeneration bei einer klonalen Ebene. Erst vor kurzem haben wir den Vorteil des lentiviralen Gene Ontology (Lego)-Vektoren, die konstitutiv fluorescent Proteine ​​(RP), um effizient zu markieren Zellen 4,5. Co-Transduktion HSPC mit 3 oder 5-Vektoren erzeugt eine vielfältige Palette von kombinatorischen Farben, so dass Tracking von mehreren Einzel HSPC Klonen.

Markiert HSPC mit neuen Imaging-Technologie erlaubt, einzelne HSPC Homing und Transplantation in der BM von bestrahlten Mäusen Spuren kombiniert. Lego-Vektoren wurden verwendet, um HSPC mit 3 oder 5 verschiedene Rahmenprogramme (von Cerulean, eGFP, Venus, tdTomato und mCherry) markieren und folgen ihrer Transplantation im Laufe der Zeit in der BM durch konfokale und 2-Photonen-Mikroskopie, so dass klare Visualisierung von Knochen und anderem Matrixstrukturen und das Verhältnis von HSPC Klone Komponenten ihrer Mikroumgebung. HSPC wurden als die Linie negative Zellen aus C57BL / 6 Mäusen BM, der mit Lego-Vektoren transduziert gereinigt und durch Schwanzveneninjektion in Myelo-abgetragen kongenen Mäuse reinfundiert. Durch die Überwachung der große Mengen des Brustbeins BM Gewebe visualisiert wir endostalen Transplantation früh auftretendenBM Regeneration. Zellcluster mit verschiedenen Farbspektren erschien zunächst in der Nähe der Knochen und voran zentral über die Zeit. Interessant ist, dass nach mehr als 3 Wochen das Knochenmark bestand aus makroskopischen klonalen Clustern, was darauf hindeutet Ausbreitung der Blutbildung aus einzelnen HSPCs abgeleitet zusammenhängend im Knochenmark, sondern als umfassende Verbreitung HSPCs über die Blutbahn. Es war weniger Farbvielfalt am späten Zeitpunkten, was auf Schwierigkeiten bei der Wandlerlangfristige Bestandsauffüllung Zellen mit mehreren Vektoren.

Zusätzlich gebildet HSPCs Cluster in der Milz, ein Organ auch die Hämatopoese bei Mäusen verantwortlich ist. HPSC abgeleiteten einzelnen Zellen konnten in Thymus als auch gelöst werden, Lymphknoten, Milz, Leber, Lunge, Herz, Haut, Skelettmuskel, Fettgewebe und Niere. Die 3D-Bilder können qualitativ und quantitativ bewertet werden, um die Verteilung der Zellen mit minimalen Störungen der Gewebe zu schätzen. Schließlich zeigen wird die Machbarkeit der Live-dynamische Untersuchungen in 4D durch die Kombination von Resonanz Scannen Multi und konfokaler Zeitraffer-Bildgebung. Diese Methodik ermöglicht nicht-invasive hohe Auflösung, mehrdimensionale Zell-Schicksal Rückverfolgung von spektral markierten Zellen Populationen in ihrer intakten 3D-Architektur und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug in der Erforschung der Geweberegeneration und Pathologie.

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Protokoll

Alle Mäuse wurden untergebracht und in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health behandelt, und schrieb sich in einer NHLBI Animal Care und Use Committee genehmigten Protokoll. Weiblich B6.SJL-Ptprc (d) Pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) und C57BL / 6 Mäuse, 6-12 Wochen alt, wurden als Spender und Empfänger verwendet sind.

Eine Liste der Materialien, Reagenzien und Geräte ist in Tabelle 1 zur Verfügung gestellt.

1. Lego Transduktion von Maus HSPCs und Knochenmarktransplantation

Führen Sie unten in einem zertifizierten Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) Gehäuse (Gewebekultur Haube) beschriebenen Verfahren.

  1. Produktion von LEGO Vektoren Encoding 5 Bilder pro Sekunde
    1. Verwenden Sie die lentiviralen "Gene Ontology" (LEGO) Vektorplasmiden, die jeweils eine andere FP Codierung von einem starken konstitutiven Promotor SFFV, darunter LEGO-Cer2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Venus), Lego-T2 (tdTomato) und Lego-C2 (mCherry) freundlicherweise von Dr. Boris Fehse (Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Deutschland) zur Verfügung gestellt; nun auch von Addgene 5-7 zur Verfügung.
    2. LEGO Vektoren, Samen 5 x 10 6 Zellen 293T in 10 cm-Schalen (12 verwenden Gerichte für jeden Vektor) 24 h vor der Transfektion in 8 ml I10 Medien (IMDM mit 10% FCS und Glutamin / Penicillin / Streptomycin) zu erzeugen.
    3. Transfektion der Zellen mit Calciumphosphat mit leicht modifizierten CAPHOS Kit Empfehlungen:
      1. Für jede Platte Mix 15 ug LEGO Vektor, 12 ug pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 ug Zurück-TAT und 1 pg pMD2.G-VSV-G-Plasmide in Gegenwart von 50 ul 2,5 M CaCl 2, und Wasser bis zu ergeben ein 500 ul Gesamtvolumen.
      2. Niederschlag DNA-Plasmide mit 500 ul 2x HeBS (HEPES-gepufferte Salzlösung) und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur vor der Zugabe zu jeder Platte von 293T-Zellen.
      3. Zellen inkubieren6 h bei 37 ° C 5% CO 2 Inkubator; entfernen Medien und fügen Sie frisches Kulturmedien 6 Stunden nach der Transfektion.
    4. Sammeln Kulturüberständen enthalten lentivirale Partikel von jeder Platte, täglich, für 3 Tage. Jeder Tag nach Überstand Sammlung frisch I10 Medien zu jeder Platte.
      1. Filtriert durch 0,22 um Poren, Pool und konzentrieren Stände durch Ultrazentrifugation auf einem SW28 Rotor für 2 h bei 71.900 xg und 4 ° C.
      2. Resuspendieren der Überstände in 1 ml StemSpan Medien. Aliquotiert lentiviralen Bestände in 200 ul und bei -80 ° C.
  2. Titration von Lentivirale Partikel
    Bestimmen Sie den Titer von LEGO Vektorpartikel in gesammelten Überstände über die Quantifizierung der Wandlereinheiten / ml mit NIH3T3-Zellen. Titer erlauben die Berechnung des Volumens eines jeden Vektors Stand benötigt, um in der gewünschten relativen Multiplizität der Infektion (MOI) führen zu VersuchszielZellen.
    1. Platte 5 x 10 4 NIH3T3 Zellen pro Vertiefung (Platte mit 12 Vertiefungen) in 2 ml Medium I10 einen Tag vor der Titration.
    2. Bereiten 5-fach serielle Verdünnungen der Überstände in Vektor-I10 Medien mit Protaminsulfat ergänzt (4 mg / ml 1,000x).
    3. Entfernen Sie die Medien aus den Zellen und ersetzen mit 500 ul Überstand Verdünnungen, die das Äquivalent von 2, 0,8, 0,32 und 0,128 ul konzentrierter Virus.
    4. Bestimmen Sie die Nummer (No), die pro und zum Zeitpunkt der Transduktion Zellen, zählen ein Steuer gut.
    5. 6 Stunden nach der Transduktion mit 2 ml I10 Medien und Inkubation für 3 Tage bei 37 ° C, 5% CO 2.
    6. Ernte der Zellen aus jeder Vertiefung unter Verwendung von Trypsin-EDTA und bestimmt den Prozentsatz der fluoreszierenden Zellen (% FP) mittels Durchflusszytometrie.
    7. Berechnung der Titer wie folgt, Mitteln der für jede Vertiefung (Verdünnung) erhaltenen Titer, was zu einem FP von 1% und 50%: Titer (Vektorpartikel / ml) = Neinx% FP / Volumen von Vektorüberstand (ml). Der Mittelwert der für jede Verdünnung erreicht, wenn der FP-% liegt zwischen 1 und 50% Titer.
  3. Mauszell Collection, Reinigung, Transduktion und Transplantation (in 1A schematisch dargestellt angepasst von Malide et al. 4).
    1. Opfern Spendermäusen von einem zugelassenen Verfahren. Ernte Knochenmark von vorderen und hinteren Gliedmaßen: sezieren humeri, Oberschenkelknochen und Schienbeine, alle Muskeln, Bänder und überschüssiges Gewebe von Knochen, über das Ende der einzelnen Knochen so nah wie möglich an der gemeinsamen geschnitten gründlich zu entfernen, und spülen Sie das Knochenmark aus der Knochen mit einem 27-0 G Nadel auf einer Spritze mit I10 Medien.
    2. Pellet die Gesamtknochenmarkzellen für 10 min bei 500 × g, 4 ° C und Lyse roter Blutkörperchen zweimal mit 50 ml ACK-Puffer. Die Zellen in 10 ml Medium I10.
    3. Reinige Linie negativ (Lin) Vorläuferzellen mit dem MACS Linie Verarmungs Kit gemäß einem modifizierten Satz Protocol:
      1. Verwenden Sie 30 ul Anti-Biotin-Mikrokugeln statt 10 ul / 10 7 Zellen; Führen Sie die Waschschritten mit I2 Medien (IMDM mit 2% FCS) anstelle von Puffer.
      2. Legen Sie ein Waschschritt zwischen der Inkubation mit Biotin-Antikörper-Cocktail und der Inkubation mit Anti-Biotin-Mikrokugeln; und die Säule ins Gleichgewicht mit I10 anstelle von Puffer.
    4. Kultur Lin-Zellen für 48 h bei einer Ausgangsdichte von 5 x 10 5 Zellen / ml in StemSpan Medium mit 10 ng / ml Maus-IL-3, 100 ng / ml Maus-IL-11, 100 ng / ml humanem Flt-3 ergänzt Liganden, und 50 ng / ml Maus-Stammzellfaktor.
    5. Übertragungs 1 bis 4 × 10 5 Zellen auf 12-Well-Platten mit RetroNectin beschichtet und Transduktion mit LEGO Überstände, die jeweils bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 6-7 bis 50% der Expressionseffizienz für jedes FP zu erzielen, in Gegenwart StemSpan Medien und Zytokine oben beschrieben und 4 g / ml Protaminsulfat.
    6. Transduzieren Zellenmit jedem LEGO Vektor einzeln, wie in Schritt 1.3.5 beschrieben und mischen Zellen nach Transduktion (genannt Mix) oder Co-Zellen transduzieren mit allen 5 LEGO Vektor Stände gleichzeitig (als Co). Zellen zu entfernen, 24 Stunden später, einmal mit StemSpan Medien waschen ohne Zytokine und resuspendieren sie in StemSpan Medien ohne Zytokine für die Transplantation, oder übertragen Sie sie auf frisches Medium mit Zytokinen und Kultur für zusätzliche 96 h vor der konfokalen Mikroskopie und Durchflusszytometrie.
      1. Führen Knochenmarktransplantation durch Infusion transduziert Lin HSPCs via Schwanzveneninjektion mit 11 Gy Einzeldosis bestrahlt Empfänger (6-18 Stunden vor der Transplantation) Empfänger, in einem Volumen von 100 ul bei einer Zelldosis pro Maus entspricht 1 -4 x 10 5 Lin Zellen, die ursprünglich für die Transduktion plattiert. In jedem Experiment verpflanzen eine ganze Kohorte von Tieren, die mit der gleichen Population von transduzierten Spender BM-Zellen.
      2. Für in-vitro-Charakterisierung der transduzierten HSPCs, Kultur werden die Zellen für weitere 4-5 Tage in StemSpan ergänzt mit Zytokinen und durch Durchflusszytometrie analysiert für Transduktionseffizienz und durch Mikroskopie für Farbvielfalt.
        1. Opfern einzelnen Mäusen und Abrufen von Geweben und Organen für die Bildgebung, zu verschiedenen Zeitpunkten bis zu 120 Tage nach der Transplantation.
          1. Spray mit Ethanol das Fell der Maus und die Haut einzuschneiden auf der Bauchseite zu vermeiden Haare Verbreitung.
          2. Sezieren und Verbrauch nach Standardverfahren der Milz, poplitealen Lymphknoten, Lunge, Herz, Haut, Fettgewebe, Skelettmuskel, Niere, Leber, sowie der Kopf, den Zugang zu Schädeldecke.
          3. Alternativ können Sie Schädeldecke oder ein Knochenfenster für die Live-Darstellung mehrfach im Laufe der Zeit 2,8,9 oder Bild oberflächlichen Organe gesetzt, wie die Haut und Lymphknoten im lebenden Tier.
        2. Zeigen einzelnen Organe in 35 mm-Nummer 0 Deckglas Kulturschalen in 50-10056; l PBS zur Abbildung sie intakt, ohne Schneiden, Fixierung oder Weiterverarbeitung wie in Schritt 2.5 beschrieben.
        3. Für die volumetrische Bildgebung, halten die Organe in kaltem PBS bis zur Verwendung. Für Zeitraffer-Imaging gehen sofort auf die Abbildung Organe in DMEM, 10% FBS mit 20 mM HEPES bei 37 ° C

2. Konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie und Bildanalyse

  1. Führen Mikroskopie mit einem Leica SP5 fünf Kanäle konfokale und Multiphotonen-System mit mehreren Leitungen Argon, Diode 561 nm, 594 nm HeNe und He-Ne-Laser mit 633 nm sichtbar ausgestattet. Verwenden Sie in 2-Photonen-Modus, einem gepulsten Femtosekunden-Ti: Saphir (Ti-Sa)-Laser, abstimmbaren zur Anregung von 680 bis 1.080 nm mit Dispersionskorrektur. Verwendung in Experimenten mit rotverschoben fps (tdTomato und mCherry-), einen optischen parametrischen Oszillator (OPO), um die Laserausgangswellenlängenbereich soweit 1,030-1,300 nm nacheinander oder gleichzeitig mit t erstrecken,er Ti-Sa-Lasers.
  2. Bild verschiedenen Geweben mit einem HCX-IRAPO 25X-L / 0,95 NA Wassertauchziel (WD = 2,5 mm), ein HC-PLAPO-CS 20x / 0,70 NA Trockenobjektiv (WD = 0,6 mm) oder HC-PL-40X IRAPO /1.1 NA Wasserimmersionsobjektiv (WD = 0,6 mm).
  3. Erhalten konfokalen Fluoreszenzspektren Sammeln Lambda Stacks (xyλ) des emittierten Lichts in 5 nm-Bandbreiten des sichtbaren Spektrums von KM-Zellen mit einem einzigen FP LEGO Vektor transduziert sowie der Kontrolle, nicht-transplantierten BM.
    1. Prozessbilder mit dem Leica LAS AF-Software v2.4.1 Referenzspektren aller 5 RP sowie der Autofluoreszenz (2A) zu erstellen. Verwendung der einzelnen FP-Spektren und den Unterschied in der Fluoreszenzhelligkeit (ausgedrückt als% der EGFP) von Cerulean (79%), Venus (156%), tdTomato (283%) und mCherry (47%) gesetzt 5 sequentielle Bildgebung Kanäle wie folgt: Cerulean (458/468 bis 482 nm), EGFP (488/496 bis 514 nm), Venus (514/523 bis 558 nm), tdTomato (561/579 bis 597 nm) und mCherry (594/618 bis 670 nm) ( 2B).
    2. Validieren genaue RP-Trennung, wie Zellen, die mit jedem einzelnen FP transduziert nur in dem entsprechenden Kanal von dem Rest (2C) sichtbar und vorhanden sind. Darüber hinaus schafft diese definierte Multi-Channel-Ansatz eine einzigartige 5-Kanäle "Colorprint", die spätere Farbanalyse und klonalen Tracking ermöglicht und hat den Vorteil der Reduzierung Akquisitionszeiten im Vergleich zu spektralen Bildgebung.
  4. Getrennte Fluoreszenzemission, in der 2-Photonen-Modus, durch hocheffiziente individuelle dichroitische Spiegel und sammeln mit vier Kanälen nichtdescannten Detektor (NDD) wie folgt: ein dichroitischer Spiegel 568 nm, gefolgt von einem dichroitischen Spiegel bei 465 nm, gefolgt von 452/45 nm ein Emissionsfilter für SHG oder Autofluoreszenz und Cerulean, einem 525/40 nm Emissionsfilter für EGFP oder Venus, und einem 648 nm dichroitischen Spiegel und 620/60 nm Emissionsfilter für tdTomato oder mCherry.
    1. Strukturinformationen zu offenbaren durch Zwei-Photonen-Mikroskopie intrinsic Kontrastbildgebung von Gewebeautofluoreszenz von Elastin, NADH, (aufgeregt bei 780 nm) (wie oben beschrieben) und der zweiten Harmonischen erzeugte Signal (SHG) aus Knochen und fibrillärem Kollagen (aufgeregt bei 920 nm oder 860 nm in einem rückgestreuten gesammelt Richtung) 10,11.
  5. Für 3D-Volumendarstellung, sammeln Reihe von xyz Bilder (typischerweise 1 x 1 x 4 um 3 Voxel-Größe) entlang der z-Achse bei 5 um Intervallen über einen Bereich von Tiefen (150-300 um) der gesamten Knochenmark und anderen Geweben, über große Regionen mit der Kachel-Funktion der Software automatisch generiert abgesteppten Bände umfasst eine ganze Brustbein Fossa, ca. 2,5 x 1,2 mm 2 (xy) und 300 um (z) (den 2D-2E) und Movie-1.
    1. Bild Schädel direkt durch den Schädel Mark ohne Schneiden 2, 8.
    2. § Brustbein entlang der Sagittalebene (Halbierung) und dannquer an der Verbindung zwischen 2 Brustbein Fosse und Bild durch die Schnittfläche 3,4,12 (Übersicht in Abbildung 1B aus Takaku angepasst et al 3).
  6. 4D für Zeitraffer-Bildgebung, legen Sie frisch ausgeschnittenen Kniekehle Lymphknoten, Milz, Lunge oder Schädelknochenproben uncut auf 35 mm Deckglas Nummer 0 Kulturschalen, in 50-100 ul DMEM, 10% FBS mit 20 mM HEPES bei 37 ° C und mit 2-Photonen-Ti-Sa-Anregung (860 nm) in Kombination mit konfokaler Anregung (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) und Leica Resonanzscanner (8000 Hz / sec), wobei Z-Stapel (~ 80 um) in 20 Sekunden-Intervallen für bis zu 1 Stunde.
    1. Für den gleichzeitigen Drei-Farben-2P Bildgebung Ti-Sa bei 860 nm abgestimmt gleichzeitig mit dem OPO-Laser (1.130 nm auf für tdTomato abgestimmt, oder 1.140 nm mCherry) (Film 2).
  7. Rekonstruktion und Analyse von 3D-und 4D-Volumes Zeitabläufe
    1. Verwenden Imaris x64 SoftwVersion 7.6 sind, oder alternative Software-Pakete, die gefliest-Stapel von RAW-Bildern in Volumen-gemacht (3D) zu transformieren Daten von fluoreszierenden Zellen im Knochenmark und verschiedenen Geweben und sie als 3D-Rotation Filme zu exportieren, wie zuvor beschrieben, 3,4 (Movie 1) Schritt-für-Schritt-Beispiel:
      1. In Imaris, Bild öffnen Sie die Z-Stapel; Wählen Sie "übertreffen", um das 3D-Volumen-Visualisierung angezeigt werden.
      2. Verwenden Sie "navigieren", um die Lautstärke um 360 ° zu drehen.
      3. Wählen Sie "Animation", um eine Animation zu erstellen; Schlüsselbilder verwenden, um ausgewählte Ansichten, Zoom, Rotation des Volumens hinzuzufügen; Vorschau des Films, bearbeiten, wie notwendig und speichern Sie die Datei in einem gewünschten Filmformat (zB: avi, mov).
    2. Zur quantitativen Bewertung der 3D-Zell und Klon Frequenz, Positionen, Größen und Verteilung, Weiterverarbeitung der Z-Stapel mit den Imaris XT Module, die MATLAB-Anwendungen Führen Abstand meas integrierensungen (mit einem Abstand Transformationsalgorithmus) und Cluster-Analyse, wie zuvor beschrieben, 3,4. Verwandeln die Sequenzen von Bildstapeln im Laufe der Zeit in die Serien gerendert vierdimensionalen (4D)-Filme mit Imaris x64-Software, und verwenden Sie vor Ort und Oberflächenanalytik für halbautomatische Verfolgung von Zellbewegung in drei Dimensionen mit autoregressiven Bewegungsalgorithmen.
    3. Führen multispektrale Analyse von Zellen wie folgt: Entpacken Sie die Multi-Color-markierten Flecken, indem alle 5 Kanäle durch den Kanal Arithmetik der Imaris XT in einen neuen Kanal; bestimmen, für alle Spots (Zellen) die mittlere Intensität Fluoreszenz in jeder der 5 Kanäle Komponente. Exportieren Sie die Werte in Excel-Software, um die Anzeige der Grafiken einzigartigen "Colorprint", dh die relative% jeder FP in einzelnen Zelle (2E Grafik) zu zeichnen. Korrigieren Sie die Daten für die Gewebe Drift eingestellt, und berechnen Zellgeschwindigkeit und Verschiebung über die Zeit, Streckenlängen, Pfade und Wege; Exportwerte in Excel software um Graphen zu zeichnen. Montieren Verbund Figuren mit Adobe Photoshop CSS-5-Software.

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Ergebnisse

Whole-Mount-3D-konfokale / 2-Photonen-Mikroskopie Rekonstruktionen der sternalen Knochenmark Zeitverlauf zeigte die Transplantation und die Expansion von transplantierten Co-5 Bilder pro Sekunde in einem Muster mit bemerkenswerten Eigenschaften: Klone erschienen klar abgegrenzt, homogen mit breiten Palette von Farben und Fortschritt zunächst markiert über die Zeit, um vorzugsweise Zellen enthalten meist eine Farbe. Konfokalen Mikroskopie-Setup und repräsentative Beispiele der bildgebenden 5 Bilder pro Sekunde markierte ...

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Diskussion

Wir beschreiben hier die Details eines leistungsfähigen Methodik vor kurzem für klonalen Zellverfolgung entwickelt und kombiniert die große Vielfalt, die durch kombinatorische Markierung mit 5FP-kodierenden LEGO Vektoren und Bildgebung mit Tandem-konfokale und 2-Photonen-Mikroskopie, um volumetrische und dynamische Bildgebung in lebenden Geweben zu erreichen erzeugt. Dies erweitert den Einsatz von FP-basierte Farbmarkierung durch Aufnahme konfokalen Spektral-Identität in 5 "deutliche" 8-Bit-Kanäle. Damit das r...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Intramural Research Program des National Heart, Lung, Blood Institute der National Institutes of Health. Wir danken Boris Fehse (Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Deutschland) für die Bereitstellung der fünf LeGO-Vektorplasmide; Christian A. Combs und Neal S. Young (NHLBI, NIH) für Diskussionen, Unterstützung und Ermutigung während dieser Studie und Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) für die Unterstützung bei Schwanzveneninjektionen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Produktion von Viren
LeGO-Cer2Addgen27338Expression von Cerulean
LeGO-G2Addgen25917Expression von eGFP
LeGO-V2Addgen27340Expression von Venus
LeGO-T2Addgen27342Expression von tdTomate
LeGO-C2Addgene27339Expression von mCherry
Calciumm Phosphate Transfection KitSigmaCAPHOS-1KT
GewebekulturschaleBD Falcon353003
IMDMGibco, Life Technology12440-053
Fötales Rinderserum HitzeinaktiviertesSigmaF4135-500ML
Pen Strep GlutaminGibco, Leben Technologie10378-016
ZentrifugenröhrchenBeckman Coulter326823
SW28 UltrazentrifugeBeckman CoulterL60
Millex Spritzengetriebene Filtereinheit (0,22 & Mikro; m)MilliporeSLGS033SS
Sammlung, Reinigung, Transduktion und Transplantation von Mauszellen
ACK LysingpufferQuality Biologicals Inc.118-156-101
Lineage Cell Depletion Kit (Maus)Miltenyi Biotec Inc. USA130-090-858
LS Säulen + RöhrchenMiltenyi Biotec Inc. USA130-041-306
Vorabscheidungsfilter (30 & Mikro; m)Miltenyi Biotec Inc. USA130-041-407
StemSpan SFEM-serumfreies Medium für die Kultivierung und Expansion von hämatopoetischen Zellen (500 ml)StemCell Technologies Inc 9650
Murine IL-11 CFR & D Systems Inc418-ML-025/CF100 & Mikro; g/ml entspricht dem 1.000-fachen
rekombinanten murinen SCFRDI Division von Fitzgerald Industries Intl RDI-2503100 & Mikro; g/ml ist 2.000x
rekombinantes murines IL-3R & D Systems Inc403-ML-05020 & Mikro; g/ml ist 2.000x
FLT-3 LigandMiltenyi Biotec Inc. USA130-096-480100 µ g/ml entspricht 1.000 x
12-Well-Platten, CostarCorning Inc.3527
RetronectinTakara Bio IncT100A/BResuspend bei 50 &; Mikro; g/ml
ProtaminsulfatSigmaP-40204 & Mikro; g/ml ist 1.000x
Konfokal- und Zwei-Photonen-Mikroskopie
DMEMLonza12-614F
1 M HepesCellgro, Mediatech Inc.25-060-CI
Kulturschale mit Glasboden P35G-0-20-CMatTek CorporationP35G-0-20-C
Kulturschale mit Glasboden P35G-0-14-CMatTek CorporationP35G-0-14-C
Nunc Lab-Tek Deckglas mit Kammer #1 Deckglas aus Borosilikat; 4-Well-ThermoScientific155383
Deckgläser 22 mm Nr. 2Thomas Scientific6662-Q55
Leica TCS SP5 AOBS Konfokal- und Multiphotonenmikroskop mit fünf KanälenLeica Microsystems
Chameleon Vision II -TiSaph Laserbereich 680-1.080 nmCoherent
Chameleon Compact OPO Laserbereich 1.030-1.350 nmCoherent
HCX-IRAPO-L 25X/0,95 NA Wassertauchobjektiv (WD=2,5 mm)Leica Microsystems
HC-PLAPO-CS 20X/0,70 NA Trockenobjektiv (WD=0,6 mm)Leica Microsystems
HC-PL-IRAPO 40X/1,1 NA Wasserimmersionsobjektiv (WD=0,6 mm)Leica Microsystems
Imaris Software Version 7.6Bitplane

Referenzen

  1. Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
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  3. Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
  4. Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
  5. Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
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Nachdrucke und Genehmigungen

Erratum


Formal Correction: Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

This was corrected in the discussion from:

This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

to:

This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

Schlagwörter

H matopoetische Stamm und Vorl uferzellenFluoreszierendes Protein MarkingKonfokalmikroskopieZwei Photonen MikroskopieKnochenmarktransplantationlentiviraler Vektor Transferklonale Tracking AnalyseMulticolor Imaging4D Zeitrafferspektrales Unmixing
In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte
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