טכני אלמנטים בסיסיים של ההקפאה-בר / הקפאה-לחרוט בביולוגי מיקרוסקופית אלקטרונים

Summary

טכניקות וחידודים של עיבוד הקפאה שבר של דגימות ביולוגיות וננו לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים בסיסיים מתוארות. טכניקה זו היא שיטה מועדפת לחשיפת תכונות והתמחויות של ממברנות ביולוגיות ultrastructural ולקבלת נתונים ממדיים ומרחבי רמת ultrastructural במדעי חומרים ומוצרי ננוטכנולוגיה.

Abstract

להקפיא בר / להקפיא לחרוט מתאר תהליך שבו דגימות, בדרך כלל ביולוגי או nanomaterial בטבע, הם קפואים, שבר, ומשוכפל ליצירת פחמן / פלטינה "להפיל" המיועד לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. דגימות נתונים לשיעורי הקפאת ultrarapid, לעתים קרובות בנוכחות סוכני cryoprotective להגביל היווצרות גבישי קרח, עם השבירה הבאה של הדגימה בחנקן נוזלי מקוררת טמפרטורות תחת ואקום גבוה. המשטח סדוק התוצאה משוכפל והתייצב על ידי אידוי של פחמן ופלטינה מזווית שמקנה משטח פירוט תלת ממדי לשחקנים. טכניקה זו הוכיחה מאיר עיניים במיוחד לחקירה של קרום תא וההתמחויות שלהם ותרמה במידה ניכרת להבנה של צורה סלולרית לתפקוד תא קשור. בדוח זה, נסקור את דרישות המכשיר ופרוטוקול טכני לביצועהקפאה שבר, המינוח ומאפיינים של מטוסי שבר הקשורים, וריאציות על ההליך המקובל, וקריטריונים לפרשנות של תמונות להקפיא בר. טכניקה זו נמצאת בשימוש נרחב לחקירת ultrastructural בתחומים רבים של ביולוגיה של תא וטומנת בחובו הבטחה כטכניקת הדמיה המתעוררות למולקולרית, ננוטכנולוגיה, ולימודי מדע חומרים.

Introduction

הרעיון והיישום מעשי של עיבוד הקפאה שבר של דגימות ביולוגיות הוצג על ידי ¹ סטיר יותר ממחצית לפני מאה שנה. המנגנון המוקדם ניכס רכיבים שונים ליחידה עצמאית עובדת ^1. המנגנון המקורי שונה ומעודן לתוך מכשירים זמינים באופן מסחרי במטרה לענות על הצורך הקריטי במניפולציה מרחוק, תחזוקה של ואקום גבוה, והאידוי של פחמן ומתכות כדי לייצר העתק מתאים לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (איור 1 ואיור 2).

המכשיר הטיפוסי מורכב של תא ואקום גבוה עם שולחן דגימה וזרוע microtome יש תפוקת חנקן נוזלית regulable (איור 1). התא כולל גם שני רובי אלקטרונים, אחד לייצוב אידוי פחמן ממוקם בזווית 90 מעלות לשלב דגימה והאחרת לPlatinum / פחמן הצללה בזווית מתכווננת, בדרך כלל 15º - 45º (איור 2). כוח ליחידה מוחל לתפעול משאבת הוואקום ולוחות אלקטרוניים לווסת שליטת התאמת הטמפרטורה ואלקטרון אקדח.

הגה במקור כאמצעי להשגת הדמיה משופרת של וירוסים, להקפיא-שבר זכה לפופולריות עוד יותר כטכניקה לבחינה והניתוח של קרום תא וההתמחויות שלהם ^{2, 3.} ואכן, הליך זה היה בלתי נפרד מהבהרת יחסי מבנה / תפקוד בתאים וברקמות ורבים מהמחקרים האלה עומדים כמו תרומות קלאסיות לביולוגיה מולקולרית של תא ^4-9. המטרה העיקרית והרציונל לפיתוח של טכניקת הקפאה-השבר היה להגביל חפצים נצפים ברזולוציה מיקרוסקופית אלקטרונים הנובעות מקיבעון כימי והעיבוד השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים ביולוגי קונבנציונלי. כאן המטרה היא להגביל כימיקיבעון ולהקפיא את הדגימה במהירות מספקת, ולעתים קרובות בנוכחות cryoprotectant כדי להגביל את היווצרות גבישי קרח וחפצי הקפאה אחרות. לאחרונה, בטכניקה זו מצאה התעוררות מחודשת של עניין מביולוגים מולקולריים וחוקרי מדע חומרים לבדיקה של חלקיקים וננו.

תמונות בהקפאה שבר ולהקפיא לחרוט מפגינות אופי תלת ממדים ולעתים טועים לmicrographs אלקטרונים הסורקים. עם זאת, הכנות להקפיא בר נבחנות על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הולכה והתרומה הגדולה שלהם ללימודים מורפולוגיים ברזולוציה גבוהה היא הייצוג הייחודי שלהם של אלמנטי מבנה / תפקוד של קרום תא. עיבוד בהקפאה שבר הוא ביוזמת הקפאת תאים ורקמות במהירות מספיקה כדי להגביל את התגבשות קרח ו / או בשימוש בסוכנים cryoprotectant כגון גליצרול. לאחר מכן הדגימות שבר תחת ואקום ונציגLica מופק על ידי אידוי של פחמן ופלטינה על פני השטח שהברים. הדגימה המקורית מתעכלת מההעתק שמאוחזר על רשת דגימת EM סטנדרטית. עוד פירוש מוטעה נפוץ של תמונות להקפיא בר הוא שהם מתארים משטחי תא. עם זאת ההנחה הבסיסית של הקפאה שבר היא שקרומים ביולוגיים מפוצלים דרך bilayer השומנים על ידי תהליך שבר (איור 3). תהליך בקרומים ביולוגיים זה מניב שני פרצופים שבר, אחד החושף את הארגון של מחצית מהקרום הסמוך אל הציטופלסמה,-PF הפנים, ואחד אשר חושף את מחצית עלון bimolecular של הקרום שנמצאה בסמוך לתאי הסביבה,-EF הפנים. משטחי תא אמיתיים אינם מיוצגים בתמונות להקפיא בר אך מופיעים רק כאשר הצעד שנוסף לאחר הקפאת תחריט ביצוע הליך שבר משמש. כדי לחרוט ביעילות דגימות שבר בעבר כדי לחשוף detai משטחl, דגימות חייבות להיות קפוא בקצב מהיר וללא unetchablecryoprotectant. תחריט של מים מפני השטח של הדגימה שבר חושפת תכונות הבסיסיות מושגת על ידי הצבת זרוע קירור microtome מעל הבמה דגימת יצירת ההפרש טמפרטורה בין השלב מחזיק את הדגימה וזרוע microtome הקירור אשר גורמת למים נשגבים מהמשטח. כאשר מים בסובלימציה מפני השטח של הדגימה שבר במהלך תמרון תחריט ההקפאה, אז היבטים של משטחים בפועל תא, מטריצת חוץ תאית, מבני cytoskeletal, והרכבות מולקולריות עשויים להתגלות ברזולוציה גבוהה. כך בהקפאה שבר ולהקפיא לחרוט אינן תנאים להחלפה, אלא משקף את תהליך צעד חכם האחרונה שבם לא עשוי להיות נחוץ או רצוי בהתאם לצרכים של מחקר המסוים.

בעקבות ההקפאה-הבר / להקפיא לחרוט נהלים, המשטחים הסדוקים חשופים לevapora המכווןtive שכבות של פחמן ופלטינה על מנת לספק תמיכה והדמיה ניגוד להעתק. אידוי ההדמיה / פחמן הפלטינה יכול להיות חד כיווני או סיבובי, והוא נעשה על ידי או התנגדות או רובי אלקטרונים. הצללה חד כיווני מזווית ידועה, בדרך כלל 30º - 45º, היא שימושית בביצוע חישובי morphometric מסוימים. דגימות שהיו נתונים לעמוקים תחריט בדרך כלל הן סיבוביות מוצל והתמונות כתוצאה של דגימות אלה מתהפכות photographically להערכה.

ההיסטורי, כמו גם מטרה הנוכחית של הקפאה שבר טכניקת ההקפאה לחרוט / היא להגביל קיבעון כימי ועיבוד דגימת ממצאים הקשורים ליותר נהלים במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים קונבנציונליים. עם זאת, טכניקה זו מספקת יתרון מהותי ביכולתה להעניק פירוט תלת ממדים ובכך להקל על רכישה של נתונים morphometric במדע ביולוגי, חומר, וnדגימות anotechnology. נהלי ההקפאה שבר ולהקפיא לחרוט הם מורכבים ורבי פנים והיבטים מסוימים של היישום שלה מותאמים אישית. מצגת זו מציעה נוף סקר של התכונות העיקריות של התהליך והקורא מופנה לפרוטוקולים שפורסמו מקיפים ^{10, 11} על מנת לתת מענה לפרטים ולהתאמה אישי של התהליך לצרכי מחקר ספציפיים.

Protocol

.1 הכנת ביולוגית דוגמאות להקפאה-בר / הקפאה-לחרוט

1. השתמש בניסוח מקבע EM קונבנציונלי כגון 2% paraformaldehyde glutaraldehyde + 2% במאגר M 0.1 פוספט עבור שעה 1. לבצע קיבוע ראשוני של רקמות ביולוגיות. הערה: למרות שזה עשוי להיות רצוי להקפיא כמה סוגים של דגימות ללא קיבוע לפני, אמצעי זהירות הפתוגן דם נישא אוניברסלי מחייב קיבעון המתאים שבו הדגימה מורכבת מרקמה אנושית.
2. בעקבות קיבעון עיקרי, לשטוף את הדגימה באותו החיץ בתוספת 0.2 M סוכרוז לא יותר מ 1 שעות.
3. העבר את הדגימה לפתרון cryoprotectant המורכב מגליצרול 25% ב0.1 חיץ פוספט M לא יותר משעה 1.

.2 הקפאה ואחסון של דגימות מראש של הקפאה-שבר

1. ספחי דגימת זהב או נחושת בחרו בגודל מתאים ובצורה לדגימה בעיבוד (איור 4
2. בעזרת מלקחיים כיתה קנס ו / או שברים קטנים עמדת מד קטנה מחטי מזרק של הדגימה בחלק העליון של בדל דגימת מתכת.
   1. להפחית את תכולת הנוזל של הדגימה לדביקה, מעט דבק כמו עקביות על ידי ציור את הנוזל מקצה הבדל עם נייר סינון.
   2. להעתקים יחידים, משתמש במחטי מזרק מד קטנות כדי ליצור תלולית של רקמה על הבדל. להעתקים כפולים, להפוך בדל ותפקיד אחר זה בדיוק מעל הבדל ולמקם בקלילות על פני השטח דגימת יצירת כריך (איור 5 א). אל תלחץ על הדגימה מבין שני הספחים.
3. מלא שני כלי דיואר מבודדים עם חנקן נוזלי. הערה: הכלי הראשון להכיל הודעה מתכת המכילה גם קטן המשמש להנזלת נפח קטן של גז פרופן מצילינדר זמין מסחרי (איור 5). הכלי השני הוא אחסון למחיצות / מחזיק כלי לקצרly שמירת דגימות קפואות תחת חנקן נוזלי.
   1. השימוש בנחיר הגליל ממוקם בבאר פרופאן, לפתוח את שסתום הגליל ולאפשר גז לזרום לתוך הבאר של הכלי הראשון שבו הוא נוזל. הערה: זהירות !! PROPANE נפיץ, עלול לגרום להקפאת פציעה במגע, והוא ASPHYXIANT. השתמש פרופאן רק במנדף כימי מאושר לשימוש כזה מטפל גם להימנע ממקורות הצתה זרים, תוך שימוש בבגדי מגן מי טמפרטורות נמוכות, ושמירה על אוורור נאות.
   2. מהר ככל האפשר, לאסוף את דגימת הר עם מלקחיים כיתה משובחים ולנעוץ אותה בגז הנוזלי בכלי הראשון לכמה שניות ולאחר מכן להעביר במהירות לכלי מחזיק השני של חנקן נוזלי (איור 5).
   3. ברגע שהדגימות קפואות, חנות תחת חנקן נוזלי עד מוכן להעביר למפעל הקפאה שבר. העבר את הספחים למכל דיואר חנקן נוזלי אחסון גדול יותר עבור מורחבאחסון אם תרצה בכך, עם זאת יש להיזהר שלא לאפשר לספחים להפשיר.

.3 מבצע של ההקפאה-שבר כלי ודגימת עיבוד

1. טעינת דגימות על בעל פליז ולתוך התא
   1. טען את ספחי דגימת זהב לבעל דגימת העתק כפול חוברת סוג או לצבוט מכשיר תחת חנקן נוזלי ולשמור על קיים עד מוכן למצב בתא הדגימה (איור 6).
   2. כאשר התא השיג ואקום גבוה (כ -2 x 10 ^-6 mbar) והשלב כבר מקורר לטמפרטורה של חנקן נוזלי, לכבות את המשאבה, לפרוק הקאמרית, ומקם את ספחי דגימה רכובים על גבי שולחן הדגימה במהירות אפשרי .
   3. הפעל את המשאבה, להקים מחדש ואקום גבוה, ועושים שימוש בפקדי שלב וטמפרטורת זרוע אלקטרוניים כדי להתאים את טמפרטורת שולחן דגימה ל-100 ° C וחנקן נוזלי ישיר לזרוע microtome וbring אותו לטמפרטורה של חנקן נוזלי.
2. תהליך שבר
   1. על השגת ואקום גבוה, טמפרטורת שלב של -100 ºC וזרוע microtome בטמפרטורה של חנקן נוזלי, מרחוק לפתוח את בעל דגימת העתק הכפול ובכך שבירה הדגימות על mounts הדגימה (בהקפאה fracture_movie1.mov).
   2. במקרה של דגימות מיועדות לבר הבא תחריט, להשתמש בסכין גילוח נשמר במהדק על זרוע microtome לגלח (כלומר, שבר) את פני השטח של הדגימות במקום צעד 3.2.1 (בהקפאת etch_movie2.mov).
   3. אם צעד תחריט הקפאה נוסף הוא שיש לבצע, מקם את זרוע microtome המקורר מעל המשטחים הסדוקים לאחד למספר דקות. מים תמרון זה נשגב (כלומר, לחרוט) מהמשטח שבורה: הערה. ההשפעה של המהלך הזה היא לחשוף משטחים אמיתיים תא, מטריצת חוץ תאית, ו / או מכלולים מולקולריים על ידי סובלימציה של מים, בנוסף לfracture פרצופים עובר דרך bilayer השומנים של קרומים.
3. הצללת מתכת ואידוי תמיכת העתק באמצעות רובי אלקטרונים
   1. הפעל את אקדח פלטינה / אלקטרון פחמן או התנגדות ולאפשר לו להתאדות שכבה דקה (כ 2 ננומטר) של פלטינה / פחמן על פני השטח שברים מזווית של 30º - 45º. זה בדרך כלל דורש כ 15 - 20 שניות.
   2. הפעל את אלקטרון פחמן או אקדח התנגדות כמו בשלב 3.3.1 ולהתאדות שכבה דקה של פחמן אל פני השטח דגימה שבורים מישירות (90 מעלות) מעל לראש לתת תמיכה להעתק. זה בדרך כלל דורש כ 15 - 20 שניות.
4. שליפה של העתקים
   1. עם השלמת הצללת שכפול וייצוב פחמן, לכבות את משאבת הוואקום, לפרוק הקאמרית, ולהסיר את דגימת הר מהמכשיר.
   2. בעזרת זוג המלקחיים כיתה קנס להסיר כל בדל דגימת זהב מכפולחוברת העתק / מהדק ולאפשר להפשיר במשך כמה שניות לפני שמעדנים את הבדל על גבי משטח מים בצלחת מקום (איור 7). הערה: העתק פחמן / פלטינה המכיל חומר דגימה חסיד יצוף על פני המים.
   3. לתמרן את העתקים או באמצעות לולאת חוט דקה או רשת מיקרוסקופ אלקטרונים קונבנציונלית נחושת המוחזקת על ידי מלקחיים כיתה קנס והעברה לצלחת מקום אחר המכילה 5% dichromate נתרן ב50% חומצה גופרתית לאחד למספר שעות. הערה: אמבטיה זה מעכלת את חומר הדגימה ביולוגי בפועל מההעתק. אקונומיקה ביתית כוח מלא יכולה להחליף dichromate / פתרון החומצה גופרתי.
   4. כאשר העיכול יושלם, להעביר ההעתק בחזרה למשטח של מים נקי ולאחזור אל רשת במיקרוסקופ אלקטרונים נחושת סטנדרטית. (הערה: העתקים עשויות לפצל לחתיכות קטנות יותר במהלך עיכול אבל גם העתקים קטנים מאוד עשויים להכיל מידע משמעותי וצריכים להיות retrieved ובדק.) העתק חנות תמיכה רשתות בקופסות רשת זמינות המסחרית שבו הם יישארו יציבים במשך שנים עם טיפול עדין.

.4 Ultrastructural בחינת להקפיא בר / העתקים לחרוט

1. צפו בהעתקים במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים במתח מאיץ בדרך כלל 50-80 ק.
2. להקליט תמונות רלוונטיות על סרט TEM סטנדרטי או עם מצלמה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה.

Representative Results

הנחת היסוד המרכזית של פרשנות תמונת הקפאה שבר הוא שמטוסי שבר עוברים דרך bilayer השומנים של קרומים המקנים שני פרצופים שבר, שנקרא על ידי אמנה-PF הפנים (שבר פנים פלזמה) וEF פנים (שבר פנים תאיים) (איור 3). -PF הפנים הוא מחצית מbilayer השומנים הקרום הסמוך לציטופלסמה של התא ו- EF הפנים היא מחצית מbilayer השומנים הקרום הסמוך לסביבה תאית. טכניקת ההקפאה שבר היא שימושית במיוחד לחקירת מבנה קרום ושני הפרצופים הם בדרך כלל שונים במובהק עם PF-פרצופי אכלוס עם חלקיקי קרום רבים הקשורים בניגוד לEF-פרצופים שמכילים פחות. תוכן cytoplasmic של תאי שבר הקפאה הוא בדרך כלל גס במראה ולא במיוחד חושפני למרות שניתן לזהות האברונים קרום מחויב כגון גרעינים וGolgi בקלות. עניין מיוחד לinvestigators שימוש בטכניקה זו הן התמחויות של מבנה קרום שיכול להתפרש לתפקוד שלהם. אלה כוללים הפצות ספציפיות של חלקיקי קרום קשור, התמחויות קרום הריסים, וצמתים בין תאית.

מבנים הקשורים cilia

המתגורר בקרום התא בבסיסו של כל cilium והשוטון אוקריוטים הוא מערך של חלקיקי קרום הקשורים מאורגן בגדילים המקיפים את הפיר של cilium וידוע כשרשרת הריסים (איור 8) ^12-16. מבנה זה מציג מידה מסוימת של הטרוגניות מורפולוגיים במינים שונים וזה כבר העריך להיות ככל רב תכליתי כפי שהוא מופיע לפני הופעתה של פיר הריסים במהלך ciliogenesis ונשאר במקום בcilium הבוגר. שרשרת הריסים המתהווה נובעת מהצבירה והארגון של מערכי חלקיקי קרום לפני המועד של הדוארmergence של פיר הריסים במהלך ciliogenesis מציע השתתפות האפשרית שלו בארגון המוקדם של axoneme פיתוח ^14.

צומת הדוקים וlity אפיתל Permeabi

בepithelia השונים, מחקרים בהקפאה שבר חושפים ארגון מתוחכם של anastomosing מבני גדיל וחריץ המקיפים את היבט הפסגה של גבולות basolateral. מבנה כמו חגורת התופעה זו ידועה בצומת או zonulaoccludens (איור 9) חזקה והוא האמין לפעול כרגולטור של חדירות האפיתל לשטף paracellular ^{3, 17-20.} צמתים הדוקים עם כמה קווצות תוארו כ" דולף ", בעוד אלו עם ארגון מורכב יותר כפי שתוארו" הדוק ". ארגון זה מופיע כדי להתאים את הפונקציה של epithelia שאליו הם קשורים. PF-פניהם של צמתים הדוקים יופיעו כגדילים בעוד compleme תערוכת EF-הפרצופיםחריצי ntary.

צומת פער ובין תאית תקשורת

צמתים פער (איור 10) מופיעים בהכנות הקפאה שבר של מגוון רחב של רקמות ומיוצגים על ידי מערכים צפופים של חלקיקים על PF-פרצופים ובורות משלימים בEF-פרצופים. מבנים אלה חשבו לייצג אתרי קרום המאפשרים תקשורת בין תאית. ברקמות שבו הם נמצאים, הפגנות של המעבר של צבעים נמוכים משקל מולקולרי ניאון ונתיבי סידן הוכחו ^21-24 טוענים כי הם מייצגים מסלול פיזי למעבר של מולקולות איתות.

פריסת 1 דמותו של צמח / לחרוט להקפיא בר מסחרי. רחוק משמאל הוא דיואר f בלחץeeding קירור חנקן נוזלי לשלב הדגימה וקירור בתנאים מבוקרים זרוע microtome. במרכז היא היחידה עם תא דגימה ובקרה אלקטרונית פנלים בצד הימין. בצד ימין הוא טנק חנקן נוזלי נוסף שבו גז האוורור משמש כדי להביא את תא הדגימה לאווירה.

תא דגימה .2 להקפיא בר / צמח לחרוט איור עם דלת נפתח כדי לחשוף את עמדות של רובי אלקטרונים שמטרת directionally, תכריכי קירור, והדגימה לפרסם בי דגימות בבעלי פליז ממוקמות. דוגמאות מתוודעים לתא דרך יציאה משמאל הקאמרית.

איור 4 שני סוגים של mounts דגימה להקפאה-בר / נהלים לחרוט. (משמאל) חוברת בעל דגימת העתק כפולה משמשת לנוהלי הקפאה שבר קונבנציונליים בוצעו ללא תחריט. הדגימה היא דחוקה בין שני ספחי דגימת זהב ואת מיקומו בחוברת פליז. הדגימה היא שבר על ידי פתיחת החוברת תחת ואקום בתא הדגימה (ראה בהקפאת Fract ure_movie1.mov). (מימין) הר משמש בעיקר להקפאת תחריט. הדגימה ממוקמת על ספחי הזהב ונעלה לבעל פליז. הדגימה היא שבר על ידי גילוח עדין עם סכין גילוח הקבוע בזרוע microtome. תצורה זו היא מועדפת לנוהלי תחריט (ראה בהקפאת etch_movie2.mov).

הכנת איור 5 של דגימה להקפיא בר הר. הדגימה היא דחוקה בין שני mounts זהב () וקפואה בחנקן נוזלי המכיל גם מקוררת פרופאן (חזית) עם העברה לאחר (רקע) מחזיק דיואר המכיל חנקן נוזלי ( B).

"Width =" ig6highres.jpg 500 "/>
איור 6 הפגנה של מיצוב של דגימה להקפיא בר קפוא לתוך חוברת בעל דגימת העתק הכפולה בהכנה למבוא לתא הדגימה של הקפאה-הבר / הצמח לחרוט.

איור 7 אחזור של העתקים הבאים שבר והצללה בהקפאה-הבר / הצמח לחרוט. "" הוא משטח של מים נקי בצלחת מקום. ההעתק ריחף מבדל הדגימה מועבר ל" B "המכיל גם פתרון acidified של dichromate נתרן או אקונומיקה ביתית מלוא עוצמה לעיכול של הרקמה מההעתק. "C" מייצג משטחי מים נקיים לאחר שההעתק ניקה מועבר לפני being תוחזר על רשת במיקרוסקופ אלקטרונים נחושת.

איור 8 ציליה מבנים הקשורים נחשפו על ידי הקפאה שבר. חצים לבנים מצביעה על מערכי חלקיקי קרום מיוחדים על גבול luminal של תאי האפיתל עוברים ciliogenesis. מערכי חלקיקים אלה מייצגים שרשרות הריסים המתהווים אשר מתגוררות בבסיסים של cilia המתהווה והבוגר (חץ שחור). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 9 שבר דרך קרומי תאי אפיתל לחשוף ing דוגמאות של PF- ופרצופי EF-שבר. ארגון הגדיל והחריץ של מתחמי junctional הדוקים ניכר והמרחב אינטר מסומן על ידי חצים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

חלקיקי איור 10. תמונת הקפאה שבר של צומת פער בכבד חולדה. ניכרים ב- PF הפנים ובורות משלימים ניכרות ב- EF הפנים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

4 / "width =" 51694fig11highres.jpg 500 "/>
איור 11. לוקליזציה אימונוהיסטוכימיים של connexin באמצעות זהב colloidal נוגדן הנקראת על הכנה להקפיא בר ממחישה לוקליזציה ספציפית בצומת הפער. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 12. דוגמא של הקפאה מהירה עם תחריט עמוק והצללה סיבובית. תאי אפיתל כבר שבר דרך הציטופלסמה ו- PF פנים ניכר (ראשי חץ). מאחורי ראשי החץ שניתן לראות בתא שטח אמיתי נחשף על ידי תחריט שלאחר מכן. אנא CLICK כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 13. דוגמא של הקפאה מהירה עם תחריט עמוק והצללה סיבובית כדי לחשוף קומפלקסים מולקולריים המרכיבים ciliaryaxoneme לקנה הנשימה שור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

בשנים שלאחר השקתו וזמינות מסחרית, הקפאה שבר / נהלים לחרוט נוצלו באופן נרחב לחקירות של מבנה קרום ביולוגי. ואכן, נקודות המבט הטובות ביותר של חלק מההתמחויות המבניות של קרומים התקבלו בהכנות להקפיא בר / לחרוט. מחקרים אלה לא רק תרמו להבנה של המבנה הארגוני של ממברנות אלא גם סיפקו תובנות כיצד מבנה והתפקוד קשורים.

כניסתו של מיקרוסקופ אלקטרונים ביולוגי שיגרתי הביאה למודעות לכך שטיפולים כימיים עם fixatives אלדהיד, כימיקלים תגובתי, ומתכות כבדות הנדרש למקנה צפיפות אלקטרונים ההפרש לדגימות ביולוגיות עצמם תרמו לדור של חפץ. הפיתוח של טכנולוגית הקפאה שבר היה מבוסס בחלקו על מאמץ להפחית חפץ עיבוד. עם זאת, זה כבר הכיר בכך שהקפאה שבר/ לחרוט מציג סט משלו של חפצים, גדול שאחד מהם הוא נזק גביש קרח. רקמות צללו ישירות לתוך חוויה חנקן נוזלית שיעור קירור מופחת עקב היווצרות של שכבת בידוד של גז חנקן המקיפה את הדגימה שתוצאתה ההיווצרות של גבישי קרח שלהשמיד פירוט ultrastructural. בעיה זו היא להתגבר עם השימוש בcryoprotectants כגון גליצרול ועל ידי הקפאת הרקמה הראשונה בפרופאן מקורר חנקן הנוזלי. מבחינה הסטורית, הקפאה לצלול בוצעה בחנקן נוזלי מקוררת כלורו אבל חומרים אלו בהדרגה שימוש עקב תופעות הלוואי שלהם על הסביבה. אפילו בתנאים הטובים ביותר cryoprotective, טבעו של תהליך תוצאה גסה, חצץ כמו פני השטח בשברי cytoplasmic באופן בלתי נמנע; עם זאת, שברים באמצעות מבני קרום לחשוף תכונות מאורגנות היטב שיש ארגונים מישוריים ספציפיים ביחס לאורינטציה שלהם בקרום התא. תמונות אלה הןאפשרי עם השימוש של סוכני cryoprotectant כגון גליצרול המגבילים את נזק גביש קרח, וגליצרול עצמו בחלק מהמקרים רק יכול גם להציג חלוקה מחדש artifactual של חלקיקי קרום קשור. יתר על כן, גליצרול לא ניתן לעדן מהמשטח הסדוק ובכך להגביל את ההזדמנות לתחריט מוצלח. אם הליך התחריט שלאחר מכן רצוי, ולאחר מכן הדגימה חייבת להיות קפוא במהירות באופן שמגביל את נזק גביש קרח או באמצעות רפש הליום או חנקן נוזלי ו / או התקרב על ידי השימוש בcryoprotectant כגון אצטון המזדכך בקלות מבר משטחים.

למרות שהדו"ח הראשוני של ההיגוי התמקד בהדמית וירוסים, זה הוא במבנה קרום שהקפאה שבר / לחרוט מצא יישום נרחב יותר. ואכן, מבנים כגון צמתים הדוקים ופער והתמחויות קרום הריסים נחשפו באלגנטיות בהכנות הקפאה שבר. יש להקפיא בר founשירות ניכר ד בהשגת הבנה של בידול קרום במהלך פיתוח ^{15, 17,24} ובפתולוגיה קרום ^25-30. דיווחים קודמים ממעבדה זו, הדגימו את הדפוס של בידול של מתחמי junctional הדוקים במהלך פיתוח דרכי נשימה, שיבוש של מבני ריסי קרום הקשורים לחשיפת גורם מדבקת ניסיונית, והשפלה של מתחמי junctional הדוקים בתאי האפיתל בדרכי נשימה הקשורים בזיהום אוויר וחשיפה לעישון טבק בחיות מעבדה ובני אדם.

הרחבות טכניות של ההקפאה-בר / הקפאה-לחרוט נוהל

שיטת מרווה באמצעות פרופאן הנוזלי להקפיא דגימות שתוארו כאן היא אולי הגישה הנפוצה ביותר להקפאת דגימות ביולוגיות להקפאה שבר קונבנציונלי. עם זאת, גישות אחרות להקפאה חייבת להיות ניכסו בי הקפאת תחריט הוא להיות לבצעed. מאז גליצרול הוא לא etchablecryoprotectant, דגימות להקפאת תחריט חייב להיות קפוא בדרכים המגבילות את היווצרות גבישי קרח. זה עשוי להיות מושגת על ידי שימוש בetchablecryoprotectant כגון אצטון ו / או על ידי הקפאת דגימת הר כנגד משטח מתכת מקוררת עם הליום נוזלי או רפש חנקן נוזלי. הקפאה מהירה ללא cryoprotectants גם יכולה להיות מושלמת באמצעות הקפאת תרסיס או בלחץ גבוה הקפאה בפרופאן הנוזלי.

המאמצים אחרונים להתייחס טכנולוגית הקפאה שבר באמצעות מבנה ותפקוד נוסף נכסו לטכניקה זו בתיאום עם תיוג immunohistochemical ^{31 ב, 32.} כאן, נוגדנים לאנטיגנים ספציפיים יכולים להיות מקומיים ביעילות ובדייקנות לאתרי קרום (איור 11).

בעוד הקפאה שבר עם הצללה חד כיווני הוא ללא ספק הפרוטוקול הנפוץ ביותר, כמה עיצובים ניסיוניים יקראו להקפאה מהירה עם littlדואר או cryoprotection המוגבל, מלווה בתחריט של פני השטח הסדוקים לחשוף משטחים אמיתיים תא, מטריצת חוץ תאית, ו / או מתחמי macromolecular, והצללה סיבובית להקנות ניגוד ¹⁶ (איור 12 ואיור 13).

יש עניין הולך וגובר ביישומים של הקפאה שבר בננוטכנולוגיה, מדע חומרים, ובשימוש בטכניקה זו ככלי הדמיה בביולוגיה מולקולרית. ואכן, ננו במובנים רבים עשוי להיות עקבי בארגון שלהם עם מבנים נגיפיים שהקפאה שבר היה שחזה במקור כאמצעי להדמיה. יתר על כן, ליפוזומים מיוצרים, מבנים דומים בצורתו לממברנות ביולוגיות, הם נחקרים באופן נרחב למסירה ממוקדת של סוכני תרופות וריפוי גנטי מכוון. בגלל הארגון שלהם הוא למעשה קרום כמו, עיבוד בהקפאה שבר יכול להיות כלי משמעותי בייצור תמונות חושפניות כמרכיב בdeveloלאותת טיפולים אלה ^33.

לסיכום, טכנולוגיות הקפאה שבר היו בעל חשיבות היסטורית באפיון הארגון והתפקוד של קרום תא. עם זאת, הקפאה שבר הוא למצוא תחומים חדשים של שירות בתיאום עם ביולוגיה מולקולרית וננוטכנולוגיה וקרובה לוודאי יתרום להתקדמות בתחומים מתפתחים במהירות אלה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant	Balzers	BAF400T
Standard buffers	various suppliers
Standard aldehyde fixatives	various suppliers
Sodium dichromate	various suppliers
Sulfuric acid	various suppliers
Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation	Technotrade International
Liquid nitrogen	various suppliers
Propane	various suppliers
Disposable supplies for electron microscopy	Electron Microscopy Sciences
Transmission electron microscope	Carl Zeiss Inc.