Summary
Techniques et d'améliorations du traitement cryofracture des échantillons biologiques et des nanomatériaux, pour examen par microscopie électronique à transmission de base sont décrites. Cette technique est une méthode préférée pour révéler caractéristiques ultrastructurales et les spécialisations des membranes biologiques et pour obtenir des données dimensionnelles et spatiales niveau ultrastructural en sciences des matériaux et produits de la nanotechnologie.
Abstract
Cryo-fracture / gel de mordançage décrit un processus par lequel des spécimens, généralement biologique ou nanomatériaux dans la nature, sont gelés, fracturée, et reproduit pour générer un rapport carbone / platine "jeter" destiné à l'examen par microscopie électronique à transmission. Les échantillons sont soumis à des vitesses de congélation ultra-rapides, souvent en présence d'agents cryoprotecteurs pour limiter la formation de cristaux de glace, à la suite de la fracture de l'échantillon à la température de l'azote liquide refroidi sous vide poussé. La surface résultante est répliqué fracturé et stabilisé par l'évaporation de carbone et le platine à partir d'un angle qui confère une surface tridimensionnelle détaillée de la distribution. Cette technique s'est avérée particulièrement éclairante pour l'étude des membranes cellulaires et de leurs spécialisations et a considérablement contribué à la compréhension de la forme cellulaire de la fonction des cellules liées. Dans ce rapport, nous passons en revue les exigences de l'instrument et le protocole technique pour effectuergel-fracture, la nomenclature et les caractéristiques des plans de fracture associée, variations de la procédure conventionnelle, et les critères d'interprétation des images de fracture par congélation. Cette technique a été largement utilisée pour l'enquête ultrastructurale dans de nombreux domaines de la biologie cellulaire et est très prometteur comme une technique d'imagerie moléculaire pour émergents, nanotechnologies, matériaux et études scientifiques.
Introduction
Le concept et l'application pratique de la transformation cryofracture des échantillons biologiques a été introduit par Steere 1 plus de la moitié il ya un siècle. L'appareil approprié début composants disparates en une unité autonome de travail 1. L'appareil initial a été modifié et affiné dans des instruments disponibles dans le commerce afin de répondre au besoin critique pour la manipulation à distance, le maintien de vide poussé, et l'évaporation du carbone et des métaux pour produire une réplique appropriée pour l'examen par microscopie électronique à transmission (figure 1 et figure 2).
L'instrument typique se compose d'une chambre à vide élevé avec la table d'échantillon et ayant des bras microtome peut réguler des débits d'azote liquide (figure 1). La chambre abrite aussi deux canons à électrons, pour stabiliser une évaporation de carbone positionné à un angle de 90 ° de la platine porte-objet et l'autre pour les platinum / carbone ombrage à un angle ajustable, 15 ° - 45 ° (Figure 2). L'alimentation de l'appareil est appliqué à faire fonctionner la pompe à vide et des panneaux électroniques réguler réglage de la température et de l'électron contrôle des armes à feu.
Conçu à l'origine comme un moyen de parvenir à une meilleure imagerie de virus, de gel-fracture gagné encore plus de popularité en tant que technique pour l'examen et l'analyse des membranes cellulaires et leurs spécialisations 2, 3. En effet, cette procédure a fait partie intégrante d'élucider les relations structure / fonction des cellules et des tissus et la plupart de ces études se tiennent comme des contributions classiques de biologie cellulaire et moléculaire 4-9. Le principal objectif et la justification du développement de la technique de congélation-fracture était de limiter les artefacts observables au microscope électronique la résolution découlant de la fixation chimique et traitement utilisé dans la microscopie conventionnelle d'électrons biologique. Ici le but est de limiter chimiquefixation et à congeler l'échantillon avec une vitesse suffisante et souvent en présence d'un cryoprotecteur afin de limiter la formation de cristaux de glace et d'autres objets de congélation. Plus récemment, cette technique a trouvé un regain d'intérêt des biologistes moléculaires et chercheurs en science des matériaux pour l'examen des nanoparticules et des nanomatériaux.
Images cryofracture et gel-gravure présentent un caractère tridimensionnel et sont parfois confondus avec des photographies au microscope électronique à balayage. Cependant, les préparations de fracture par congélation sont examinés par microscopie électronique à transmission et leur contribution majeure aux études morphologiques en haute définition est la représentation unique d'éléments de structure / fonction des membranes cellulaires. Cryo-fracture traitement est initié par congélation des cellules et des tissus avec une vitesse suffisante pour limiter la cristallisation de la glace et / ou avec l'utilisation d'agents cryoprotecteurs tels que le glycérol. Les échantillons sont ensuite fracturées sous vide et un représentantlica est généré par l'évaporation de carbone et le platine sur la surface fracturée. L'échantillon initial est digéré de la réplique qui est récupéré sur une grille standard de l'échantillon EM. Une autre erreur d'interprétation commune des images de fracture par congélation, c'est qu'ils représentent la surface des cellules. Toutefois, le principe de base de cryofracture est que les membranes biologiques sont répartis à travers la bicouche lipidique par le processus de rupture (figure 3). Ce processus dans les membranes biologiques donne deux faces de rupture, une qui indique l'organisation de la moitié de la membrane adjacente au cytoplasme, le PF-face, et qui montre la moitié de la valve bimoléculaire de la membrane qui est adjacente à la extracellulaire milieu, l'EF-face. La surface des cellules de véritables ne sont pas représentés dans les images de fracture par congélation, mais apparaissent uniquement lorsque l'étape supplémentaire ultérieure de gel de gravure en suivant la procédure de rupture est utilisé. Afin de graver efficacement des échantillons prélevés antérieurement fracturés pour révéler detai de surfacel, les échantillons doivent être congelés à un rythme rapide et sans unetchablecryoprotectant. La gravure de l'eau à partir de la surface de l'échantillon fracturé qui révèlent des caractéristiques sous-jacentes est réalisée en positionnant le bras microtome de refroidissement au-dessus de la platine porte-objet de créer un différentiel de température entre la phase de maintien de l'échantillon et le bras microtome de refroidissement qui amène l'eau à se sublimer à partir de la surface. Lorsque l'eau est sublimée à partir de la surface de l'échantillon fracturé lors de la manoeuvre de gravure par congélation, puis les aspects de surfaces réelles de cellules, la matrice extracellulaire, des structures cytosquelettiques, et des assemblages moléculaires peuvent être révélées à haute résolution. Ainsi gel fracture et le gel gravure ne sont pas des termes interchangeables mais reflète un processus par étapes dont la dernière peut-être pas nécessaire ou souhaitable en fonction des besoins de l'étude.
Après la cryofracture / gel de mordançage procédures, les surfaces fracturées sont soumis à l 'évaporation dirigéstive couches de carbone et de platine, afin de fournir un appui et d'imagerie à contraste de la réplique. Le / carbone imagerie évaporation du platine peut être unidirectionnelle ou rotatif et est accompli par résistance ou des canons à électrons. Observation unidirectionnelle à partir d'un angle connu, généralement de 30 ° - 45 °, est utile dans l'exercice de certains calculs morphométriques. Les échantillons qui ont été soumis à profondeur de gravure sont généralement rotatif ombre et les images résultantes de ces spécimens sont photographiquement inversés pour l'évaluation.
L'historique ainsi qu'un objectif actuel du / technique de gel-gravure cryofracture est de limiter la fixation et le traitement chimique spécimen objets qui sont associés à des procédures plus classiques de transmission de microscopie électronique. Cependant, cette technique présente un avantage substantiel dans sa capacité à conférer détail en trois dimensions, et donc de faciliter l'acquisition de données morphométriques dans biologique, la science des matériaux, et nspécimens anotechnology. Procédures cryofracture et gel-gravure sont complexes et à multiples facettes et certains aspects de son application sont personnalisés. Cette présentation offre une vue de l'enquête sur les principales caractéristiques du processus et le lecteur est renvoyé à des protocoles complets publiés 10, 11 afin de traiter les détails et personnaliser le processus pour les besoins de recherche spécifiques.
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Protocol
1 Préparation des spécimens biologiques pour Cryo-fracture / Gel-gravure
- Utilisation d'une formulation de fixateur EM classique tel que glutaraldéhyde à 2% + 2% de paraformaldehyde dans du tampon phosphate 0,1 M pendant 1 heure. à effectuer la fixation primaire de tissus biologiques. REMARQUE: Bien qu'il soit souhaitable de geler certains types de spécimens sans fixation préalable, universels pathogènes à diffusion hématogène précautions prescrivent fixation appropriée lorsque l'échantillon est constitué de tissus humains.
- Après la fixation primaire, rincer l'échantillon dans le même tampon additionné de 0,2 M de saccharose de pas plus de 1 heure.
- Transférer le spécimen dans une solution cryoprotectrice consistant en 25% de glycerol dans du tampon phosphate 0,1 M pendant au plus 1 h.
2. de congélation et de stockage des échantillons En avance cryofracturation
- Sélectionnez or ou cuivre spécimens talons de taille et la forme de l'échantillon approprié en cours de traitement (Figure 4
- En utilisant des pinces fines de qualité et / ou de petit calibre de la position des aiguilles de seringues de petits fragments de l'échantillon sur le haut d'une tubulure de prélèvement de métal.
- Réduire la teneur en liquide de l'échantillon à un collant, un peu comme la consistance de la colle par soutirage de liquide à partir du bord de l'embout avec un papier filtre.
- Pour répliques simples, utiliser de petites aiguilles de seringues de calibre pour créer un monticule de tissu sur le talon. Pour deux répliques, inverser autre talon et le positionner exactement sur le talon et le placer légèrement sur la surface de l'échantillon créer un sandwich (figure 5A). N'appuyez pas sur l'échantillon d'entre les deux talons.
- Remplir deux navires de Dewar isolés avec de l'azote liquide. NOTE: Le premier récipient recevant un poste de métal contenant un petit puits qui est utilisé pour liquéfier un petit volume de gaz propane à partir d'une bouteille du commerce (Figure 5B). Le deuxième bâtiment est un stockage partitionné / récipient de maintien d'une brèvement maintenir les échantillons congelés dans l'azote liquide.
- Utilisation de la buse du cylindre positionné dans le puits de propane, d'ouvrir le robinet de la bouteille et permet au gaz de s'écouler dans le puits de la première cuve où il se liquéfie. NB: ATTENTION !! PROPANE est explosif, peut causer des blessures AU CONTACT congélation et asphyxiant. Utilisez propane seulement dans une hotte chimique homologué pour cet usage en prenant soin aussi d'éviter les sources d'inflammation étrangers, en utilisant des vêtements de protection contre les températures basses, et le maintien d'une ventilation adéquate.
- Aussi rapidement que possible, ramasser les spécimen de montage avec une pince fine de qualité et plongent dans le gaz liquéfié dans le premier récipient pendant plusieurs secondes, puis transférer rapidement à la deuxième cuve de maintien de l'azote liquide (figure 5B).
- Une fois les échantillons sont congelés, magasin sous azote liquide avant d'être prêt à transférer à l'usine de congélation-fracture. Transfert talons à un azote liquide contenant de Dewar de stockage plus étendue pourstockage si on le souhaite, les soins ne doit cependant veiller à ne pas laisser les talons à décongeler.
3 Fonctionnement de la cryofracture instrument et de traitement des échantillons
- Chargement des échantillons sur le support en laiton et dans la chambre
- Charger l'échantillon d'or talons en double réplique porte-échantillon du type de livret ou dispositif serrer sous azote liquide et y maintenir jusqu'au moment de les placer dans la chambre de spécimen (figure 6).
- Lorsque la chambre a atteint un vide élevé (environ 2 x 10 -6 mbar) et la scène a été refroidie à la température de l'azote liquide, éteindre la pompe, purger la chambre, et positionner les échantillons talons monté sur la table de l'échantillon le plus rapidement possible .
- Mettez la pompe, rétablir vide poussé, et utiliser des contrôles de la scène et de la température de bras électroniques pour ajuster la température de la table de l'échantillon à 100 ° C et de l'azote liquide directement sur le bras microtome et bring à la température de l'azote liquide.
- Le processus de fracture
- Après la réalisation de vide élevé, une température de l'étage de -100 ° C et bras microtome à la température de l'azote liquide, ouvrir à distance le support double réplique de l'échantillon fracturation ainsi les spécimens sur les supports d'échantillon (gel fracture_movie1.mov).
- Dans le cas des échantillons destinés à la rupture suite à la gravure, l'utilisation d'une lame de rasoir maintenue dans un dispositif de serrage sur le bras microtome à raser (à savoir, la rupture) de la surface des échantillons à la place de l'étape 3.2.1 (gel-etch_movie2.mov).
- Si l'étape de gravure par congélation est ajouté à réaliser, positionner le bras microtome refroidi sur les surfaces de rupture de l'une à plusieurs minutes. NOTE: Cette manœuvre sera sublime (c'est à dire, gravure) de l'eau de la surface fracturée. L'effet de cette manoeuvre est de révéler de véritables surfaces de cellules, la matrice extracellulaire et / ou d'assemblages moléculaires par sublimation de l'eau, en plus de framage faces traversant la bicouche lipidique des membranes.
- observation de métal et le soutien de réplique évaporation en utilisant des canons à électrons
- Activer le pistolet platine / électronique de carbone ou de la résistance et laisser évaporer une couche mince (environ 2 nm) de platine / carbone sur la surface fracturée d'un angle de 30 ° - 45 °. Cela nécessite généralement environ à 15 - 20 sec.
- Activez l'électron de carbone ou de la résistance pistolet comme à l'étape 3.3.1 et évaporer une mince couche de carbone à la surface de l'échantillon fracturé directement à la verticale (90 °) à apporter un soutien à la réplique. Cela nécessite généralement environ à 15 - 20 sec.
- Récupération des répliques
- À la fin de la réplication observation et la stabilisation de carbone, éteignez la pompe à vide, évacuation de la chambre, et supprimer le spécimen de montage de l'instrument.
- En utilisant une paire de pinces fines de qualité supprimer chaque talon de modèle d'or de la doubleréplique livret / pince et laisser décongeler pendant plusieurs secondes avant de baisser légèrement le talon sur une surface de l'eau dans une plaque de place (Figure 7). REMARQUE: La réplique de carbone / platine contenant du matériau d'échantillon adhérent flottera sur la surface de l'eau.
- Manœuvrer les répliques à l'aide soit d'une boucle de fil fin ou d'une grille de microscope électronique de cuivre conventionnelle tenue par une pince de qualité fine et le transfert à une autre plaque spot contenant du dichromate de sodium à 5% dans de l'acide sulfurique à 50% pour une à plusieurs heures. NOTE: Ce bain digère la matière de l'échantillon biologique réelle de la réplique. Pleine force de Javel peut être remplacé par la solution d'acide dichromate / sulfurique.
- Lorsque la digestion est terminée, de transférer la réplique à une surface arrière de l'eau propre et récupérer sur une grille de microscopie électronique en cuivre standard. (REMARQUE: Les répliques peuvent se fragmenter en petits morceaux lors de la digestion, mais même de très petites répliques peut contenir des informations importantes et devrait être retrieved et examiné.) magasin réplique soutenir les réseaux disponibles dans le commerce en cases de la grille où ils resteront stables pendant des années avec une manipulation en douceur.
4. ultrastructurale examen de cryofracture / Répliques de gravure
- Voir répliques dans un microscope électronique en transmission à une tension d'accélération typiquement de 50 à 80 kV.
- Enregistrer des images pertinentes sur le film de TEM standard ou avec un appareil photo numérique haute résolution.
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Representative Results
Le principe clé de cryofracture l'interprétation des images est que des plans de fracture traversent la bicouche lipidique des membranes donnant deux faces de rupture, appelé par convention, le PF-face (plasma fracture-face) et EF-face (extracellulaire fracture-face) (Figure 3). Le PF-face est la moitié de la membrane bicouche lipidique adjacente au cytoplasme de la cellule et l'EF-face est la moitié de la membrane bicouche lipidique adjacent au milieu extracellulaire. La technique de congélation-fracture est particulièrement utile pour l'étude de la structure de la membrane et les deux faces sont généralement totalement différent avec PF-faces étant peuplées de nombreuses particules associées à membrane contrairement à EF-faces qui contiennent moins. Le contenu cytoplasmiques de cellules de gel fracturé sont généralement grossier en apparence et ne sont pas particulièrement révélateurs, bien que liés à la membrane des organites tels que les noyaux et l'appareil de Golgi peuvent être facilement identifiés. Un intérêt particulier pour investigators utilisant cette technique sont des spécialisations de la structure de membrane qui peuvent être interprétées pour leur fonction. Ceux-ci comprennent les distributions spécifiques de particules associées à la membrane, spécialisations membranaires ciliaires, et les jonctions intercellulaires.
Structures de Cilia-associé
Résidant dans la membrane cellulaire à la base de chaque cil et flagelle eucaryote est un réseau de particules associées à la membrane divisée en brins entourant l'arbre du cil et connu sous le collier ciliaire (figure 8) de 12 à 16. Cette structure présente un certain degré d'hétérogénéité morphologique dans diverses espèces, et il a été spéculé comme mesure multifonctionnel tel qu'il apparaît avant l'émergence de la tige ciliaire pendant ciliogenèse et reste en place dans le cil mature. Le collier ciliaire naissant dérive de l'agrégation et de l'organisation des matrices de particules de la membrane avant le moment de l'emergence de l'arbre ciliaire pendant ciliogenèse suggérant sa possible participation à l'organisation au début de l'axonème développement 14.
Jonctions serrées épithéliales épidermoïdes et Permeabi lité
Dans divers épithéliums, études cryofracturation révèlent une organisation sophistiquée de l'anastomose brin rainure et structures qui entourent la face apicale des frontières basolatérales. Cette structure en forme de bande est connue comme la jonction ou zonulaoccludens (figure 9) étanche et est censé agir comme un régulateur de la perméabilité paracellulaire epitheliale au flux 3, 17-20. Les jonctions serrées avec quelques mèches ont été décrits comme "fuit" tandis que ceux avec plus d'organisation complexe sont décrits comme "serré". Cette organisation semble correspondre à la fonction de l'épithélium à laquelle ils sont associés. Les PF-faces de jonctions serrées apparaissent comme des brins tandis que le EF-faces exposition COMPLEMrainures parlementaire supplémentaire.
Gap jonctions intercellulaires et Communication
Gap jonctions (figure 10) apparaissent dans les préparations de fracture par congélation d'une variété de tissus et sont représentés par des réseaux denses de particules sur PF-faces et les fosses complémentaires sur EF-faces. Ces structures sont pensés pour représenter des sites de la membrane qui facilitent la communication intercellulaire. Dans les tissus où ils sont présents, les manifestations du passage de faible poids moléculaire des colorants fluorescents et des flux de calcium ont été mis en évidence 21 à 24 ce qui suggère qu'ils constituent une voie physique pour le passage de molécules de signalisation.
Figure 1: Aménagement d'un cryofracturation usine / de gravure commerciale. À l'extrême gauche est une pression Dewar feeding de refroidissement de l'azote liquide à la phase de refroidissement de l'échantillon et le bras microtome dans des conditions contrôlées. Au centre est l'unité de la chambre de l'échantillon et de contrôle électronique des panneaux vers la droite. A droite, un réservoir d'azote liquide supplémentaire à laquelle le gaz de purge est utilisée pour amener la chambre à échantillon à l'atmosphère.
Figure chambre de spécimen 2 cryofracturation / usine de gravure avec porte s'ouvrit pour révéler les positions de canons à électrons directionnelle visant, carénage de refroidissement, et l'échantillon poster où les spécimens dans des supports en laiton sont positionnés. Spécimens sont introduits dans la chambre à travers un port à la gauche de la chambre.
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Figure 4 Deux types de supports d'échantillon pour cryofracturation / procédures de gravure. (Gauche) Un double réplique porte-échantillon livret est utilisé pour les procédures de fracture par congélation classiques effectuées sans gravure. L'échantillon est pris en sandwich entre deux échantillons talons d'or et placé dans le livret de laiton. L'éprouvette est rompue par l'ouverture du livret sous vide dans la chambre à échantillon (voir par congélation fract ure_movie1.mov). (À droite) Un montage utilisé principalement pour le gel gravure. L'échantillon est placé sur les bouts d'or et verrouillé dans le support de laiton. L'éprouvette est rompue par le rasage doux avec une lame de rasoir fixe dans le bras microtome. Cette configuration est préférée pour les procédures de gravure (Voir gel etch_movie2.mov). 
Figure 5 Préparation d'un échantillon de gel-fracture de montage. L'échantillon est pris en sandwich entre deux supports d'or (A) et congelé en azote liquide et contenant refroidi propane (au premier plan) avec transfert ultérieur à une exploitation Dewar contenant de l'azote liquide (fond) ( B).
Figure 6 Mise en évidence de positionnement d'un spécimen de fracture par congélation congelés dans la double porte-échantillon réplique livret en vue de l'introduction dans la chambre d'échantillon de la / plante de gravure cryofracture. 
Figure 7 Récupération des répliques suivantes fracture et d'ombrage dans le / usine de gravure cryofracture. «A» est une surface de l'eau propre dans une plaque de place. La réplique flotté de l'embout de spécimen est transférée à "B" d'un puits contenant une solution acidifiée de bichromate de sodium ou de la pleine force de Javel à la digestion du tissu à partir de la réplique. «C» représente surfaces ultérieures de l'eau potable à laquelle la réplique nettoyé est transféré avant bEING récupéré sur une grille de microscopie électronique en cuivre. 
Figure 8: Cilia Les structures liées révélés par cryofracture. Flèches blanches pointent vers des réseaux spécialisés de particules de membrane sur la frontière luminale des cellules épithéliales subissant ciliogenèse. Ces tableaux de particules représentent colliers ciliaires naissantes qui se trouvent à la base des cils émergentes et matures (flèche noire). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 9 fracture à travers les membranes des cellules épithéliales révèlent ment des exemples de PF et visages EF-fracture. L'brin rainure et organisation des complexes de jonction serrés est évident et l'espace intercellulaire est indiqué par des flèches. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 10 Une image cryofracture d'une jonction de l'écart dans le foie de rat. Particules sont visibles sur le PF-face et fosses complémentaires sont visibles sur le EF-face. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 11 immunohistochimique localisation d'une connexine en utilisant un anticorps marqué l'or colloïdal sur une préparation cryofracturation illustrant la localisation spécifique à la jonction de l'écart. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 12 Un exemple de congélation rapide avec gravure profonde et l'ombrage rotatif. L'cellules épithéliales a été fracturé à travers le cytoplasme et un PF-face est évidente (pointes de flèches). Derrière les flèches on peut voir une surface cellulaire vrai révélée par gravure ultérieure. S'il vous plaît click ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 13 Un exemple de congélation rapide avec gravure profonde et l'ombrage rotatif pour révéler complexes moléculaires comprenant un ciliaryaxoneme bovine de la trachée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans les années suivantes de son introduction et la disponibilité commerciale, la lyophilisation fracture / procédures de gravure ont été largement utilisés pour les enquêtes de structure de la membrane biologique. En effet, les meilleurs points de vue de certains des spécialisations structurales de membranes ont été obtenus dans des préparations cryofracture / gravure. Ces études ont contribué non seulement à la compréhension de l'organisation structurale des membranes, mais aussi fourni des indications sur la façon dont la structure et la fonction sont liées.
L'avènement de la microscopie électronique biologique de routine a une prise de conscience que les traitements chimiques avec les fixateurs aldéhydiques, des produits chimiques réactifs, et des métaux lourds nécessaires pour conférer la densité électronique différentiel de spécimens biologiques elles-mêmes ont contribué à la production de l'artefact. Le développement de la technologie de congélation-fracture a été fondée en partie sur un effort pour réduire le traitement artefact. Néanmoins, il a été reconnu que la cryofracture/ Gravure introduit son propre ensemble d'objets, un problème majeur qui est dommage de cristaux de glace. Les tissus plongés directement dans l'expérience de l'azote liquide une vitesse de refroidissement est réduite en raison de la formation d'une couche isolante de l'azote gazeux entourant le spécimen, qui résulte en la formation de cristaux de glace qui effacent détail ultrastructural. Ce problème est résolu par l'utilisation d'agents cryoprotecteurs tels que le glycérol et en congelant d'abord le tissu dans de l'azote liquide propane-refroidi. Historiquement, plongeon congélation a été réalisée dans de l'azote liquide refroidi chlorofluorocarbones mais ces matériaux ont été retirés du service en raison de leurs effets néfastes sur l'environnement. Même dans les meilleures conditions cryoprotecteurs, la nature du processus conduit inévitablement à une grossière, gravier comme surface dans les fractures cytoplasmiques; Cependant, les fractures grâce à des structures membranaires caractéristiques révèlent bien organisés organismes ayant planes spécifiques par rapport à leur orientation dans la membrane cellulaire. Ces images sontpossible seulement avec l'utilisation d'agents cryoprotecteurs tels que le glycérol qui limitent les dommages des cristaux de glace, et le glycérol lui-même dans certains cas, peut également présenter un artefact de redistribution des particules associées à la membrane. Par ailleurs, le glycérol ne peut pas être sublimé à partir de la surface fracturée limitant ainsi la possibilité de gravure réussie. Si la procédure de gravure ultérieure est souhaitable, alors l'échantillon doit être soit congelés rapidement dans un mode qui limite les dommages des cristaux de glace utilisant un liquide de l'hélium ou de l'azote par embouage et / ou approchée par l'utilisation d'un agent cryoprotecteur tel que l'acétone, qui est facilement sublimé à partir de fracture surfaces.
Bien que le rapport initial de Steer a été axé sur l'imagerie virus, il est dans la structure de la membrane qui cryofracturation / gravure trouvé plus vaste application. En effet, des structures telles que les jonctions serrées et d'écart et les spécialisations de la membrane ciliaire ont été élégamment révélé dans les préparations de fracture par congélation. Cryofracturation a fond une utilité considérable dans la réalisation de la compréhension de la différenciation de la membrane au cours du développement 15, 17,24 et dans la membrane pathologie 25-30. Des rapports antérieurs du laboratoire, ont mis en évidence le schéma de différenciation des complexes de jonction serrés au cours du développement des voies aériennes, la perturbation des structures de membranes ciliaires associés à l'exposition de l'agent infectieux expérimentale, et la dégradation des complexes de jonction serrés dans les cellules épithéliales des voies respiratoires associés aux polluants de l'air et exposition à la fumée les animaux de laboratoire et des sujets humains.
Extensions techniques de la cryofracture / gel de mordançage procédure
Le procédé de trempe en utilisant du propane liquéfié à congeler les échantillons décrits ici est peut-être l'approche la plus commune à la congélation des échantillons biologiques pour cryofracturation classique. Cependant, d'autres approches à la congélation doivent être prélevées où le gel-gravure est à effectueréd. Depuis le glycérol est un non-etchablecryoprotectant, des spécimens de gel de gravure doivent être gelés de manière à limiter la formation de cristaux de glace. Ceci peut être accompli en utilisant un etchablecryoprotectant tel que l'acétone et / ou par congélation de l'échantillon sur une surface de montage en métal refroidi par de l'hélium liquide ou de la neige fondue de l'azote liquide. Congélation rapide sans cryoprotecteurs peut également être effectuée en utilisant le gel de pulvérisation ou de congélation à haute pression du propane liquéfié.
Les efforts récents pour rapporter en outre l'utilisation de la technologie de congélation-fracture de la structure et la fonction sont approprié cette technique de concert avec marquage immunohistochimique 31, 32. Ici, les anticorps dirigés contre des antigènes spécifiques peuvent être efficacement et avec précision à des sites localisés de la membrane (figure 11).
Alors que cryofracturation avec observation unidirectionnelle est de loin le protocole le plus utilisé, certains modèles expérimentaux appellent à une congélation rapide avec petie ou cryoprotection limité, accompagné par gravure de la surface fracturée de révéler vraies surfaces cellulaires, la matrice extracellulaire et / ou de complexes macromoléculaires et ombrage rotatif pour conférer contraste 16 (Figure 12 et Figure 13).
Il ya un intérêt croissant dans les applications de congélation-fracture dans les nanotechnologies, la science des matériaux et en utilisant cette technique comme un outil d'imagerie en biologie moléculaire. En effet, les nanomatériaux à bien des égards peuvent être compatibles dans leur organisation avec les structures virales pour lesquelles cryofracturation a été prévu à l'origine comme un moyen pour l'imagerie. En outre, les liposomes fabriqués, des structures similaires en forme de membranes biologiques, sont largement étudiés pour l'administration ciblée d'agents pharmaceutiques et la thérapie génique dirigé. Parce que leur organisation est essentiellement membrane comme, le traitement de gel-fracture peut avoir une utilité considérable dans la production d'images révélant comme une composante à déveping ces thérapies 33.
En résumé, les technologies de fracture par congélation ont été d'une importance historique dans la caractérisation de l'organisation et de la fonction des membranes cellulaires. Cependant, cryofracture est de trouver de nouveaux domaines d'utilité en coordination avec la biologie moléculaire et la nanotechnologie et presque certainement contribuer aux progrès dans ces domaines en émergence rapide.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant | Balzers | BAF400T | |
| Standard buffers | various suppliers | ||
| Standard aldehyde fixatives | various suppliers | ||
| Sodium dichromate | various suppliers | ||
| Sulfuric acid | various suppliers | ||
| Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation | Technotrade International | ||
| Liquid nitrogen | various suppliers | ||
| Propane | various suppliers | ||
| Disposable supplies for electron microscopy | Electron Microscopy Sciences | ||
| Transmission electron microscope | Carl Zeiss Inc. |
References
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