Um die zellulären und molekularen Mechanismen neotissue Bildung und Stenose Entwicklung in Gewebezüchtungen Herzklappen zugrunde liegen, wurde ein Maus-Modell der heterotopen Herzklappentransplantation entwickelt. Eine Lungenherzklappe wurde mit der heterotopen Herztransplantation Technik, um Empfänger transplantiert.
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Methodenartikel
Transplantation von Pulmonalklappe Mit einem Maus-Modell der heterotopen Herztransplantation
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Gewebezüchtungen Herzklappen, insbesondere dezellularisiert Ventile, beginnen die Dynamik in der klinischen Anwendung der rekonstruktiven Chirurgie mit gemischten Ergebnissen zu gewinnen. Allerdings sind die zellulären und molekularen Mechanismen der Entwicklung neotissue Ventil Verdickung und Stenose Entwicklung nicht umfassend erforscht. Um die oben genannten Fragen zu beantworten, haben wir eine Maus heterotopen Herztransplantationsmodell Ventil. Herzklappe aus einer Ventil Donor Maus geerntet und in einem Herzen Spendermaus transplantiert. Das Herz mit einem neuen Ventil wurde heterotop an einen Empfänger der Maus transplantiert. Das transplantierte Herz zeigte seinen eigenen Herzschlag, unabhängig von der Herzschlag des Empfängers. Der Blutfluss wurde mit Hilfe eines Hochfrequenz-Ultraschallsystem mit einem gepulsten Doppler quantifiziert. Der Fluss durch die Pulmonalklappe implantiert zeigte Vorlauf mit minimaler Regurgitation und der Peak-Flow-nahe 100 mm / Sek. Dieses Mausmodell der Herzklappentransplantation ist highly vielseitig, so kann es modifiziert und angepasst ist, um verschiedene hämodynamische Umgebungen und / oder mit verschiedenen transgenen Mäusen verwendet, um neotissue Entwicklung in einer Gewebezüchtung Herzklappe zu untersuchen ist.
Einleitung
Angeborene Herz-Kreislauf Mängel sind eine der Hauptursachen der Kindersterblichkeit in der westlichen Welt 1,2. Unter ihnen Pulmonalklappe Stenose und Prämolaren Aortenklappe Defekte sind eine häufig auftretende Form 3. Herzklappenersatz-Operation ist eine Routine Wahl rekonstruktive Operationen; jedoch Komplikationen wie Stenose und Verkalkung der Herzklappe, und des lebenslangen Abhängigkeit von Antikoagulantien sind eine bedeutende Quelle der chronischen Krankheit und Tod 07.04. Darüber hinaus der Mangel an Wachstumspotenzial erfordert Revisionsoperationen, die die Sterblichkeit von diesen jungen Patienten 4,8,9 weiter erhöht.
In einem Versuch, eine funktionelle Herzklappenersatz mit Wachstumspotenzial, Shinoka et al. Ausgesät autologen Zellen auf einem biologisch abbaubaren, synthetischen Herzklappen 8 zu entwickeln. Das synthetische Ventil zu einer nativen Herzklappe artige Struktur mit Wachstums Potentiometer umgewandeltal. Vorläufige Großtierstudien gezeigt, die Machbarkeit der Verwendung dieser Methode, um eine funktionelle Herzklappe 10 zu schaffen. Jedoch zeigte langfristig Implantationsstudien schlechte Haltbarkeit aufgrund der progressiven Verdickung der Ventil neotissue resultierende Verengung der Herzklappe. Arbeiten von Sodian et al. Nutzten die Shinoka Methodik, aber letztlich ersetzt die PGA-Matrix mit einem biologisch abbaubaren Elastomer, das die biomechanischen Eigenschaften des Gewebes entwickelt Ventil gab konstruieren eine physiologische Profil 9,11,12. Bei der in-vivo-Untersuchung trotz der Erfolg der Implantation eine konfluente Endothelzellen-Auskleidung wurde nicht gebildet, der den langfristigen Erfolg dieses Gerüst 12 zu begrenzen könnte.
Um rationell zu gestalten, eine verbesserte zweite Generation synthetischer Herzklappe wurde ein Mausmodell der Herzklappentransplantation geschaffen, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen Sekundärmarkg neotissue Bildung, Ventil Verdickung und Stenose Entwicklung. Murine Modelle bieten eine breite Palette von molekularen Reagenzien, einschließlich Transgenen, die nicht in anderen Spezies 7 leicht verfügbar sind. In diesem Herzklappe Transplantationsmodell wurde ein ex vivo syngenen Lungenherzklappenersatz zuerst durchgeführt; und dann das Herz mit der implantierten Herzklappe wurde heterotop in einem syngenen Wirt mit einem mikrochirurgischen Technik implantiert. Dieses Modell ermöglicht Herzklappenersatz ohne kardiopulmonalen Bypass.
In diesem Papier, eine ausführliche Erläuterung einer Herzklappe Ernte Spenderherz Präparate, Herzklappentransplantation und heterotope Herztransplantation beschrieben. Die Ergebnisse zeigten eine kontinuierliche Herzschlag aus dem Spenderherzens, die unabhängig von der Empfängerherzschlag war. Der Blutfluss durch die Pulmonalklappe implantiert wurde mit Hilfe eines Hochfrequenz-Ultraschallsystem mit einem gepulsten Wellen Haben gemessenppler.
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Protokoll
Hinweis: Alle Tierversuche wurden von der Nationwide Kinderkrankenhaus Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.
1. Pulmonale Herzklappen Ernte von einer Herzklappe Donor-Maus
- Autoklav alle chirurgischen Werkzeugen vor der Operation: 1x feinen Schere, 3x Mikropinzette, 2x Mikrogefäßklemmen, 1x Klemmanlegezange, 1x Mikro-Nadelhalter, 1x Feder Schere, 1x Aufroller.
- Ein 6-8 Wochen alte weibliche C57BL / 6 Maus wird als Lungenspenderherzklappe eingesetzt. Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und gewogen, dann mit einer Ketamin / Xylazin-Cocktail (Ketamin, 200 mg / kg Xylazin und 20 mg / kg, IP) Überdosis einschläfern.
- Clip den Brustkorb und die Maus in einer dorsalen recumbence Position auf einer Unterlage. Dann machen die Thorakotomie. Expose das Herz, machen einen kleinen Schnitt auf der rechten Atrium und versorgen die linke Herzkammer mit eiskalter Kochsalzlösung.
- Unverblümt sezieren die Lungenarterie (PA) von der aufsteige einorta. Schneiden Sie die Pulmonalklappe (PV) zusammen mit 2 mm Manschette der Lungenarterie. Entsorgen der Rest des Herzens.
- Bewahren Sie die PV in kaltem Heparin und Kochsalzlösung (100 Einheiten / ml). Hinweis: Der PV in der Lösung für zwei Stunden vor der Transplantation an die Spenderherz gehalten werden.
2. Donor Heart Vorbereitung
- Ein 6-8 Wochen alte weibliche C57BL / 6 Maus ist wie ein Herz-Donor verwendet. Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und gewogen, dann mit einer Ketamin / Xylazin-Cocktail (Ketamin 200 mg / kg Xylazin und 20 mg / kg, IP) Überdosis einschläfern. Dies ist ein Anschluss Verfahren.
- Clip den Brustkorb und die Maus in einer dorsalen recumbence Position auf einer Unterlage. Dann machen die Thorakotomie. Unverblümt trennen das Herz, die untere Hohlvene (IVC), der oberen Hohlvene (SVC), aufsteigenden Aorta, PA, und Lungenvenen. Versorgen die IVC mit eiskaltem sterilen Kochsalzlösung.
- Ligieren des IVC, SVC, und Lungenvenen mit 6-0 Seidenfaden dann überlegen die geschnittenLigaturen.
- Schneiden Sie die Aorta und PA mit 2 mm Manschette.
- Schneiden Sie die PV und entsorgen Sie es.
3. Herzklappentransplantation auf ein Spenderherz
- Unmittelbar nach dem Schritt 2,5, legen Sie die Herzklappe von Schritt 1.5 in das Spenderherz und richten Sie die Herzklappe.
- Sichern Sie die PV mit einer Masche auf der rechten Seite des Ventils mit 10-0 Monofilamentnahtmaterialien auf verjüngten Nadeln und beginnen, kontinuierlich mit 5-6 Stichen von der anderen Seite der PV-Naht.
- Nach Abschluss der Frontseite, drehen Sie das Herz horizontal und beginnen, die Rückseite des PV auf den Spenderherz zu nähen.
- Bewahren Sie das Herz in einer kalten sterilen Heparin / Kochsalzlösung. Hinweis: Das Spenderherz in der Lösung für zwei Stunden vor der Implantation auf die Empfängermaus gehalten werden.
4. Heterotope Herztransplantation auf eine Empfängermaus
- Ein 6-8 Wochen alte weibliche C57BL / 6 Maus wurde als reci verwendetpient. Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und gewogen, dann mit Ketamin / Xylazin-Cocktail (Ketamin 100 mg / kg Xylazin und 10 mg / kg) anästhesiert. Ketoprofen (5 mg / kg) als preanesthesia Analgetikum.
- Nach Überprüfung der Ebene der Sedierung durch Schwanz kneifen, klemmen Sie den Bauch-und Brusthaar. Schmieren Sie die Augen mit einer sterilen Augensalbe, und legen Sie die Maus in einem dorsalen recumbence Position auf einer Unterlage. Desinfizieren Sie den Bauch mit Betadine und Alkohol-Pads. Dann decken Sie die Maus mit einem sterilen Tuch und setzen nur die Schnittbereich.
- Machen Sie eine Mittellinie Laparotomieschnitts von unterhalb des Schwertfortsatz an der suprapubischen Region, und legen Sie eine Selbsthalte Aufroller. Wickeln Sie den Darm in Kochsalzlösung befeuchtet Gaze. Unverblümt definieren die infrarenale Aorta und Vena Cava.
- Legen Sie zwei 6-0 Seidenfäden proximal und distal um die Aorta und IVC um die Blutzirkulation zu beschränken.
- Legen Sie das Spenderherz auf der rechten Seite der Bauchaorta und bedecken Sie es mit sterilem gauze. Befeuchten Sie es mit Kochsalzlösung.
- Abgeben Aortotomie in der abdominalen Aorta unter Verwendung einer 30 G-Nadel und sich die Öffnung mit einer Schere auf die Größe der Spender Aorta.
- Führen Sie eine Ende-zu Anastomose mit sterilen 10-0 Monofilamentnahtmaterialien auf verjüngten Nadeln. Sicherung des Spenders Aorta mit einer Masche auf dem proximalen Ende der Öffnung in der Bauchaorta und beginnen, kontinuierlich mit 4-5 Maschen von dem distalen Ende der Bauchaorta zu vernähen.
- Flip das Herz auf die linke Seite, bedecken Sie es mit Kochsalzlösung infundiert Gaze, und beginnen, kontinuierlich mit 4-5 Stichen aus dem distalen Ende der Bauchaorta zu nähen.
- Einen Venenschnitt in der IVC unter Verwendung einer 30 G-Nadel und sich die Öffnung mit der Größe des Spenders Lungenarterie.
- Führen Sie ein Ende Anastomose mit sterilen 10-0 Monofilamentnahtmaterialien auf verjüngten Nadeln. Sichern Sie den Spender PA mit einem Stich am proximalen Ende der Öffnung in der IVC und beginnen, kontinuierlich mit 4-5 Stichen nähen ausdas distale Ende der unteren Hohlvene. Diese Zeit, da die Aorta in der Weise sicher, dass die Vernähung der linken Wand des Spenders PA ist auf der Innenseite der IVC.
- Spülen Sie die IVC-Lumen mit Heparin und Kochsalzlösung (100 Einheiten / ml). Die rechte Wand des Spenders und des Empfängers PA IVC durch kontinuierliches Nähen sie zu dem distalen Ende.
- Entfernen Sie den distalen Blattschraube und die Blutung steuern, indem eine topische sterile resorbierbare Gefäßklemme Mittel. Wenn die Blutung vollständig stoppt, entfernen Sie das proximale Naht und die Kontrolle der Blutung die gleiche Weise.
- Zurück in den Darm und schließen Sie die Bauchmuskulatur und die Haut in zwei Schichten mit einem 6-0 schwarzem Polyamid Monofilament Naht.
- Spritzen Sie 0,5 ml Kochsalzlösung subkutan und legen Sie die Maus in einem Käfig auf einer Recovery-Erwärmung bis die Maus-Pad ist voll mobil. Nach Wiederaufnahme, kehren Sie die Maus auf einen neuen Käfig mit Papier Betten. Geben Sie Schmerzmittel (Ibuprofen, 30 mg / kg, Trinkwasser) für 48 Stunden. Tunein Tier, dass eine Operation für das Unternehmen von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück.
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Ergebnisse
Figur 1 zeigt den Schaltplan der Herzklappe Transplantationsmodell mit heterotopen Herztransplantation. Die Herzklappe wurde aus einem Spenderherz geerntet und auf ein Herz von einer zweiten Spendermaus implantiert. Dann wurde das Herz mit der neuen Herzklappe auf den Bauch eines Empfängermaus implantiert. Fig. 2 zeigt eine Darstellung des implantierten Herzens auf dem Bauchraum (A), direkt nach der Herztransplantation (B) und 5 min nach der Transplanta...
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Diskussion
Die Mortalitätsrate dieses Verfahrens ist, fast 20%, was vor allem durch Blutungen an der PV-Transplantation Website und Anastomose an der Aorta Spender zum Empfänger Bauchschlagader verursacht wurde. In den meisten Fällen nimmt die Sterblichkeit signifikant von 48 Stunden nach der Operation. Die Überlebens Mäuse zeigten starke Herzschlag und den Blutfluss durch die PV implantiert. Der gesamte Prozess dauert vier Stunden für einen erfahrenen Mikrochirurgen. Es wird rund 250 Mäuse, um die Technik zu beherrschen. Die hete...
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Offenlegungen
Wir haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt, zum Teil durch einen Zuschuss aus dem NIH (RO1 HL098228), um CKB.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Mikroskop | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Weiblich | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 Wochen |
| Ketaminhydrochlorid Injektion | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Xylazin Sterile Lösung | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Tiergesundheit | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofen | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparin-Natrium-Sagent | Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Kochsalzlösung (steril 0,9% Natriumchlorid) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0,9 % Natriumchlorid-Injektion | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Vaseline Augensalbe | Dechra Veterinärprodukte | NDC 17033-211-38 | |
| Jod-Vorbereitungspads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alkohol-Vorbereitungspads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Applikatoren mit Wattespitze | Fisher Sientific | 23-400-118 | |
| Feine Schere | FST | 14028-10 | |
| Micro-Adson Pinzette | FST | 11018-12 | |
| Klemmzange | FST | 00072-14 | |
| S & T Gefäßklemme | FST | 00396-01 | |
| Federschere | FST | 15008-08 | |
| Colibri Retraktoren | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 Pinzette | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 - Feine Pinzette | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 Pinzette | FST | 11251-35 | |
| Tish Nadelhalter/ Pinzette | Micrins | MI1540 | |
| Schwarzes Polyamid-Monofilament-Nahtmaterial, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | Zum Nähen des Transplantats |
| Schwarzes Polyamid-Monofilament-Nahtmaterial, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | Für den Verschluss von Muskulatur und Haut |
| Vliesschwämme | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Resorbierbares Hämostatikum | Ethicon | 1961 | |
| 1 ml Spritze | BD | 309659 | |
| 3 ml Spritze | BD | 309657 | |
| 10 ml Spritze | BD | 309604 | |
| 18 G 1 1/2 Zoll, Nadel | BD | 305190 | |
| 25 G 1 Zoll, Nadel | BD | 305125 | |
| 30 G 1 Zoll, Nadel | BD | 305106 | |
| Warmwasser-Umwälzpumpe | Gaymar | TP-700 | |
| Wärmekissen | Gaymar | TP-22G | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| VEVO2100 Hochfrequenz-Ultraschall | VisualSonics | http://www.visualsonics.com/vevo2100 | Die Katalognummer und die Preise können bei den Außendienstmitarbeitern erfragt werden. |
| Ultraschall-Transmissionsgel | Parker Laboratories, INC. | 01-02 | |
| Tisch-Anästhesiesystem für Labortiere | VetEquip, INC. | ||
| Isofluran | Baxter | 1001936060 |
Referenzen
- Polito, A., et al. Increased morbidity and mortality in very preterm VLBW infants with congenital heart disease. Intens Care Med. 39, 1104-1112 (2013).
- Wren, C., Reinhardt, Z., Khawaja, K. Twenty year trends in diagnosis of life threatening neonatal cardiovascular malformations. Arch Dis Child Fetal. 93, F33-F35 (2008).
- Vacanti, J. P. Beyond transplantation Third annual Samuel Jason Mixter lecture. Archives of surgery. 123, Chicago Ill. 545-549 (1960).
- Tudorache, I., et al. Orthotopic replacement of aortic heart valves with tissue-engineered grafts. Tissue engineering Part A. 19, 1686-1694 (2013).
- van Geldorp, M. W., et al. Patient outcome after aortic valve replacement with a mechanical or biological prosthesis weighing lifetime anticoagulant related event risk against reoperation risk. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 137, 881-886 (2009).
- El Oakley, R., Kleine, P., Bach, D. S. Choice of prosthetic heart valve in today's practice. Circulation. 117, 253-256 (2008).
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- Shinoka, T., et al. Tissue engineering heart valves valve leaflet replacement study in a lamb model. The Annals of thoracic surgery. 60, S513-S516 (1995).
- Sodian, R., et al. Tissue engineering of heart valves in vitro experiences. The Annals of thoracic surgery. 70, 140-144 (2000).
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- Sodian, R., et al. Evaluation of biodegradable three dimensional matrices for tissue engineering of heart valves. ASAIO journal (American Society for Artificial Internal Organs. 46, 107-110 (1992).
- Sodian, R., et al. Early in vivo experience with tissue-engineered trileaflet heart valves). Circulation. 102, III22-III29 (2000).
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Nachdrucke und Genehmigungen
