Summary
バレット食道の分子ドライバーを改良し、情報のための識別可能な必要性がある。免疫蛍光染色は、細胞形態学上の細胞シグナル伝達の効果を理解するために有用な技術である。私たちは、バレット食道細胞において治療上の処置を評価するための免疫蛍光染色を使用するためのシンプルで効果的なプロトコルを提示する。
Abstract
食道腺癌（EAC）は、全生存期間の17％未満の割合とEACの発生率は過去20年間に劇的に上昇しているがあります。 EACの主要な危険因子の一つは、バレット食道（BE）、慢性の胸焼けに応答して正常食道扁平上皮化生の変化である。 EACとBE、EAC者になるの進行に関与する分子事象、特に変更されたシグナル伝達経路の尋問の間に十分に確立された接続にもかかわらず、ほとんどわかっていない。これの多くは、これらの疾患を研究するために利用できるin vitroモデルにおいて適切性の欠如に起因している。最近では、不死化細胞株BEは、BEのインビトロ研究を可能にする商業的に利用可能になっている。ここでは、治療用化合物への曝露後の細胞シグナル伝達および構造体のインビトロ特徴付けを可能に 、BE不死化細胞株の免疫蛍光染色のための方法を提示する。これらの技術の適用は、HELうpはEACの進行者になるに関与するメカニズムへの洞察を開発し、EACの治療および予防のための潜在的な道を提供する。
Introduction
バレット食道（BE）は、食道の正常扁平上皮および胃食道逆流症（GERD）1から生じる胃内容への慢性暴露の結果での化生変化です。 BEは、GERDへの反応に対する防御機構であると考えられているがBEの存在は、食道腺癌（EAC）、有意に低い生存率1を搬送する疾患のリスクの増加を与える。現在の推定は、米国人口の5.6％がBEていることを示唆しているBEは、しばしば無症候性であるように、しかしながら、それはBEの大部分は2診断未確定のままであると考えられる。逆流性食道炎とEACの両方の発生率は、継続的な成長3を見てきたように、この情報が潜在的にEACにBEの進行を防止に向けた治療的アプローチを提供することが特に、EACにBEの進行に関与する分子メカニズムを理解することが重要になってきている。
1の現在のパラダイムをもたらした。慢性炎症、外傷、および胃内容物への長期暴露に起因する遺伝毒性損傷はEACに腫瘍の進行を促進BE病変に対する選択圧を及ぼす。遺伝子変異の数は、EAC進行することで中に同定されている。しかし、これにもかかわらず、細胞のシグナル伝達における正確な変化および細胞構造および機能に対するその後の影響についての明確な理解の欠如がある。
インビトロ細胞株において不死化に特に標的化治療化合物の効果を調査において、細胞シグナル伝達の効果を研究するための有用なツールである。 BE不死細胞株の最近の商業的利用可能性は、そのような研究を可能にする。そのような広く使用されている生存率アッセイなどのハイスループットアッセイは、細胞増殖およびsuの際に標的療法の効果を評価する上で貴重であることができるが4-6 rvival、これらのアッセイは、細胞の形態に依存細胞シグナル伝達の効果を問い合わせるために有用ではない。免疫蛍光染色（IF）は、細胞の形態、増殖、および生存特性および関与するタンパク質の際に標的療法の効果を調査するための有用な技術である。当研究室では、薬物治療7の可能な化学予防治療とバイオマーカーの輪郭を描くことを望んでも細胞株の際に臨床的に利用可能な薬剤の効果を評価するためにIFを用いて、不死化細胞株に向けて、これらの方法を適応している。同様に、EACでのこれらの技術の適用は、BEと食道不死化細胞株は、EAC進行8-10にBEに関する重要な知見を描写している。標的療法で処置したBE細胞の分析は、細胞構造およびタンパク質局在化の変化の特徴付けを可能にする、値を有するIF我々は見つける。ここでは、Cに不死化細胞のIFのための私達の方法を提示薬物治療をharacterize。
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Protocol
1。細胞株のメンテナンス
- 不死化ヒト転写酵素（TERT）タンパク質11ヒトテロメラーゼ逆の安定なトランスフェクションにより、高グレード異形成（CP-B、CP-C、CP-D）および化生（CP-A）細胞株BE。
- ウシ下垂体抽出物（BPE）、上皮成長因子（EGF）、5％ウシ胎児血清（FBS）、非必須アミノ酸（NEAA）、ペニシリン - ストレプトマイシン、ネオマイシン（PSN）、標準を補充したケラチノサイト培地中BE細胞株を維持する組織培養条件（37℃、5％CO 2、98％湿度）。
2。細胞播種BE
- 12ウェルプレート/カバースリップの調製。ガラスシャーレやオートクレーブに18ミリメートルのカバースリップを配置。転写は、真空管に取り付けられた滅菌ガラスピペットを用いて12ウェル組織培養皿にの18mmカバーガラスオートクレーブ。滅菌PBSやメディアでカバーグラスを洗う。
- トリプシン処理し、不死化細胞を数える。細胞USIを数える自動細胞カウンターまたは血球計数器をngの。 20,000〜40,000細胞/ mlの濃度に培養培地中の細胞を希釈する。
- 各ウェル20,000〜40,000個/ウェルの総細胞数のためのカバーガラスを含むへの細胞の1ミリリットルを配置します。
- 優しく細胞がカバーグラスに付着することを保証するために井戸の底にカバースリップをプッシュする滅菌ピペットチップを使用してください。
BE細胞の3。薬物療法
- 所望の濃度に暖かい（37℃）培地で選択された薬物を希釈し、繰り返し転倒やボルテックスミキサーを使用してよく混ぜる。経験的に決定された薬物濃度。カバーガラスの上の細胞の付着を可能にすることで、細胞の初期播種治療後24時間を開始
- 比較対照のために、培養培地中に希釈し、0.1％の車両（ジメチルスルホキシド[DMSO]または薬剤は、化合物を可溶化するために使用される）と一緒に細胞の追加のカバーガラスを扱う。薬剤を同定し、VEのための研究室のペンでラベルプレートhicle、サンプルを処理した。 37℃、5％CO 2、湿度98％に設定し、細胞培養インキュベーター中に細胞を置き、所望の時点インキュベートする。
4。免疫蛍光染色
- 固定
- 薬物治療の所望のインキュベーション時間後、培地を吸引し、室温（RT、25℃）で1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で迅速にカバースリップを洗浄する。
- PBSを吸引し、各ウェルに4％PFA [4％PFA / PBS]を含む1mlのPBSを添加し、室温で30分間インキュベートする。
- 4％PFA / PBSを吸引し、室温でPBSでカバーグラス3倍、5分間ずつ洗浄します。必要に応じて、4℃でのPBS/0.1％PFA中1週のための店のカバースリップ。
- 透過化/ブロッキング
抗体が細胞内標的にアクセスできるように固定されたPFAの細胞を透過。細胞外タンパク質を表面化するために、1×PBS/0.5％のBSA溶液に追加サポニンずに 、後続のすべての手順を実行します。- 室温で10分間PBSで希釈した50のNH 4 Clでインキュベートすることにより、バックグラウンドを減少し、5分間に一度、RT PBSで洗う。
- 0.1％サポニンおよび0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBSの100〜300μlの30分間、細胞をインキュベートBE。水で調製し、4℃で保存し、濾過滅菌し、10％の在庫からサポニンを希釈
- 人間の商工会議所の作製
- 湿ったペーパータオルでチャンバーの底を積層して正方形のバイオアッセイディッシュを用意し、その上にパラフィルムの層を配置します。
- 穏やか鉗子、シリンジ針を使用してパラフィルムカバースリップ上に、上向きに細胞を移す。
- カバースリップを識別するためのラボのペンでパラフィルムをマーク。
- 一次抗体インキュベーション
- 0.5％BSAおよび0.1％サポニンの両方を含有するPBS中で一次抗体を希釈する。
- 優しく実験室の組織を使用してブロッキング溶液をオフにブロットおよび一次抗体溶液100μlを加える。 4℃で一晩BE細胞に一次抗体をインキュベート
- 二次抗体インキュベーション
- スライドは室温で5分間ごとに、PBS/0.5％のBSA/0.1％のサポニンで3回洗浄します。
- 二次抗体が一次抗体が発生された種を認識することをPBS/0.5％のBSA/0.1％のサポニン中の蛍光タグで結合させた二次抗体を希釈します。
- 各カバーグラスに希釈した抗体を100μlを加える。室温で2時間、二次抗体をインキュベートする。
- 洗濯やカバーガラスの取り付け
- PBS/0.5％のBSA/0.1％のサポニンでカバースリップ3X、5分間ずつ洗浄します。洗浄緩衝液を除去し、カバーグラスをPBS 100〜300μlを加える。
注：二重反の場合体染色は、繰り返しての議論に概説された情報に応じて必要な追加の一次および二次抗体を用いて4.4から4.5を繰り返します。 - ピンセットを使用して、穏やかにカバーグラスを持ち上げ、実験組織またはペーパータオルを使用してPBSをオフブロット。
- ガラス顕微鏡スライド上に、細胞ダウン、カバーグラスに4を含む適切な退色防止封入剤 '、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）の15μLを加え、カバースリップを反転。
- スライドフォルダにスライドを置き、ハードセット退色防止媒体が硬化させるために室温で一晩直射光からインキュベート、メーカーの指示に従って。抗退色媒体がセットされた後、スライドを顕微鏡的視覚化するまで4℃又は-20℃のいずれかで保存することができる。
- PBS/0.5％のBSA/0.1％のサポニンでカバースリップ3X、5分間ずつ洗浄します。洗浄緩衝液を除去し、カバーグラスをPBS 100〜300μlを加える。
カバーガラスの5。顕微鏡可視化
染色された細胞を、共焦点顕微鏡またはIFが可能なアップライトmicroscopのいずれかを介して画像化することができるE。共焦点顕微鏡は、離散深度で高解像度の画像を提供するが、直立顕微鏡が速く有用な画像を生成することができる。簡潔にするために、イメージングの方法は、標準的な顕微鏡を提示されている使用して細胞であっても染色した。一般的には、画像をフルオレセインイソチオシアネート（FITC）または類似のフルオロフォア（ すなわち緑色蛍光タンパク質）に、テキサスレッドおよびDAPIは、これらのフルオロフォアを識別することのできるフィルタを備えた顕微鏡を必要とします。互換性の蛍光プローブを決定するためにプロトコルを開始する前に、顕微鏡をチェックしてください。
- 標準IF顕微鏡イメージング
- -20℃または4℃から保存されたスライド/カバースリップを削除し、それらを室温に加温することができます。顕微鏡と水銀アークランプの電源をオンにします。
- カバーガラスは、顕微鏡ステージ上に目的の方に向けた状態で顕微鏡スライドを配置します。油浸対物レンズを使用するために、カバーガラス上にイマージョンオイルの滴を追加します。
- DAPIフィルターを選択し、シャッターを開いてください。 画像が表示されるまで、接眼レンズを通して見ながら目的の焦点を合わせる。すべての細胞はDAPIで染色されるので、核は容易に観察する必要があります。
- 各画像処理ソフトウェアを用いて画像を収集する。
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Representative Results
記載された手順の適用から得られた結果の例を、 図1A〜Dに示されている。 CP-DおよびCP-Cを用いたカバーガラスの細胞は24 Srcファミリー阻害剤の1μM、SKI-606との時間、またはビヒクル（DMSO）処理し、ヘレン·ジャンクションおよびWntシグナル伝達タンパク質、βについて上記の手順を用いて染色したBE -カテニン。細胞核の標識はDAPI（青色）で標識することによって達成しながら、β-カテニンの可視化は、緑色蛍光団に結合した抗ウサギIgGで標識することによって達成された。カバースリップは、ハード実装設定され、細胞は63X/1.4Nプランアポクロマート対物レンズを用いてレーザ走査共焦点顕微鏡を用いて画像化した使用して顕微鏡スライドに取り付けられた。選択された緑色のフルオロフォアは、488nmで励起され、505〜nmの発光フィルターを用いて可視化した。同様に、DAPIは、405 nmおよび410から460 nmのフィルターを使用して収集された放射で励起した。チロシンキナーゼのSrc、iの活性Sは、特に高度異形成12であることで増加した。細胞質/核から大腸と前立腺癌細胞での観察13〜15、β-カテニンの再局在におけるSrcの阻害と一致内（細胞膜に矢印を（矢印1A、1C、および1Eを図）、（b）は、図1Dおよび1F）。これらの技術を用いて、その他は先に、Srcの阻害は、腫瘍抑制因子の発現および局在を変化させることが示されたp27 kip1の7,16及びこれらの方法は、現在、我々の研究所内で使用されてきた。
μ
図1。Srcキナーゼの阻害剤で処理した後の不死化することが、細胞の場合は、CP-C（AD）およびCP-D（E、F、）、24時間（右パネル）のために、ビヒクル（DMSO、左パネル）またはSrcの阻害剤の1μM、SKI-606で処理した。細胞を、記載されたプロトコルに従って固定し、染色したBE。核はDAPI（青色）で染色しながら、β-カテニン（緑）は、特異的抗体およびAlexa Fluro 488に結合された二次抗体を用いて可視化した。 AとBの中の白い箱のSKI-606、C、D）に拡大された画像を処理した後の細胞膜（矢印）を核（矢印）からのβ-カテニンのローカリゼーションの変化に注意し、さらにβ-の変化を強調カテニンの局在。これらの画像は、選択されたターゲットのための最小限の背景と明確な染色での理想的な染色を表しています。バー、7ミクロン（A、B、D、F）、0.5ミクロン（C、D）。
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Discussion
我々は、これらの細胞に対する標的療法の生理学的効果の解明に向けたBE細胞のIFを適用するための方法を説明してきました。我々はBE細胞に対してこれらの手順の使用を記載してきたが、我々は、これらの方法はまた、異なる細胞型13,17,18様々に適用可能であることを見出した。また、これらの手順は、特定のターゲットのための染色を最適化するいくつかの方法で変更することができる。
我々は適切なIFの際に直接的な影響を与えつのパラメータが固定の選択である見つける。我々は、上記の手順で固定のために4％PFA / PBSの使用を記載しているが、別の固定剤も適用可能である。冷メタノールで固定は（-20°C）で20分間のPBSで洗浄した後、特定のタンパク質/抗体13に適している。固定用の冷メタノールを使用することは細胞を透過する必要性を否定します。しかし、固定剤の選択（4％PFA / PBSまたは冷メタノール）が経験的に決定されなければならない。 上記で概説した手順は、単一のタンパク質の可視化を記述する。しかしながら、この方法は、追加のターゲット13の同定に容易に適応可能である。最適のための2つのタンパク質の、特に異なる蛍光体に結合されたそれぞれの種を認識する2つの異なる種（例えば、ウサギで育っ1とマウスでの1）であり、二次抗体で育った一次抗体は、必要な場合。 DAPIと組み合わされ、緑色及び赤色蛍光団に結合された二次抗体は、一般に、複数のフルオロフォアからの干渉を回避することに加えて、ターゲットとの間の優れたコントラストを提供する。 BE細胞中のIFの2のターゲットでは、固定後2次およびそれぞれの二次抗体の逐次インキュベーションを行う。スライドの洗浄およびマウントするためのステップは同じです。
要約すると、我々は、BE細胞のIFのための簡単で便利なプロトコルを提供する。これらの手続きの適用はのinformatを得ることができる薬物治療、関心の異所性遺伝子の導入、またはBE細胞における目的の遺伝子のRNAiのダウンレギュレーションの影響についてイオン。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、セントジョセフの財団（AJF、LJI）と米国肺協会、RG-224607-N（LJI）からの補助金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CP-A (Metaplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200056 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN antibiotic mixture | Life Technologies | 15640 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Circular Glass Coverslip 18 mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-catenin Primary Antibody (Rabbit) | Cell Signaling | 9562S | |
| Alexa Fluor 488 (Goat Anti-Rabbit) | Life Technologies | A11008 | |
| 10 cm TC treated PS dish, sterile | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12-well TC treated PS plate, sterile | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Square Bioassay Dish | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Disposable Pasteur Pipettes, Flint Glass | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini Cell Counter | Nexcelom | ||
| Cellometer Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome microscope | Zeiss |
References
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