Summary
Det er en merkbar behov for bedre informasjon om molekylære førere av Barretts øsofagus. Immunofluorescerende farging er en nyttig teknikk for å forstå virkningene av cellesignalisering på cellemorfologi. Vi presenterer en enkel, effektiv protokoll for bruk av immunofluorescent flekker å vurdere terapeutisk behandling i Barretts øsofagus celler.
Abstract
Esophageal adenokarsinom (EAC) har en total overlevelse rate på mindre enn 17% og forekomsten av EAC har steget dramatisk de siste to tiårene. En av de viktigste risikofaktorer for EAC er Barretts øsofagus (BE), en metaplastic forandring av den normale squamous spiserøret i respons til kronisk halsbrann. Til tross for godt etablert sammenheng mellom EAC og BE, avhør av de molekylære hendelser, særlig endrede signalbaner som involverer progresjon av BE til EAC, er dårlig forstått. Mye av dette er på grunn av mangel på egnede in vitro-modeller som er tilgjengelige for å studere disse sykdommene. Nylig har udødelig BE cellelinjer blitt kommersielt tilgjengelig som åpner for in vitro studier av BE. Her presenterer vi en fremgangsmåte for immuno-fluorescensfarging av udødelig BE cellelinjer, slik at in vitro karakterisering av cellesignalisering og strukturen etter eksponering overfor terapeutiske forbindelser. Anvendelse av disse teknikkene vil help utvikle innsikt i de mekanismene som er involvert i BE til EAC progresjon og gi potensielle veier for behandling og forebygging av EAC.
Introduction
Barretts øsofagus (BE) er et metaplastic forandring i den normale plate-epitel i spiserøret og et resultat av kronisk eksponering for mageinnhold som følge av gastroøsofageal reflukssykdom (GERD) 1. BE er antatt å være en beskyttende mekanisme i respons til GERD, men tilstedeværelsen av BE bibringer en økt risiko for øsofageal adenocarcinoma (EAC), en sykdom som medfører en betydelig dårlig overlevelse 1.. Nåværende anslag tyder på at opptil 5,6% av den amerikanske befolkningen har BE, men som BE er ofte asymptomatiske, er det tenkt at flertallet av BE forblir udiagnostisert to. Som forekomst av både GERD og EAC har sett fortsatt vekst 3, har det blitt viktig å forstå de molekylære mekanismene som er involvert i utviklingen av BE til EAC, spesielt siden denne informasjonen kan potensielt gi terapeutiske tilnærminger til å forebygge utviklingen av BE til EAC.
en. Kronisk betennelse, skader, og gentoksisk skade som følge av langvarig eksponering for mageinnhold øve seleksjonspress på BE lesjon fremme neoplastisk progresjon til EAC. Det er identifisert en rekke genetiske forandringer i løpet av BE til EAC progresjon. Men til tross for dette er det en tydelig mangel på forståelse om de eksakte endringer i celle signalisering og påfølgende effekter på cellestruktur og funksjon.
Udødeliggjort i vitro cellelinjer er nyttige verktøy for å studere effekten av cellesignalering, særlig i å undersøke effekten av målrettede terapeutiske forbindelser. Den nylige kommersielle tilgjengeligheten av udødelig BE cellelinjer åpner for slike studier. Selv high-throughput-analyser, slik som de brukte levedyktighet assays, kan være verdifulle for å vurdere effektene av målrettede terapier ved celleproliferasjon og survival 4-6, disse analysene er ikke nyttig for avhør effekten av cellesignalisering ved cellemorfologi. Immunofluorescerende farging (IF) er en nyttig teknikk for å undersøke effekten av målrettede terapier ved morfologiske, vekst og overlevelses karakteristika av celler og proteiner som er involvert. Vårt laboratorium har tilpasset disse metodene mot udødelig BE cellelinjer, ved hjelp av IF å evaluere effekten av en klinisk tilgjengelig stoff på BE cellelinjer i håp om å skildre en mulig chemopreventative behandling og biomarkør for rusbehandling 7. Tilsvarende anvendelse av disse teknikkene i EAC, BE og udødelig esophageal cellelinjer har avgrenset kritiske funn vedrørende BE til EAC progresjon 8-10. Vi finner IF analyse av BE celler behandlet med målrettet terapi har verdi, noe som åpner for karakterisering av endringer i cellestrukturen og protein lokalisering. Her presenterer vi våre metoder for IF av udødelig BE celler til characterize medikamentell behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Cell linjevedlikehold
- Udødelig Menneskelig BE høyverdig dysplastiske (CP-B, CP-C, CP-D) og metaplastic (CP-A) cellelinjer ved stabil transfeksjon av den menneskelige telomerase reverse transkriptase (tert) protein 11.
- Oppretthold BE cellelinjer i keratinocytt-media supplert med bovint hypofyseekstrakt (BPE), epidermal vekstfaktor (EGF), 5% føtalt bovint serum (FBS), ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), penicillin-streptomycin-neomycin (PSN) og standard vevskultur betingelser (37 ° C, 5% CO2, 98% luftfuktighet).
2. BE Cell Plating
- Utarbeidelse av 12-brønns plate / Dekk. Plasser 18 mm Dekk i et glass petriskål og autoklav. Overføring autoklaveres 18 mm glassdekkglass i en 12-brønners vevskultur tallerken ved hjelp av en steril pipette glass festet til et vakuumrør. Vask dekkglass med steril PBS og media.
- Trypsinize og telle udødelig være celler. Telle celler Using en automatisk celleteller, eller et hemocytometer. Fortynn cellene i vekstmedium til en konsentrasjon på 20.000-40.000 celler / ml.
- Plasser 1 ml av cellene i hver brønn inneholdende et dekkglass for en totalt celletall på 20.000-40.000 celler / brønn.
- Bruk av en steril pipette til forsiktig å presse dekkglass til bunnen av brønnen for å sikre at cellene fester seg til dekkglass.
Tre. Drug Treatment of være celler
- Fortynn valgte medikament i varme (37 ° C) media til ønsket konsentrasjon og bland godt ved å snu røret flere ganger eller ved hjelp av en vortex-blander. Avgjøres medikamentkonsentrasjoner empirisk. Begynne behandling 24 timer etter den første såing av BE-celler for å la cellene feste seg på dekkglass
- For sammenligning og kontroll, behandling av en ytterligere dekkglass av BE-celler med 0,1% kjøretøyet (dimetylsulfoksyd [DMSO] eller middel som brukes for å oppløse forbindelsen) fortynnet i kulturmedier. Etikett plate med en lab penn for å angi legemiddel og vekjøretøyets behandlet prøvene. Plasser-celler i en cellekulturinkubator satt til 37 ° C, 5% CO2, 98% luftfuktighet og inkuber i ønskede tidspunkter.
4. Immunofluorescent Farging
- Fiksering
- Etter ønsket inkubasjonstid på behandling, aspirere mediet og vask Dekkglass raskt med 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) ved romtemperatur (RT, 25 ° C).
- Aspirer PBS og tilsett 1 ml PBS inneholdende 4% PFA [4% PFA / PBS] til hver brønn og inkuber ved romtemperatur i 30 min.
- Aspirer 4% PFA / PBS og vaske dekk 3x, 5 min hver med PBS ved RT. Lagre Dekk for en uke i PBS/0.1% PFA ved 4 ° C hvis det er ønskelig.
- Permeabilization / Blokkering
Permeabilize faste PFA-celler for å tillate antistoffet å få tilgang til de intracellulære mål. For ekstracellulært dukket proteiner, utføre alle etterfølgende trinn uten saponin lagt til 1x PBS/0.5% BSA løsning.- Redusere bakgrunns ved inkubering med 50 mM NH4Cl fortynnet i PBS i 10 min ved RT og vask med RT PBS en gang i 5 min.
- Inkuber BE-celler i 30 minutter på 100 til 300 pl PBS inneholdende 0,1% saponin og 0,5% bovint serumalbumin (BSA). Fortynn saponin fra filter-sterilisert 10% lager, fremstilt i vann og lagret ved 4 ° C.
- Utarbeidelse av Menneskelig Chamber
- Tilbered en firkantet bioassay fatet ved lagdeling i bunnen av kammeret med våte papirhåndklær og plassere et lag Parafilm på toppen.
- Forsiktig overføre Dekk, celler vendt oppover, mot Parafilm med tang og en kanyle.
- Marker Parafilm med en lab penn for å identifisere dekkglass.
- Primary Antibody Inkubasjon
- Fortynn det primære antistoff i PBS som inneholder både 0,5% BSA og 0,1% saponin.
- Forsiktig klatt av den blokkerende løsning ved hjelp av en laboratorie-vev og tilsett 100 ul av den primære antistoff-løsning. Inkuber det primære antistoff i BE-celler over natten ved 4 ° C.
- Sekundær Antistoff Inkubasjon
- Vask lysbildene 3x med PBS/0.5% BSA/0.1% saponin for 5 min hver på RT.
- Fortynne sekundært antistoff konjugert med et fluorescerende tag i PBS/0.5% BSA/0.1% saponin at den sekundære antistoff gjenkjenner de artene der det primære antistoffet ble hevet.
- Tilsett 100 pl av fortynnet antistoff til hvert dekkglass. Inkuber sekundært antistoff i 2 timer ved RT.
- Vasking og Montering av Dekk
- Vask Dekk 3x, 5 min hver i PBS/0.5% BSA/0.1% saponin. Ta av vaskebuffer og legge 100-300 mL PBS til Dekkglass.
MERK: For dobbel antiKroppen farging, gjenta trinn 04.04 til 04.05 med ønsket tilleggs primære og sekundære antistoff i henhold til informasjonen som er beskrevet i diskusjonen. - Bruk pinsett, forsiktig løfte opp dekkglass og klatt av PBS ved hjelp av et laboratorium vev eller papirhåndkle.
- Tilsett 15 pl av en egnet anti-fade monterings media inneholdende 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) til dekkglass og invertere dekkglass, celler ned, på en glass-objektglass.
- Plasser lysbildene i en lysbilde mappe og ruge vekk fra direkte lys over natten ved RT å la hard satt anti-fade medium for å kurere, i henhold til produsentens instruksjoner. Når den anti-fade medium har satt seg, kan slides lagres ved enten 4 ° C eller -20 ° C inntil mikroskopisk visualisering.
- Vask Dekk 3x, 5 min hver i PBS/0.5% BSA/0.1% saponin. Ta av vaskebuffer og legge 100-300 mL PBS til Dekkglass.
5. Mikroskopisk Visualisering av Dekk
Fargede celler kan avbildes enten via konfokalmikroskopi eller en IF stand oppreist mikroskope. Selv konfokalmikroskopi gir bilder med høy oppløsning på diskrete dybder, er en oppreist mikroskopisk stand til å produsere nyttige bilder raskere. For korthets, beiset en metode for bildebehandling BE celler ved hjelp av standard mikros presenteres. Generelt, til bildet fluorescein (FITC) eller lignende fluoroforene (dvs. grønt fluorescerende protein), Texas Red og DAPI, krever et mikroskop med filtre som kan diskriminere disse fluorophores. Sjekk mikroskopet før du begynner protokollen for å finne ut kompatible fluorophores.
- Imaging på en Standard IF Microscope
- Fjern lagrede lysbilder / Dekk fra -20 ° C eller 4 ° C og la dem varmes opp til romtemperatur. Strøm på mikroskop og kvikksølv arc lampe.
- Plasser objektglass med dekkglass vendt mot målet på mikroskop scenen. For bruk av et oljeneddyppingsobjektivet, tilsett en dråpe nedsenking olje på dekkglass.
- Velg DAPI filter og åpne lukkeren. Fokus målet mens du ser gjennom okularene til bildet vises. Ettersom alle celler vil farge med DAPI, bør kjernen være lett observerbar.
- Samle bilder ved hjelp av respektive bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på resultatene oppnådd fra anvendelse av de beskrevne fremgangsmåter er illustrert i figurene 1 A-D. Dekkglass med CP-D-og CP-C-BE-celler ble behandlet i 24 timer med 1 uM av Src familien inhibitor, SKI-606, eller bærer (DMSO) og farget ved hjelp av de ovenfor angitte prosedyrer for Adherens Junction og Wnt signale protein, β -catenin. Visualisering av β-catenin ble oppnådd ved merking med et anti-kanin IgG koblet til en grønn fluorofor, mens merking av cellekjernen ble oppnådd ved merking med DAPI (blå). Dekk ble montert på objektglass ved hjelp av hardt satt montering og celler ble fotografert ved hjelp av laserskanning confocal mikroskop bruker en 63X/1.4N plan-Apochromat mål. Den valgte grønn fluoroforen var spent på 488 nm og visualiseres ved hjelp av et utslipp filter på 505-525 nm. Tilsvarende DAPI ble eksitert ved 405 nm og emisjon oppsamlet ved hjelp av et filter på 410 til 460 nm. Aktiviteten av tyrosin-kinase, Src is økt i BE, særlig i høy klasse dysplasi 12. I samsvar med observasjonene i tykk-og prostata cancerceller 13-15, hemming av Src resulterer i relocalization av β-catenin fra cytoplasma / nucleus (piler, figur 1A, 1C og 1E) til cellemembranen (pilspisser, figur 1B, 1D og 1F). Ved hjelp av disse teknikkene, har vi og andre tidligere vist at hemming av Src endrer også uttrykk og lokalisering av tumor suppressor, p27 kip1 7,16 og disse metodene brukes i dag innenfor vårt laboratorium.
μ
Figur 1. IF av udødeliggjorte BE celler etter behandling med en inhibitor av Src-kinase. CP-C (AD) og CP-D (E, F) Ble behandlet med kjøretøyet (DMSO, venstre panel) eller 1 uM av Src-inhibitor, SKI-606, i 24 timer (høyre panel). BE-celler ble fiksert og farget i henhold til den beskrevne protokoll. β-catenin (grønt) ble visualisert ved hjelp av et spesifikt antistoff og et sekundært antistoff koplet til Alexa Fluro 488, mens kjernen var farget med DAPI (blå). Legg merke til endring i lokalisering for β-catenin fra kjernen (piler) til cellemembranen (pilspisser) etter behandling med SKI-606. C, D) Forstørrede bilder av hvite bokser i A og B, videre markere endringene i β- catenin lokalisering. Disse bildene representerer ideelle farging med minimal bakgrunns og distinkte flekker for det valgte målet. Stenger av 7 mikrometer (A, B, D, F), 0,5 mikrometer (C, D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har skissert en metode for påføring av IF av BE celler mot å belyse de fysiologiske virkningene av målrettet terapi ved disse cellene. Mens vi har beskrevet bruken av disse prosedyrer mot BE-celler, har vi funnet at disse metoder kan også anvendes til en rekke forskjellige celletyper 13,17,18. Videre kan disse prosedyrene endres på flere måter å optimalisere farging for konkrete mål.
Vi finner en parameter som har en direkte effekt på riktig IF er valget av fiksering. Vi har beskrevet bruken av 4% PFA / PBS for fiksering i de ovenfor angitte fremgangsmåter, men alternative feste er også anvendelig. Fiksering med kald metanol (-20 ° C) i 20 min, etter vask med PBS er egnet for visse proteiner / 13 antistoffer. Bruk av kald metanol for fiksering opphever behovet for å permeabilize celler. Imidlertid er valget av bindemiddel (4% PFA / PBS eller kald metanol) må bestemmes empirisk. Fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor beskriver visualiseringen av et enkelt protein; Men denne metode er lett å tilpasse til identifisering av en ytterligere mål 13.. For optimal IF av to proteiner, primære antistoffer reist i to forskjellige arter (for eksempel ett oppvokst i kanin og en i mus), og sekundære antistoffer spesifikt gjenkjenner hver art, koblet til forskjellige fluorophores, er nødvendig. Sekundære antistoffer koblet til grønne og røde fluoroforer, kombinert med DAPI gir en utmerket kontrast mellom mål i tillegg til generelt å unngå forstyrrelser fra flere fluoroforer. For IF av to mål i BE celler, utføre sekvensiell inkubasjon av to primære og deres respektive sekundære antistoffer etter fiksering. Fremgangsmåte for vasking og montering av lysbilder forbli den samme.
Oppsummert gir vi en enkel og nyttig protokoll for IF av BE celler. Anvendelse av disse prosedyrene kan gi information om effekten av medikamentell behandling, innføring av ektopiske gener av interesse, eller RNAi nedregulering av gener av interesse i BE celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra St Josephs Foundation (AJF, LJI) og American Lung Association, RG-224607-N (LJI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CP-A (Metaplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200056 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN antibiotic mixture | Life Technologies | 15640 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Circular Glass Coverslip 18 mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-catenin Primary Antibody (Rabbit) | Cell Signaling | 9562S | |
| Alexa Fluor 488 (Goat Anti-Rabbit) | Life Technologies | A11008 | |
| 10 cm TC treated PS dish, sterile | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12-well TC treated PS plate, sterile | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Square Bioassay Dish | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Disposable Pasteur Pipettes, Flint Glass | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini Cell Counter | Nexcelom | ||
| Cellometer Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome microscope | Zeiss |
References
- Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis. Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).
- Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. The prevalence of Barrett's esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data. Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).
- Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. H. Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age. J. Natl. Cancer Inst. 100, 1184-1187 (2008).
- Konturek, P. C., Burnat, G., Hahn, E. G. Inhibition of Barret's adenocarcinoma cell growth by simvastatin: involvement of COX-2 and apoptosis-related proteins. J. Physiol. Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).
- Peng, D., et al. Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells. Gut. 61, 1250-1260 (2012).
- Vona-Davis, L., et al. MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett's adenocarcinoma in vitro. Surg. Res. 127, 53-58 (2005).
- Inge, L. J., et al. a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett's esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia. Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).
- Jovov, B., et al. Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett's cell line (BAR-T). Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).
- Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition. BMC Cancer. 11, 461 (2011).
- Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. In benign Barrett's epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks. Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).
- Palanca-Wessels, M. C. A., et al. Extended lifespan of Barrett's esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model. Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).
- Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).
- Inge, L. J., et al. alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling. Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).
- Coluccia, A. M. L., et al. SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of β-Catenin and Its Nuclear Signaling. Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).
- Nam, J. -S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis. Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).
- Chu, I., et al. p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2. Cell. 128, 281-294 (2007).
- Inge, L. J., et al. Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor. Exp. Res. 317, 838-848 (2011).
- Gan, Y., et al. Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells. Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).
