Dopaminerge Neuronen spielen eine wichtige regulatorische Rolle im Gehirn. Ihr Verlust wird mit der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht. In diesem Video zeigen wir, wie Primärkulturen von zentralen dopaminergen Neuronen aus embryonalem Mausmesencephalon erzeugt werden können. Solche Kulturen sind nützlich, um die extreme Anfälligkeit dieser Neuronen gegenüber verschiedenen Belastungen zu untersuchen.
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Methodenartikel
Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dopaminergen Neuronen weniger als 1% der gesamten Anzahl von Neuronen im Gehirn. Diese geringe Menge an Neuronen regelt wichtige Hirnfunktionen wie Motorsteuerung, Motivation und Arbeitsgedächtnis. Nigrostriatalen dopaminergen Neuronen selektiv degenerieren bei Parkinson-Krankheit (PD). Diese fortschreitende Verlust von Nervenzellen ist eindeutig mit den Motoren Symptome der Pathologie (Bradykinesie, Ruhetremor und Muskelstarre) assoziiert. Die wichtigsten Vertreter der dopaminergen Neuronen verantwortlich Degeneration ist noch unbekannt. Allerdings scheinen diese Neuronen extrem anfällig in unterschiedlichen Bedingungen zu sein. Primärkulturen stellen eine der wichtigsten Modelle Eigenschaften und Merkmale von dopaminergen Neuronen zu untersuchen. Diese Kulturen können auf verschiedene Stressmittel, die PD Pathologie imitieren und zu neuroprotektiven Verbindungen, um zu stoppen oder zu verlangsamen neuronale Degeneration vorgelegt werden. Die zahlreichen transgenen Mausmodellen der PD, die Gener habenergaben sich im letzten Jahrzehnt weiter erhöht das Interesse der Forscher für dopaminerge Neuronenkulturen. Hier konzentriert sich das Video-Protokoll auf den empfindlichen Dissektion der embryonalen Gehirn der Maus. Präzise Exzision der ventralen Mittelhirn ist entscheidend für die neuronalen Kulturen ausreichend reich an dopaminergen Zellen zu erhalten, um nachfolgende Studien zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann mit embryonalen transgenen Mäusen realisiert werden und ist für die Immunfluoreszenzfärbung, quantitative PCR, second messenger Quantifizierung oder zum neuronalen Tod / Überleben Beurteilung.
Einleitung
Dopamin, eine der wesentlichen Neurotransmitter im Gehirn 1,2, wird hauptsächlich von dopaminergen Mittelhirn (DA) Neuronen freigesetzt. Die Mehrheit der DA Neuronen befinden sich in der ventralen Teil des Mittelhirns 2-6. Mesostriatal, mesolimbischen und mesocorticalen Wege 2,5: schematisch, Mittelhirn-Neuronen DA kann in drei anatomisch und funktionell verschiedene Projektionssysteme aufgeteilt werden. Der Weg wird in nigrostriatale Motorik beteiligt, die mesolimbischen Bahnen spielen eine wichtige Rolle in der Verstärkung, Motivation und Lernen, während die dopaminergen Bahnen zum präfrontalen Kortex vorstehen, sind in Erkenntnis <....
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Protokoll
Die in dieser Arbeit verwendeten Mäuse wurden gepflegt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Rates der Europäischen Union (86/609 / EU) für den Einsatz von Labortieren behandelt.
1. Herstellung der erforderlichen Lösungen
- Stammlösungen
- 10x Poly-L-Ornithin (PLO) Lösung: wiegen 10 mg PLO Hydrobromid (Molekulargewicht = 30,000-70,000) und in 70 ml sterilem Wasser auflösen. Die Lösung wird mit 0,2 um Spritzenfilter, aliquoten, und bei -20 ° C.
- 30% Glucose-Lösung: wiegen 30 g D (+) - Glucose und Auflösen in sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml. Filter, aliquoten, und bei 4 ° C.
- 5x Du....
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Ergebnisse
Eine illustrierte Flussdiagramm der Mittelhirn-Kultur Schritte ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, nach dem Sammeln von E13.5 Embryonen von einer schwangeren Schweizer Maus, Ventralmesenzephalons von der gesamten Embryo seziert. Die isolierten Gehirnfragmente werden nacheinander auf die enzymatische Verdauung und mechanische Dissoziation eingereicht. Dissoziierten Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert, in Kulturmedium resuspendiert und in vorbeschichteten 12 oder 24-Well-Platten ausplat.......
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Diskussion
Dieses Protokoll stellt die Verfahren und Reagenzien notwendig, eine Primärkultur von Mittelhirnneuronen von der embryonalen Maus und der Immunfluoreszenz-Verfahren zu dopaminergen Neuronen zu erkennen vorzubereiten. Kritische Schritte des Verfahrens sind die Dissektion der Embryonen und die mechanische Dissoziation der Fragmente gesammelt Gehirn. Hochwertige Dissektionsinstrumente hilft, die Technik zu beherrschen Dissektion. DA-Neuronen bilden einen kleinen Teil des Mittelhirns. Dementsprechend sammelt den rechten Tei.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Unterstützt durch Zuschüsse von CNRS und INSERM. PM bedankt sich für die Unterstützung durch die Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC bedankt sich für die Unterstützung durch die Fondation de France.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Fötales Rinderserum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4,5 g/L Glukose mit L-Glutamin | Lonza | BE12-604F | |
| 0,05% Trypsin-EDTA (1x), phenolrot | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-Glutamin, 200 mM Lösung | Life Technologies | ||
| Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium/Nährstoff-Gemisch F-12 Schinken | Sigma-Aldrich | D0547 | Pulver |
| Laminin - 1 mg/ml in Tris gepuffertem NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithinhydrobromid | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins | Sigma-Aldbsp; | I5523 | |
| Apo-Transferrin human | Sigma-Aldbsp; | T1147 | |
| Putrescindihydrochlorid | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Natriumselenit | Sigma-Aldbsp; | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycin | Sigma-Aldrich | G7126 | Stammlösung 1 M in Wasser |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G9391 | Stammlösung 2% (w/v) in Wasser |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyd 16% in Wasser | Elektronenmikroskopie Sciences | RT 15710-S | |
| Natriumbicarbonat (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrat | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Salzsäure - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Steriles Wasser - Aqua B. Braun | Braun Braun | ||
| Ethanol absolut NORMAPUR Analysenreagenz | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petrischalen | VWR | 82050-566 | |
| Pasteurpipetten Normalglas - Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Zählkammer Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Spritzenvorsatzfilter mit Supor Membran, steril, GF/0,2 & Mikro; m, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Chirurgische Schere - Gerade, scharf-scharf, 14,5 cm lang | Fine Science Tools | 14002-14 | Zum Öffnen der Bauchdecke |
| Schere - Gerade, spitz, filigran, 10 cm lang | MORIA | 4877A | Zum Öffnen der Gebärmutterwand |
| Pinzette - Gebogene, übliche, gezackte Kiefer 1 mm | MORIA | 2183 | Zur Manipulation von |
| EmbryonenVannas Schere - Gebogene, spitze, 7 mm Klingen | MORIA | MC50 | Zum Herausnehmen des Mesencephalons |
| Ultrafeine Pinzette - Gebogen, zart, 13 cm lang | MORIA | 9987 | Zur Entfernung von Hirnhäuten |
| BD BioCoat Poly-D-Lysin 24-Well-Multiwell-Platten | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-Well-Zellkulturplatte, flacher Boden mit Deckel | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Objektträger, geschliffene Kanten 90º | MENZEL-GLÄ SER | AG00008032E | |
| Präzisions-Deckgläser Stärke Nr. 1,5H rund 18 mm & Oslash; | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyklonaler Kaninchen-Anti-Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2)-Antikörper | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoklonaler Maus-Anti-Glutamat-Decarboxylase (GAD67)-Antikörper, Klon 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoklonaler Ratten-Anti-Dopamin-Transporter (DAT)-Antikörper, Klon DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoklonaler Maus Anti-5-HT Antikörper | 1/8.000 - Großzügiges Geschenk von Yves Charnay (Schweiz, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Ziegenserum, Neuseeland Herkunft | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Antikörper | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Antikörper | Life Technologies | A-11001 | 1/1.000 |
| Alexa Fluor 594 Ziege Anti-Ratte IgG (H+L) Antikörper | Life Technologies | A-11007 | 1/1.000 |
| VECTASHIELD HardSet Eindeckmedium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomikroskop | Carl Zeiss Mikroskopie | Stemi-2000C | |
| Bunsenbrenner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
Referenzen
- Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
- Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
- Dahlstro....
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Nachdrucke und Genehmigungen
