Bestimmung der Protein-Ligand-Wechselwirkungen mit Differential Scanning Fluorimetrie

Zusammenfassung

Die dynamische Differential-Fluorimetrie ist eine weit verbreitete Methode zum Screening von Bibliotheken kleiner Moleküle auf Wechselwirkungen mit Proteinen. Hier stellen wir eine einfache Methode vor, um diese Analysen zu erweitern, um eine Schätzung der Dissoziationskonstante zwischen einem kleinen Molekül und seinem Proteinpartner zu erhalten.

Zusammenfassung

Eine breite Palette von Methoden sind derzeit für die Bestimmung der Dissoziation zwischen einem Protein konstant und die Interaktion kleine Moleküle zur Verfügung. Allerdings sind die meisten von ihnen ist der Zugriff auf spezielle Ausrüstung, und erfordern oft eine gewisse Kompetenz, um effektiv zu etablieren zuverlässige Experimente und Daten zu analysieren. Differential Scanning fluorimetrisch (DSF) wird zunehmend als eine robuste Methode zur ersten Screening von Proteinen zu interagieren kleine Moleküle, entweder zur Identifizierung physiologischen Partnern oder für Hit Entdeckung eingesetzt. Diese Technik hat den Vorteil, dass es nur eine PCR-Maschine für die quantitative PCR und so geeignete Instrumentierung ist in den meisten Einrichtungen benötigt; Eine exzellente Auswahl von Protokollen sind bereits verfügbar; und es gibt starke Präzedenzfälle in der Literatur für mehrere Anwendungen des Verfahrens. Frühere Arbeiten mehrere Mittel zur Berechnung Dissoziationskonstanten von DSF Daten vorgeschlagen, aber diese sind mathematisch anspruchsvoll. Hier haben wir DMonstrate Verfahren zum Schätzen Dissoziationskonstanten von einer moderaten Menge an DSF experimentellen Daten. Diese Daten können in der Regel gesammelt und an einem einzigen Tag analysiert werden. Wir zeigen, wie verschiedene Modelle verwendet werden, um Daten von der einfachen Bindungsereignisse gesammelt zu passen, und wo kooperative Bindung oder unabhängige Bindungsstellen vorhanden sind. Schließlich präsentieren wir ein Beispiel für die Datenanalyse in einem Fall, wo Standard-Modelle nicht gelten. Diese Methoden werden mit den Daten auf handelsüblichen Kontrollproteine ​​gesammelt und zwei Proteine, die von unserem Forschungsprogramm veranschaulicht. Insgesamt bietet unsere Methode eine einfache Möglichkeit für die Forscher, um schnell zu gewinnen weitere Einblicke in Protein-Ligand-Interaktionen mit DSF.

Einleitung

Alle Proteine ​​binden, mit unterschiedlichen Affinitäten, um eine breite Palette von anderen Molekülen aus einfachen Ionen zu anderen großen Makromolekülen. In vielen Fällen, Proteine ​​zu binden, um kleine Molekül Partner als Teil ihrer normalen Funktion (beispielsweise eine Kinase-Bindung an ATP). Andere Wechselwirkungen kann unabhängig funktionieren können, sind jedoch experimentell nützlich als Werkzeuge (beispielsweise kleine Moleküle, Proteine ​​zu stabilisieren, um die Kristallisation Erfolg zu verbessern oder zu unterstützen bei der Aufrechterhaltung der Proteine ​​in Lösung); während kleine Moleküle, die an aktiven Stellen und allosterischen Zentren von Proteinen binden kann, als Inhibitoren wirken, und so modulieren die Aktivität von Enzymen.

Es gibt eine Vielzahl von Techniken, die verwendet werden kann, um die Affinität der Proteine ​​für die Partner-Moleküle zu bestimmen. Isothermen Titrationskalorimetrie ¹ wird allgemein als "Goldstandard" angesehen, da es reich Informationen über Reaktionen ist Etikett kostenlos, und hat für einen begrenzten Möglichkeitenrtifacts des Experiments. Trotz der jüngsten Verbesserungen in der Empfindlichkeit der Instrumentierung und Automatisierung der Versuchsaufbau ist es jedoch immer noch in Bezug auf die Proteinbedarf relativ teuer, hat im besten Fall einen niedrigen bis mittleren Durchsatz und ist am besten geeignet, um Interaktionen mit mittelschwerer bis hohe Affinitäten (10 nM bis 100 uM K _d) ^2. Andere Label freie Verfahren wie Oberflächenplasmonenresonanz-oder Doppelschicht-Interferometrie ³ bieten höhere Durch und haben die Empfindlichkeit erreicht werden, um kleinere Moleküle so niedrig wie 100 Da zu erkennen. Allerdings sind hohe Durchsatz Instrumente für diese Methoden vergleichsweise teuer sind, werden nur gerechtfertigt, wenn es eine ständige Durch relevanter Projekte, und so dürften unzugänglich vielen akademischen Laboratorien zu sein.

Differential-Scanning-Fluorimetrie (DSF oder thermofluor) wurde erstmals 2001 ⁴ als ein Verfahren zur Wirkstoffsuche beschrieben. In diesem method werden die Proteine ​​mit einem Fluoreszenzfarbstoff inkubiert (zunächst Naphthalin-Sulfonsäure-Farbstoffe verwendet wurden), die ihre Fluoreszenz bei der Bindung an den hydrophoben Bereichen der Proteine ​​verändert. Das Protein-Farbstoff-Probe wird dann erwärmt, und die Fluoreszenz überwacht die Wärme ansteigt. Die Entfaltung des Proteins, und die Belichtung des hydrophoben Teile des Proteins, verursacht eine charakteristische Muster in der Fluoreszenz als eine Funktion der Temperatur (Abbildung 1a). Das Experiment kann in kleinen Mengen in kommerziellen quantitativen PCR-Gerät durchgeführt werden, so dass in einem einzigen Experiment kann eine große Anzahl von Proben gleichzeitig getestet werden (gewöhnlich 48, 96 oder 384 Proben, je nach Gerätetyp). Experimente können in der Regel in der Nähe von einer Stunde durchgeführt werden, wodurch die Möglichkeit einer Hochdurchsatzanalyse der Proben ^5.

Weitere Verbesserungen der Methodik haben die Annahme von Farbstoffen mit besseren spektralen Eigenschaften ^6,7 gesehen , generische Instrumente zur Datenanalyse, und schlug vor, Protokolle für die ersten Screening ^8,9. Die Bandbreite der Anwendungen des Verfahrens auf die Einrichtung optimale Bedingungen für die Herstellung und Lagerung von Proteinen ¹⁰ und auf die Identifizierung von potentiellen Bindungspartnern, um die Kristallisation ¹¹ Beihilfen erweitert worden, mit einem besonderen Fokus. Die relativ hohe Durchsatz der Methode, mit relativ geringen Kosten in Protein (~ 2 g pro Reaktion), und die Anwendbarkeit zur Untersuchung schwach bindende Moleküle hat DSF einen wertvollen Werkzeug für Fragment basiertes Wirkstoffdesign, vor allem im akademischen Kontext ^12-14.

Trotz der breiten Anwendung des DSF zum Studium von Protein-Ligand-Wechselwirkungen haben nur wenige Studien Bestimmung von Dissoziationskonstanten aus diesen Studien beschrieben. Allerdings sind diese tendenziell detaillierten Gleichungen zur Beschreibung der Entfaltung des Proteins, mit vielen Parametern, die zu wenige Daten oder in einigen Fällen E montiert werden muß produzierenstimated ^7,15-17. Diese Methoden sind von besonderer Bedeutung in schwierigen Fällen, wie dicht verbindlich Verbindungen oder Proteine, die ungewöhnliche Übergängen. Jedoch für viele Labors sind diese detaillierte Analysen zu umständlich für den Routineeinsatz. Wir haben daher alternative Behandlungen schlagen für verschiedene Szenarien und zeigen, wie diese verwendet werden, um Daten aus verschiedenen Protein-Ligand-Wechselwirkungen, die zu passen. Unsere Methode verwendet das StepOne qPCR Instrument, für die maßgeschneiderte Datenanalyse-Software ist vorhanden; Während dies beschleunigt die Datenanalyse, können die Ergebnisse von anderen Instrumenten mit zuvor veröffentlichten Verfahren ⁹ bearbeitet werden, und dasselbe stromabwärts Analyse durchgeführt werden.

Protokoll

1. Bestimmung der einen Näherungswert für die Dissoziationskonstante (dh innerhalb einer Größenordnung)

1. Bereiten Sie die Mischung in Tabelle 1 aufgeführt.
2. Bereiten Bestände der Liganden von Interesse bei der höchsten Konzentration vorhanden, und dann bei sechs von zehn fache Verdünnungen davon. Wobei eine ungefähre _Kd ist aus dem Stand Daten bekannt, zielen darauf ab, die mindestens zwei Konzentrationen oberhalb und unterhalb der K _d haben.
3. 18 ul Aliquots der Mischung in acht Vertiefungen einer Platte qPCR. Add 2 ul Lösungsmittel in die erste Vertiefung. Add 2 ul jedes Mitglied des Ligand-Verdünnungsreihe (Schritt 1.2) in eine Vertiefung jedes der verbleibenden sieben Vertiefungen.
4. Legen Sie eine qPCR-Dichtung über der Platte. Um eine gute Abdichtung der Platte zu erreichen, legen Sie eine Hand Applikator (siehe Tabellen von spezifischen Reagenzien) in der Mitte der Platte. Glätten die Dichtung an einer Seite und dann auf der anderen Hälfte wiederholendie Platte.
5. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 g für zwei Minuten, um Luftblasen zu entfernen.
6. Die Platte wird in einem StepOne qPCR Instrument. Wählen Sie das "Melt Kurve"-Option, die ROX-Filter, und wählen Sie die schnelle Änderungsgeschwindigkeit (dies einen 2 min Pause bei 25 ° C, gefolgt von einer Rampe bis 99 ° C über 40 min, und dann eine 2 Minuten Pause). Führen Sie einen thermischen Denaturierung.
   HINWEIS: Script-Dateien für die Durchführung einer Lauf sind online unter http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.
7. Zum Abschluss des Instruments auszuführen, klicken Sie auf die Schaltfläche "Analysieren" auf dem Bildschirm. Speichern Sie das Ergebnis Datei.
8. Öffnen Sie die Shift-Protein Thermal-Software.
   1. Erstellen Sie eine neue Studie; im Eigenschaften-Registerkarte, geben diesem einen Namen, und in der Registerkarte Bedingungen, Detail die Liganden.
   2. Bewegen Sie die Registerkarte Experiment Dateien, und importieren Sie die Datei gespeicherten Ergebnisse (XXX.eds) und stellen den Inhalt der einzelnen Brunnen (fil-Vorlagees sind von den Autoren).
   3. Bewegen Sie die Registerkarte Analyse, und drücken Sie die "Analyze"-Taste.
      HINWEIS: Diese werden die Ergebnisse analysieren. Es ist möglich, die Ergebnisse für die weitere Untersuchung mit Excel auf der Registerkarte Export exportieren. Die Ergebnisse werden in einem Register abgegrenzt Format exportiert. Es ist am besten, um die exportierte Datei in Excel öffnen, und sofort im Excel-Format speichern.
9. Zu überprüfen, dass das Protein in der Gegenwart von Lösungsmittel allein ergibt ein ähnliches Ergebnis wie in 1A gezeigt. Weiter, überprüfen Sie die in den Ergebnissen in der "Replikat" Scheibe beobachtete Schmelztemperaturen. Stellen Sie sicher, dass dies zeigt einen deutlichen Anstieg der Schmelztemperatur mit zunehmender Ligandenkonzentration.
   HINWEIS: Idealerweise wird dies ein deutliches Maximum Schmelztemperatur (unter der Annahme, dass das Protein vollständig Liganden gebunden ist) und eine ungefähre _Kd bereitzustellen, wo die Schmelztemperatur ist auf halbem Weg zwischen dem Liganden-freie Protein unddas Maximum.

2. Versuchsaufbau zur Bestimmung der Dissoziationskonstante

1. Vorbereitung der Mischung in Tabelle 2 als Master Mix beschrieben.
2. Bereiten Aktien des Liganden mit fünfzehn verschiedenen Konzentrationen, die das Zehnfache im letzten Experiment verdünnt wird. Idealerweise sind Konzentrationen mindestens zwei Größenordnungen oberhalb und unterhalb der geschätzten K _d, und in der Mitte die Konzentrationen auf der geschätzten K _d. Konzentrieren sich auf sieben der Punkte innerhalb einer Größenordnung des geschätzten K _D, vier weitere Punkte auf jeder Seite von diesem; wenn es eine Wahl, umfassen mehr Punkte auf Werte, die Sättigung sind.
   HINWEIS: Wenn notwendig, machbar, um die Versuchsbedingungen zu ändern, so dass die Liganden-Aktien zum doppelten experimentelle Konzentration, wo Liganden Löslichkeit ist die Begrenzung sind ist es.
3. Fügen Sie 120 ul des Master-mischen bis acht Vertiefungen einer U-förmigen Platte mit 96 Vertiefungen, um als Reservoir für bequeme Abgabe des Mastermixes handeln. Verwenden Sie einen 8-Kanal-Pipette bis 18 ul in eine Spalte einer PCR-Platte zu verzichten. Wiederholen Sie für weitere fünf Säulen, auf insgesamt 48 gefüllte Vertiefungen in einer 6 x 8 Muster auf der Platte geben.
4. Mit 20 ul der Liganden Aktien oder des Lösungsmittels in die Vertiefungen in einer U-förmigen Platte mit 96 Vertiefungen zu trennen. Mit einem 8-Kanal-Pipette absaugen 2 ul von acht verschiedenen Liganden Aktien (oder Lösungsmittel). Fügen Sie diese auf eine Spalte der PCR-Platte, die mit Master-Mix in Schritt 2.3 gefüllt war. Wiederholen Sie mit den gleichen acht Liganden / Lösungsmittelvorräte für zwei weitere Säulen. Saugen Sie 2 ul den verbleibenden acht Liganden oder Lösungsmittel Aktien, und fügen Sie diese zu einem vierten Spalte in der Platte. Wiederholen Sie dies für zwei weitere Säulen. Dies wird dreifachen Proben für alle 16 Liganden und Lösungsmittel Proben geben.
5. Legen Sie eine qPCR Dichtung über die Platte (siehe Schritt 1.4).
6. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 g fürzwei min.
7. Die Platte wird in der qPCR Instrument. Führen Sie einen thermischen Denaturierung mit den in Schritt 1.6 angegebenen Parametern.
8. Zum Abschluss des Instruments auszuführen, klicken Sie auf die Schaltfläche "Analysieren" auf dem Bildschirm. Speichern Sie das Ergebnis Datei.
9. Öffnen Sie die Shift-Protein Thermal-Software. Erstellen Sie eine neue Studie; im Eigenschaften-Registerkarte, geben diesem einen Namen, und in der Registerkarte Bedingungen, Detail die Liganden.
10. Bewegen Sie die Registerkarte Experiment Dateien, und importieren Sie die Datei gespeicherten Ergebnisse (XXX.eds), und stellen Sie die Inhalte jeder gut.
    HINWEIS: Template-Dateien sind online unter http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.
11. Bewegen Sie die Registerkarte Analyse, und drücken Sie die "Analyze"-Taste.
    1. Wählen Sie die "Replikate" Registerkarte aus dem Menü auf der linken Seite des Bildschirms, um die Ergebnisse als dreifach zu zeigen. Bewerten Sie die Zuverlässigkeit der Daten auf der Grundlage, wie eng die dreifach sind. Should die dreifach zeigen schlechte Reproduzierbarkeit, untersuchen Sie die Rohdaten eng.
    2. Analysieren der Daten unter Verwendung sowohl der Boltzmann-Derivative oder Verfahren, um die Schmelztemperatur zu bewerten. Wählen Sie die "Ergebnisse reproduzieren" Registerkarte, und in der "Ergebnisse reproduzieren Handlung", drücken Sie die "Plot von" Taste zwischen "Tm - Boltzmann" und "Tm - Derivative". Wählen Sie die Methode, die die höhere Reproduzierbarkeit für die Probe gibt. Exportieren Sie die Ergebnisse zur weiteren Untersuchung mit Excel über die Registerkarte Export.
       HINWEIS: Für die Proben, die mehrere Übergänge zeigen, ist es fast immer am besten, um die Derivate-Methode in mehreren Schmelze-Modus verwenden. Die Ergebnisse werden in einem Register abgegrenzt Format exportiert. Es ist am besten, um die exportierte Datei in Excel öffnen, und sofort im Excel-Format speichern.
    3. Wiederholen Sie das Experiment mindestens zweimal, darunter eine Wiederholung an einem anderen Tag, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Sollte die Datenanalyse (siehe Schritt 3 unten)zeigen, dass der Wert von K _d unterscheidet sich deutlich von der ursprünglichen Schätzung, verändern die Ligandenkonzentrationen entsprechend (siehe Schritt 2.2), um eine gute Auswahl von Werten um K _d zu gewährleisten.

    3. Datenanalyse, um die Dissoziation bestimmen, unter thermischen Denaturierung Constant

    1. Erstellen Sie eine Tabelle in Excel der Liganden-Konzentrationen und die Schmelztemperatur.
    2. Öffnen Sie die GraphPad Prism Software und ein XY-Tabelle zu erstellen. Geben Sie die Daten mit Hilfe der X-Spalte für den Liganden-Konzentrationen und der Y-Spalte für die Schmelztemperatur Ergebnisse.
       Hinweis: Ein Beispiel ist gezeigt 1B. Ein Skript mit den Gleichungen vorgeladen, und alternative Anweisungen zur Verwendung der SPSS Statistik-Paket, sind online unter http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.
    3. In der Registerkarte Analyse, wählen Sie die Option Analyse Parameter zu änderns (Strg + T). Um das richtige Modell zu gelangen, wählen Sie "Neu" und "Neue Gleichung". Legen Sie die Gleichung in Tabelle 3 als "Single-Site-Ligandenbindung" beschrieben.
       HINWEIS: Ein Beispiel dieser Schritte wird in 1C gezeigt. Bei Verwendung der Skript mit Gleichungen vorgeladen, kann der entsprechende Gleichung gerichtet, die aus der Liste und nicht eingegeben werden. Ableitung dieser Gleichung ist in einem Anhang.
    4. Wählen Sie die "Regeln für die Anfangswerte" ein, und geben Sie Regeln für Anfangswerte wie in Tabelle 3 aufgeführt.
    5. Schränken den Parameter P, als "Konstante gleich" und geben die Endkonzentration des Proteins (in der gleichen Einheit wie der Ligand in angegeben).
    6. Wählen Sie OK, um die Analyse durchzuführen.
       HINWEIS: Ein Beispiel dieser Schritte wird in 1D gezeigt. Die Grafik-Software erzeugt eine Figur, die die Daten und die Passform zum Modell. Beispiele für tiese Analysen werden in den repräsentativen Daten angezeigt.

    4. Montage Daten an Kooperationsmodelle

    Um Daten in einem kooperativen Modell passen, wählen Sie entweder zwischen einer einfachen Genossenschaftsmodell oder ein Modell, bei dem zwei separate Dissoziationskonstanten definiert sind. Der erste Ansatz ist im Falle der negativen Kooperativität bevorzugt, oder als erste Untersuchung. Aber im Prinzip ist es besser, in Fällen positiver Kooperativität zu modellieren zwei verschiedenen Dissoziationskonstanten ^18. In diesem Fall kann die Modellierung gehen davon aus entweder sequenzielle Bindung von Liganden, oder unabhängige Bindung von Liganden.

    1. Führen Sie die gleichen Schritte wie in Anfangs Protokoll 3. jedoch in Schritt 3.3, legen Sie eine der Gleichungen in Tabelle 3 als "Simple Kooperationsmodell" aufgeführt, "Sequential Bindung von zwei Liganden" oder "Independent Bindung von zwei Liganden" ^18.
    2. Wählen Sie die entsprechenden Regeln für die Anfangswertewobei jede dieser Gleichungen in Tabelle 3 verbunden.
    3. Prüft die Übereinstimmung des Modells mit den Daten. Sollten die Daten passen schlecht, sollten Sie ein anderes Modell.
       Hinweis: Es ist auch wichtig, sorgfältig zu prüfen, das die Anpassung der Schmelztemperatur auf die Daten durch die Protein Thermal Shift-Software (Schritt 2.9): Manchmal ist es notwendig, die Parameter hier ändern, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Eine weitere Überlegung ist, ob der Bereich von Datenpunkten ist ideal, und ob es irgendwelche anomalen Punkte: entweder eine begrenzte Anzahl von Daten an beiden Seiten der K _d oder eine einzige anormale Stelle (insbesondere bei den höchsten Konzentrationen Ligand), erheblich beeinträchtigen kann die Ergebnisse.
    4. Wiederholen Sie das Experiment mindestens zweimal (siehe Schritt 2.12), um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

    5. Fitting Daten an Kurven, die Binary Verschiebungen in der Schmelztemperatur

    Gelegentlich anstelle einer abgestuften Reaktion auf Liganden, Proteine ​​wurdenbeobachtet, um eine binäre Antwort, wo gebunden Probe wird deutlich von ungebundenen Probe getrennt erlassen. Ein Beispiel ist in der repräsentativen Ergebnisse (Figur 4) vorgesehen. In diesem Fall werden Anpassung der Schmelztemperaturen keine gute Passform für K _d.

    1. Exportieren Sie die Ausgabe der Rohdaten aus der Protein Thermal Shift-Software. Für jeden Temperaturpunkt, die Berechnung der mittleren Fluoreszenz für die Nullliganden und höchsten Ligandenkonzentrationen. Tabellarisch die Ergebnisse von jedem Datenpunkt neben diesen.
       HINWEIS: Die hier erstellten Fehler weniger als der Fehler in den Einbauschmelztemperaturen ist.
    2. Öffnen Sie die SPSS Statistik-Paket. Kopieren der Temperaturen, die beiden mittleren Datenmengen, und die Daten für jedes Experiment zu einem Datenfenster in SPSS. In der Registerkarte Variable, stellen Sie die mittlere Datenmenge ohne Liganden als "gering", und die mittlere Datenmenge für die höchste Liganden-Konzentration als "hoch".
    3. Laden Sie die Syntax-Datei zur Verfügungonline unter: http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular . Wählen Sie "Ausführen → Ausführen all".
    4. Kopieren Sie den Anteil gebunden Ergebnisse in eine neue Excel-Arbeitsmappe mit den entsprechenden Liganden-Konzentrationen.
    5. Öffnen Sie die Graphpad Software und ein XY-Tabelle zu erstellen. Geben Sie die Daten mit Hilfe der X-Spalte für den Liganden-Konzentrationen und der Y-Spalte für die Schmelztemperatur Ergebnisse. In der Registerkarte Analyse, wählen Sie "Änderungsanalyse Parameter". Um das richtige Modell zu gelangen, wählen Sie "Neu" und "Neue Gleichung". Geben Sie die Gleichung in Tabelle 3 angegeben, als "Analyse von binären Verschiebungen der Schmelztemperatur" aufgeführt.
    6. Wählen Sie die "Regeln für die Anfangswerte" ein, und geben Sie Regeln für die in Tabelle 3 aufgeführt Anfangswerte. Beschränken Sie den Parameter P, als "Konstante gleich" und geben Sie die endgültige Konzentration des Proteins (in den gleichen Einheiten wie die ligand in) angegeben.
       Anmerkung: Beispiele für die Ausführung dieser Boxen für das Protokoll in Abschnitt 3 sind in Abbildung 1C, D gezeigt.
    7. Wenn es eine gute Passform, die Ergebnisse können durch Extrapolation zu dem erwarteten Ergebnis bei unendlicher Liganden-Konzentration verbessert werden. Aus dem Modell des Anteils an jedem Liganden-Konzentration gebunden, untersuchen Sie den Wert für den höchsten Wert der Ligandenkonzentration. Wenn dies 0,99 oder größer ist, ist die weitere Analyse unwahrscheinlich, Ergebnisse zu verbessern.
    8. Wenn der Anteil weniger als 0,99 ist, ist ein zusätzlicher Schritt erforderlich, um die Auswirkungen des ungebundenen Proteins in der höchsten Konzentration Ligand Probe zu korrigieren. In Schritt 5.2 zu schreiben, den Anteil des Liganden an der höchsten Stelle der Ligandenkonzentration (aus Stufe 5.7) in die Zelle gebunden R2 (eine andere Zelle verwendet werden kann, und R2 ersetzt entsprechend der Gleichung in Tabelle 3). Erstellen Sie eine zusätzliche Spalte nach dem Mittelwert der höchsten Ligandenkonzentration Ergebnisse. In den TannenT-Zelle, kopieren Sie die Gleichung in Tabelle 3 aufgeführt als "Hochgerechnet auf Liganden-Konzentration unendlich". Kopieren Sie diese Formel, um die restlichen Zellen in dieser Spalte.
       Anmerkung: Diese Berechnung entfernt den Effekt des ungebundenen Proteins in der höchsten Ligandenkonzentration. Der Unterschied zwischen dem Liganden von freiem Protein und dem höchsten Ligandenkonzentration wird durch den Kehrwert des Anteils bei der höchsten Konzentration Ligand gebunden ist, um die erwartete Differenz zwischen vollständig gebundenen und ungebundenen Proteinzustände bei jeder Temperatur bereitzustellen Punkt multipliziert. Diese Differenz addiert oder von ungebundenen Zustand subtrahiert, um die erwartete Fluoreszenz vollständig Liganden gebundenes Protein zu geben.
    9. Ersetzen Sie die Spalte für maximale Ligandenkonzentration in der SPSS Datenblatt mit dieser neuen Spalte, und wiederholen Sie den Datenanpassung.
       Hinweis: Die Schritte 5,7-5,9 müssen möglicherweise wiederholt werden, wenn das Modell schlägt vor, eine weitere deutliche Veränderung des Anteils bei den maximalen Liganden gebunden concentrati(falls dies der Fall ist, wäre es wahrscheinlich ideal, um das Experiment mit einem anderem höhere Liganden-Konzentration Punkt zu wiederholen).
    10. In Fällen, in denen das Protein eine binäre Verschiebung und zeigt kooperatives Verhalten schlug die Gleichung in Schritt 5.5 ist mit den aus Schritt 4.1 substituiert sein. Die "Top" und "Bottom"-Parameter sollte von 1 und 0 bzw. ersetzt werden.
    11. Wiederholen Sie das Experiment mindestens zweimal (siehe Schritt 2.12), um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

Ergebnisse

Eine ausgezeichnete Testsubstrat für diese Methode ist Hexokinase. Dies hat die Vorteile, leicht im Handel erhältlich ist, und mit zwei Substraten, die in den meisten Laboratorien gefunden werden, und die klare, reproduzierbare Ergebnisse im Test. Eine Anfangskonzentration Bildschirm (Protokoll 1) mit Hexokinase und Glucose (2A), legt nahe, dass die Wahrscheinlichkeit K _d wird in einem Bereich von 0,2 bis 1,7 mm sein. Daher wurde ein größerer Bildschirm (Protokoll 2) durchgeführt, wobei die in Tabelle 4. Die Ergebnisse (Abbildung 2B) gezeigten Konzentrationen zeigen eine gute Anpassung an die Single-Site-Ligandenbindung Gleichung (Protokoll Abschnitt 3.3) [9], und gab ein K _d von 1,2 ± 0,1 mm.

Das mutmaßliche Heptose-Transferase Guanyl WcbM ^19,20 zeigt eine starke Wärmeverschiebung auf die Bindung an GTP (3A). Eine erste Bildschirm vorgeschlagen, dass die K_d würde im Bereich von etwa 100 um betragen. Daher wurde ein Vollbild aufgestellt, die in Tabelle 5 gezeigten Konzentrationen Fassung der Ergebnisse zu Gleichung 3.3 zeigte eine angemessene Passform (R ² von 0,981; 3B). .Allerdings, Gibt es eine offensichtliche Differenz zwischen den Daten und der Modell, was darauf hindeutet, dass eine andere Gleichung benötigt. Suchen von der Proteindatenbank ²¹ mit dem WcbM Sequenz zeigte, dass die am nächsten Homologen, für die Strukturen bestimmt worden Dimere. Die Daten wurden mit Hilfe der drei Gleichungen für die kooperative, sequentiell, und unabhängige Bindung von zwei Liganden (Protokoll 4) daher analysiert. Die passenden Statistiken für eine Genossenschaftsmodell gab einen R ^2-Wert von 0,998 und Standardabweichung der Residuen (Sy.x) von 0,215, während sowohl sequentielle und unabhängige Bindungsmodelle gab einen R ^2-Wert von 0,992 und ein Sy.x von 0,480 und 0,461 jeweils. Dies deutet darauf hin, dass das Modelldabei die beste Anpassung an die Daten wurde das Genossenschaftsmodell: hier, ein K _½ von 230 ± 10 uM beobachtet wurde, mit einem n-Wert von 0,52 ± 0,02 (3C). Dies zeigte eine negative Kooperativität der Bindungs. Beachten Sie, dass ein K _½ wurde in diesem Fall eher als K _d verwendet wird, da die Einheiten für K _d würde das eher unbefriedigend uM ^0,52 sein.

Das mutmaßliche BIP-6-Desoxy-β-D-manno -heptopyranose 2 O -acetylase, WCBI ^22, zeigt eine eher ungewöhnliche Ergebnis in Differential Scanning fluorimetrisch. In Abwesenheit von irgendeinem Liganden, zeigt es eine klare und einfache Denaturierung (4A). Coenzym A (CoA) als Liganden des Proteins unter Verwendung von DSF, und die Affinität des Proteins für diesen Partner identifiziert wurde, wie in dem Protokoll beschrieben untersucht. In Gegenwart von hohen Konzentrationen an CoA, ein starker shift auf eine höhere Temperatur eingehalten wird, mit einer Veränderung in der Schmelztemperatur von 15 ° C. Jedoch bei mittleren Konzentrationen, anstatt eine Verschiebung zu einer einphasigen Schmelzen bei einer mittleren Schmelztemperatur zeigte eine biphasische WCBI Schmelzen, mit dem Protein erscheint auf dem Liganden-freie Temperatur oder der vollständig gebunden Schmelztemperatur (4A) Schmelz . Die Anteile der beiden Arten in einer dosisabhängigen Art und Weise verändert, mit steigender Substratkonzentrationen, den Anteil, der bei der höheren Temperatur (4B) aufgeschmolzen. Direkte Analyse dieser Daten war eine Herausforderung: die Ausstattung der Boltzmann-Gleichung gab sehr schlecht passt, während derivative Verfahren hervorgehoben, dass zwei Schmelz Ereignisse auftreten, aber nicht der Nachweis einer Veränderung mit zunehmender Ligandenkonzentration zu unterstützen.

Eine weniger konventionelle Ansatz zur Analyse dieser Daten wurde daher angenommen (Protokoll 5). Die Fluoreszenz derivative Ergebnisse ohne Liganden und bei der höchsten Liganden-Konzentration wurden als wesentlichen Stellvertretend für alle Protein in der niedrigeren Schmelztemperatur oder der höheren Schmelztemperatur Staat übernommen. Die verbleibenden Derivat Daten wurden an jedem Punkt als die Summe einer Proportion eines jeden dieser zwei Zustände eingesetzt, wobei der Anteil der Einheit (4C) summiert. Die erhaltenen Daten wurden dann, wie vorher, um eine scheinbare K _d zu erhalten, wobei dieselben Gleichungen wie zuvor versehen. Dieser betonte, dass die "hohen" Liganden Punkt ist wahrscheinlich nur 95% Liganden gebunden. Die Daten wurden dann auf einer Vorhersage des Ergebnisses einer 100% gebundenes Protein extrapoliert, und die Datenanpassung wiederholt wird, um eine scheinbare K _d von 58 ± 2 um zu ergeben. Dies bot eine ausgezeichnete Passform der experimentellen Ergebnisse zur Bindungsmodell (4D).

fo: content-width = "5in" src = "/ files / ftp_upload / 51809 / 51809fig1highres.jpg" width = "500" />
Abbildung 1. Beispiele für Versuchsaufbau und Analyse. (A) Beispiel der erwarteten Form einer thermischen Denaturierung Profil (von der Daten genommen für Hefehexokinase). Die charakteristische Form der Rohdaten zeigt einen progressiven Anstieg in der Fluoreszenz mit einem Maximum, gefolgt von einem flachen Gang (detaillierter diskutiert in ^9). Dies wird durch einen einzigen Peak in der ersten Ableitung der Fluoreszenz begleitet. (B) Beispiel für die Dateneingabe in Graphpad. Liganden-Konzentration ist auf der X-Achse (C) Beispiel der Definition in Gleichung Graphpad der korrekten Einstellung der Anfangswerte der Variablen und der Fixierung der Proteinkonzentration gegeben, und beobachtete Schmelztemperatur auf der Y-Achse.. (D) Beispiele, um eine korrekte Bestimmung der Dissoziationskonstante zu ermöglichen.m / files / ftp_upload / 51809 / 51809fig1highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

. Figur 2. Wechselwirkung von Hexokinase mit Glucose durch Differentialscanningkalorimetrie fluorimetrisch gemessen (A) einem ersten Experiment Testen einer Vielzahl von Glucosekonzentrationen nahe, dass die _Kd ist wahrscheinlich im Bereich von 0,2 -. 1,7 mm (b) ein detailliertes Experiment testet 16 Konzentrationen von Glukose, erlaubt die Bestimmung des scheinbaren K _d 1,12 ± 0,05 mm. Die Daten passen sehr gut zum Modell für eine einzelne Bindungsereignis (mit dem Boden (T1) und nach oben (T2) Temperaturen passend auf 35,4 ± 0,2 ° C und 49,3 ± 0,5 ° C beziehungsweise). Beachten Sie, dassDiese Daten wurden in Gegenwart von 10 mM MgCl ₂ gesammelt. Diese Bilder wurden mit GraphPad vorbereitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Wechselwirkung von WcbM mit GTP zeigt eine Anti-kooperative Bindung. (A) Eine erste Experiment testet eine breite Palette von GTP Konzentrationen deutet darauf hin, dass die K _d ist wahrscheinlich im Bereich von 200 sein -. 500 um (B) Eine detaillierte Experiment, Test 16 Konzentrationen von GTP, schlägt einen Wert für die scheinbare K _D von 120 ± 20 um. Wenn jedoch eine logarithmische Skala für die x-Achse verwendet werden, gibt es eine signifikante ErmessenPancy zwischen Modell und Daten. (C) Analyse der gleichen Daten mit einem kooperativen Modell zeigt eine hervorragende Anpassung an die Daten, wo eine einfache Kooperationsmodell verwendet wird. Hier, ein K _½ von 230 ± 20 um bestimmt, wobei die Kooperativität Koeffizient n = 0,52 ± 0,02 (mit dem Boden (T1) und nach oben (T2) Temperaturen passend zu 69,63 ± 0,06 ° C und 79,9 ± 0,1 ° C beziehungsweise). Wie WcbM erscheint dimeren ist, bedeutet dies, dass das Enzym in seiner Bindung an GTP perfekt anticooperative. Diese Bilder wurden mit GraphPad vorbereitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. WCBI zeigt einen zweiphasigen Schmelzmusterin Gegenwart der Liganden-Coenzym A (CoA). (A) WCBI, in Abwesenheit von Ligand (blau) zeigt eine einfache einphasige Schmelzen Muster. Bei hohen Ligandenkonzentrationen (1 mM; grüne Linie), ist ein ähnliches Muster beobachtet. Jedoch bei mittleren Ligandenkonzentrationen. (60 uM; rote Linie), zwei unterschiedliche Schmelzpeaks, entsprechend ligandenfreien und Ligand-Bindungszustände beobachtet (B) Der Übergang zwischen den beiden Gruppen von Spitzen ist dosisabhängig über die gesamte Konzentrationsbereich. (C) Modellierung des zweiphasigen Schmelz als eine Summe von einem Anteil der Liganden kostenlos und hohe Liganden Ergebnisse gibt eine gute Anpassung an die Daten (gestrichelte violette Linie, verglichen mit rote Linie). Diese Passform wird durch Extrapolation der für hohe Ligandenkonzentration (wo das Modell legt nahe, ~ 95% Auslastung), um Vollbelegung (gestrichelte blaue Linie) beobachtete Ergebnis verbessert. (D) die für den Anteil der WCBI CoA gebunden sho erhaltenen Daten ws eine ausgezeichnete Anpassung an eine einfache Bindungsmodell mit einem K _d von 58 ± 2 um (diese Daten stellen Daten an zwei Tagen gesammelt, mit leicht unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen für den zweiten Tag gewählt, basierend auf dem ersten Satz von Ergebnissen). Panels. (A - C) wurden unter Verwendung von Excel und Feld (D) mit Graphpad Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1. Rezept für erste Experimente.

Reagens	Volumen im Mix (ul)
Protein	Um eine Endkonzentration von 0,11 mg / ml
0,3
0,5 M HEPES pH 7,0	3.7
5 M NaCl	5.6
Wasser	180 ul

; "> 5000X SYPRO orange

Dies beschreibt die "Master-Mix" von Eiweiß, Nachweis-Reagens und Puffer für einen ersten Scouting Experiment, um eine Schätzung der K _d vorzusehen, wie in Abschnitt 1. Diese Protokollpuffergemisch für generische Proteine ​​geeignet ist beschrieben. Wo bisherigen Ergebnisse deuten darauf hin, andere Puffer verwendet werden sollen, sollten diese ersetzt werden. Wenn das Protein Lager ist in einer niedrigen Konzentration (dh weniger als 0,3 mg / ml) kann es erforderlich, die Menge der zusätzlichen Puffer zu reduzieren hinzugefügt, um Puffer bereits in der Probe vorhandenen Proteins zu kompensieren.

Tabelle 2. Rezept für die Bestimmung von K _d.

Reagens	Volumen im Mix (ul)
Protein	Um eine Endkonzentration von 0,11 mg / ml
5,000X SYPRO orange	1,78
0,5 M HEPES pH 7,0	22.2
5 M NaCl	33,3
Wasser	180 ul

Dies beschreibt die "Master-Mix" von Eiweiß, Nachweis-Reagens und bUffer für eine vollständige Bestimmung von K _d für eine Proteinprobe, wie in Abschnitt 2 beschrieben Protokoll Dieser Puffer Mischung ist für generische Proteine ​​geeignet. Wo bisherigen Ergebnisse deuten darauf hin, andere Puffer verwendet werden sollen, sollten diese ersetzt werden. Wenn das Protein Lager ist in einer niedrigen Konzentration (dh weniger als 0,3 mg / ml) kann es erforderlich, die Menge der zusätzlichen Puffer zu reduzieren hinzugefügt, um Puffer bereits in der Probe vorhandenen Proteins zu kompensieren.

Tabelle 3 Gleichungen und Parameter für die Datenanalyse.

_d

Schritt in Versuchsprotokoll	Gleichung erforderlich	Parameter erforderlich	Beschreibung von Variablen und Parametern
3.3
Single-Site-Ligandenbindung	Y = Bottom + ((Top-Bottom) * (1 - ((PK d X + sqrt (((P + X + K d) ^ 2) - (4 * P * X))) / (2 * P ))))		P: Proteinkonzentration. Kd: Dissoziationskonstante. P und Kd sind in den gleichen Einheiten, die für die Liganden-Konzentrationen verwendet wurden, angegeben. Oben, Unten: Schmelztemperaturen bei unendlicher Ligandenkonzentration und ohne Liganden-Konzentration auf.
3.4		Unten = * YMIN	YMIN: Minimalwert von Y (niedrigste experimentellen Protein Tm, in diesem Fall)
		Top = * YMAX
		K d = * X an YMID	YMID: Wert von Y, die dem Mittelwert der YMIN und YMAX entspricht. X die entsprechenden X-Wert (hier die entsprechenden Liganden-Konzentration) ist
		P = (Anfangswert, fit zu sein)
4.1
Einfache Genossenschaftsmodell	Y = Bottom + ((Top-Bottom) * (((X / Kd) ^ n) / (1 + ((X / Kd) ^ n))))		n: Hkrank Koeffizienten. Dies beschreibt die Kooperativität oder anderen biochemischen Eigenschaften des Proteins, und ist nicht notwendigerweise eine Schätzung der Anzahl der Ligandenbindungsstellen in dem Protein. Ein Hill-Koeffizienten von eins entspricht keine Kooperativität; Werte kleiner als eins zeigen negative Kooperativität, und Werte größer als eine positive Kooperativität.
		Unten = * YMIN
		Top = * YMAX
		K d = * X an YMID
		P = (Anfangswert, um fit zu sein )
		n = (Anfangswert, fit zu sein)
Sequenzielle Bindung zweier Liganden	Y = Bottom + ((Top-Bottom) * ((x ^ 2) / (K * d K2)) / (1 ​​+ (X / K d) + ((x ^ 2) / (K * d K2))) )		K2: Dissoziation für die zweite Bindungsereignis konstant.
		Unten = * YMIN
		Top = * YMAX
		K2 = * X an YMID
		P = (Anfangswert, fit zu sein)
Unabhängige Bindung von beiden Liganden	Y = Bottom + ((Top-Bottom) * ((x ^ 2) / (K * d K2)) / (1 ​​+ (2 * X / K d) + ((x ^ 2) / (K * d K2) )))
		Unten = * YMIN
		K d = * X an YMID
		K2 = * X an YMID
		P = (Anfangswert, fit zu sein)
5.5
Analyse von binären Verschiebungen der Schmelztemperatur	Y = 1 - ((PK d X + sqrt (((P + X + K d) ^ 2) - (4 * P * X))) / (2 * p))
		Unten = * YMIN
		Top = * YMAX
		K d = * X an YMID
		P = (Anfangswert, fit zu sein)
5.8
Extrapolation auf unendliche Liganden-Konzentration	(C2 - ((1-R $ $ 2) * B2)) / R $ 2 $		B2: Zelle, die das Ergebnis ohne Liganden. C2: Zelle, die das Ergebnis mit maximaler Liganden. $ R $ 2: Zelle, die das Verhältnis bei maximaler Konzentration Ligand gebunden.

YMAX: Maximalwert von Y (höchste experimentellen Protein Tm) dth: 123px; "> K = * X bei YMID h: 123px; "> Top = * YMAX 23px; ">

Schritte 3, 4 und 5 erfordern die Zugabe von detaillierten Gleichungen in der Analyse-Software und die präzise Definition der Startparameter für die Datenanalyse. Die Gleichungen für jeden relevanten Schritt angezeigt, mit der richtigen Auswahl der Parameter. Eine Erklärung der Bedeutung der Variablen und Parametern zu Referenzzwecken.

Tabelle 4. Konzentrationen für das Screening der Interaktion von Hexokinase mit Glucose.

Probenpunkt	Ligand (glucose) Konzentration (mM)
1	0
2	0,001
3	0,005
4	0,01
5	0,03
6	0,1
7	0,3
8	0,4
9	0,7
10	1.1
11	2.1
12	3.7
13	5.3
14	7
15	9
16	11

Hexokinase aus der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wurde wie in dem Protokoll beschrieben, um den Master-Mix gegeben, mit 10 mM MgCl ₂ ergänzt Magnesium ist ein bekanntes Cofaktor. Die erste Schätzung der K _d betrug zwischen 0,5 und 2 mm. Experimente wurden eingerichtet, um die angegebenen Endkonzentrationen von Glukose zu schaffen.

Tabelle 5. Konzentrationen für das Screening der Interaktion mit WcbM BIP.

Probenpunkt	Ligand (GTP)-Konzentration (uM)
1	0
2	0,5
3	1
4	5
5	10
6	25
7	50
8	100
9	250
10
11	1000
12	2.500
13	5000
14	7.500
15	10.000
16	20.000

"0" cellspacing = "0"> 8px; "> 500

WcbM aus Burkholderia pseudomallei wurde wie in dem Protokoll beschrieben, um den Master-Mix gegeben. Die erste Schätzung der K _d betrug etwa 100 uM. Experimente wurden eingerichtet, um die angegebenen Endkonzentrationen von GTP zu schaffen, mit dem Ziel, mindestens zwei Größenordnungen über und unter K _d zu decken.

Diskussion

Differential Scanning fluorimetrisch hat seine Macht als robuste und vielseitige Methode zur Charakterisierung von Proteinen und Identifizierung potenzieller Proteinliganden gezeigt. Die gut dokumentierten Erfolge bei der Beschleunigung Proteinstabilisierung, Arzneimittelforschung (vor allem in weniger gut finanzierten Laboratorien) und Kristallisation ^10,23-25 ​​haben sie eine attraktive Methode für die anfängliche Screening von Verbindungen hergestellt. Verbindungen, Proteine ​​hinzugefügt zeigen eine klare Dosis-abhängigen Anstieg der scheinbaren Schmelztemperatur ^7,9. Jedoch gab es einige Versuche, um die Ergebnisse aus diesen Experimenten verwendet, um scheinbare Bindungskonstanten in der Rangfolge von Verbindungen auf ihre Affinität zu helfen zu bestimmen. Hier stellen wir ein Verfahren zum systematischen Bestimmen einer scheinbaren Dissoziationskonstante von Proteinen in Gegenwart eines Liganden.

Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass DSF schnell und robust stellen Schätzungen der Dissoziationskonstante fürein Protein-Ligand-Kombination. Die beobachteten Daten können mit handelsüblichen Werkzeugen manipuliert werden, um eine schnelle Bestimmung der K _d zu schaffen, ohne dass Annahmen über den wahrscheinlichen Wert der Parameter vorzunehmen. Das Verfahren hat einen wesentlichen Vorteil gegenüber einer vergleichbaren Verfahren, sparsam sowohl Protein und Zeit erforderlich. Das hier beschriebene Experiment wird 0,13 mg Protein verbrauchen pro Versuch (etwa 0,4 mg für Experimente in dreifacher Ausfertigung wiederholt). Dieser Vergleich mit isothermer Titrationskalorimetrie (ITC), in einem einzigen Experiment mit durchschnittlich 40 kDa-Protein eine ähnliche Menge zu verbrauchen. Der vollständige Satz von Experimenten für dieses Protokoll erforderlich wäre, etwa 4 Stunden, einschließlich der Herstellung verbraucht, für eine Reihe von Experimenten. Auch dies ist wahrscheinlich sehr viel schneller als Verfahren, wie ITC oder Oberflächen-Plasmon-Resonanz, die während leistungsfähige erfordern oft erhebliche Optimierung besten Daten zu erzielen.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass es nach wie vor ein Bedarf an sorgfältig die Rohdaten, die Anpassung der Daten an die Schmelztemperatur zu bestimmen, und die Passform des Schmelztemperaturdaten an die Dissoziationskonstante zu bestimmen. Ein erstes Problem ist die Form der in dem Protein Schmelzen hergestellt Rohdaten. In einigen Fällen kann die Form nicht auf die in 1A beobachtet nähern. Häufige Probleme sind geringe Temperaturschwankungen auf die Ligandenbindung, hohe Hintergrundfluoreszenz, und ungewöhnliche mehrere Übergänge in der Temperatur. Niedertemperatur-Verschiebungen auf der Bindung von Liganden eine Reihe gesehen. Für dieses Verfahren ist der kritischste Parameter der Fehler in der T _m-Messung, verglichen mit der Temperaturverschiebung. Die Daten können in der Regel relativ gut ausgestattet, wenn die Standardabweichung von Dreifachmessungen nicht 10% der Schmelztemperatur Verschiebung zwischen ungebundenem und gebundenem Protein vollständig nicht übersteigt. Unsere Erfahrung ist, dass, wenn diese Temperaturratur Verschiebungen sind nur 2 ° C, kann dies ausreichend für die Montage der Daten, wenn die einzelnen Datenpunkte sind sehr genau. Ein zweites Thema ist ungewöhnlich geformte Kurven. Diese unterscheiden sich oft von freiem Protein und Ligand gebundenen Formen, wie die Ligandenbindungsarten beeinflusst Entfaltung des Proteins. In diesen Fällen muss der Benutzer prüfen, ob die Daten mit angemessenen Berücksichtigung der Modelle verwendet werden, um für die Bestimmung der Schmelztemperatur und der Dissoziationskonstante eingesetzt werden. Ein weiteres häufiges Problem ist, dass die Zugabe von Cofaktor an das Protein (zB MgCl ₂ in unserem Beispiel mit Hexokinase) erforderlich, um verlässliche Daten zu erhalten. Unsere Erfahrung hat in der Phase der Ausgangswerte unter wesentlich ist für den Erhalt der besten Ergebnisse waren, daß eine sorgfältige Abwägung aller Faktoren wahrscheinlich in dem Experiment. Darüber hinaus können alternative Behandlungen theoretischen Eigenschaften dieser Daten ^15,17 offenbaren. Schließlich ist es nicht ungewöhnlich, dass einige Proteine, contain nativ exponierten hydrophoben Regionen zu hohen Hintergrundfluoreszenz zeigen. Es gibt eine Anzahl von Lösungen für diese Probleme, die an anderer Stelle ^6,9 bewertet wurden.

Insbesondere kann der Benutzer prüfen, ob ein an die Boltzmann-oder abgeleitete Modelle (beispielsweise 4), und im Fall der Verwendung von Derivaten, ob mehrere Schmelzen modelliert werden verwendet. Die beiden Methoden der Modellierung des thermischen Entfaltungs unterscheiden, dass die Boltzmann-Methode passt die experimentellen Daten an die Boltzmann-Gleichung, unter der Annahme einer regelmäßigen S-Form auf die Entfaltungskurve. Im Gegensatz dazu nimmt die Ableitung Verfahren der ersten Ableitung der experimentellen Daten an jedem Punkt (unten in Figur 1A), und hält die Schmelztemperatur der Punkt der höchsten ersten Ableitung sein. Das Derivat im allgemeinen Verfahren liefert eine höhere Schmelztemperatur um ca. 2 - 3 ° C beträgt. Die meisten Proteine ​​wird eine konsequentere RückErgebnis (dh niedriger ist der Standardfehler der Schmelztemperatur für Dreifachversuche) für eine der beiden Methoden. Dies ist normalerweise eng mit der präzisen Form des Proteins Entfaltungskurve bezogen, und es ist erforderlich, empirisch zu bestimmen, die beste Methode in jedem Fall. Wobei die Ableitung Modell verwendet wird, ist es auch wichtig, mehrere Schmelz Ereignisse zu berücksichtigen. Einige Daten zeigen deutlich Beweise für mehrere Übergänge, und in diesen Fällen sind die Ergebnisse wahrscheinlich einfacher zu interpretieren, wenn diese mehrere Schmelz Ereignissen modelliert. Im Rahmen dieses Protokolls ist es oft der Fall, dass die Zugabe des Liganden kann zu einem Protein von mit mehreren Schmelzübergänge zu einem einzigen Übergang ändern (zB durch Stabilisierung der meisten thermisch instabil Domäne) oder umgekehrt. Wir würden uns daher dafür ein, dass die Rohdaten zusammen vor der Prüfung, welcher Ansatz am besten zu nutzen sein wird, untersucht.

Nach der modelling der einzelnen Schmelztemperaturen können weitere Probleme bei der Anpassung dieser an die in dem Protokollabschnitt dargestellt Modelle ergeben. Es ist zwingend notwendig, sorgfältig zu prüfen, um die Passform der Dissoziationskonstante Gleichung einer logarithmischen Skala, wie diese Analyse oft betont Diskrepanzen zwischen den beobachteten Daten und dem Modell (e .B., Abbildung 3). Während die erhaltenen Ergebnisse sind in der Regel robust, Pflege in der Interpretation bietet die Möglichkeit, bessere Ergebnisse zu extrahieren, und die meisten Sinn, aus den Daten.

Ein besonderes Problem durch diese Daten erhoben ist die Interpretation, die auf Proteine, die Kooperativität zeigen oder mehrere Bindungsereignisse platziert werden soll, in DSF. Wir haben bis heute nur beobachtet, dieses Phänomen in Proteinen, die erwartet, mehrere spezifische Bindungsereignissen (zB WcbM, ein Protein, dessen beste Homolog ist ein Multimer ²⁶ und die als Multimer von Grßenausschlußchromatographie wirkt [Daten nicht sindgezeigt]). Es ist überhaupt nicht klar, dass die in DSF Denaturierung beobachteten negativen Kooperativität zeigt an, dass das Enzym wird letztlich zeigen negativer Kooperativität: eher, kann dies ein Hinweis auf komplexe Bindung, die mehr gründlich mit einem breiteren Spektrum von Methoden erforscht werden müssen. Dies läßt darauf schließen, uns jedoch, dass umfangreichere Studien solcher Proteine ​​wahrscheinlich, um interessante Effekte zu identifizieren.

Die für die Dissoziationskonstante dieser Methode bestimmten Werte sind in der Regel von der gleichen Größenordnung wie diejenigen, die durch andere Verfahren, wie beispielsweise isotherme Titrationskalorimetrie und Oberflächenplasmonresonanz ist. Jedoch sind die Absolutwerte beobachtet häufig höher als unter Verwendung dieser Verfahren beobachtet. Dies ist zumindest teilweise eine Folge der Tatsache, dass die Dissoziationskonstante wird bei der Schmelztemperatur des Proteins mit Liganden beobachtet. Diese K _d ist im allgemeinen höher als die bei physiologischen Temperaturen. Die dissociation konstant bezogen auf die Temperatur der Reaktion, die durch die Gleichungen:

[1]

[2]

(Wobei ^θ c ist die Standard-Referenzkonzentration, Δ _r G der Gibbs-Energie Veränderung der Reaktion ist, R die molare Gaskonstante ist, Δ H der Enthalpieänderung in dem Reaktions und Δ S die Entropie Änderung der Reaktions .)

Reaktionen mit Dissoziationskonstanten im messbaren Bereich dieses Verfahren im allgemeinen einen negativen Δ _r G, so dass die Wirkung einer Erhöhung der Temperatur auf die Gleichung [1] wird die Dissoziationskonstante zu erhöhen. Sowohl die Δ H und Δ S Begriffe, die Gibbs-Energie darstellen (Gleichung [2]) sind Temperature abhängigen ^27, und die Wirkung auf die Dissoziationskonstante wird von der Größe und dem Vorzeichen dieser Temperaturabhängigkeiten ab und wird notwendigerweise Interaktion abhängig ist. Folglich ist es nicht unerwartet, daß die nach diesem Verfahren ermittelte Dissoziationskonstanten sind manchmal größer als die Methoden, die bei Raumtemperatur betrieben werden bestimmt. Temperaturabhängigkeit ist natürlich auch eine Einschränkung der vielen anderen Verfahren, die dazu neigen, die Dissoziationskonstante bei Temperaturen unterhalb der physiologischen Temperatur bereitzustellen.

Weitere Einschränkung des DSF-Methode ist, daß es ein markiertes Verfahren, anders als ITC. Die Fluoreszenzmarkierung verwendet (SYPRO orange) ist hydrophob, und so in einigen Fällen mit der Bindung von Liganden an Proteine ​​hydrophobe konkurrieren können. Folglich ist es wahrscheinlich, dass in einigen Fällen die Dissoziationskonstante erhalten werden künstlich durch die Konkurrenz mit der Bezeichnung angehoben werden. Jedoch für den Vergleich von verschiedenen Liganden (die primäre Verwendung vonDSF), sind die Unterschiede kaum signifikant genug, um die Rangfolge von Verbindungen, die durch Affinität beeinträchtigt zu sein.

Ein möglicher Nachteil dieser Methode ist die Nachweisgrenze, die erreicht werden kann. Im Prinzip sollte es nicht möglich sein, einen Wert für K _d, die kleiner als 50% der Proteinkonzentration und sogar Werte in diesem Bereich wahrscheinlich von zweifelhafter Genauigkeit ist es genau zu messen. Während die Nachweisgrenze in diesem Ende des Bereichs kann ein wenig durch die Reduzierung der Konzentrationen von Protein und Farbstoff verlängert werden, wird die Empfindlichkeit des Instruments weitere Verringerung der Proteinkonzentration zu verhindern. In ähnlicher Weise wird das obere Ende der Empfindlichkeit durch die Löslichkeit des Liganden bestimmt werden. Eine mathematisch robuste Schätzung für K _d zu erhalten, ist es sehr wichtig, um Daten mit 90% der in den Liganden-gebundenen Form vorliegt Protein, das Ligandenkonzentrationen erfordert als ca.-Angaben zu erhaltenly zehnmal K _d (Annahme, dass keine Kooperativität). Die Nachweisgrenze wird daher notwendigerweise ein Zehntel der Löslichkeit des Liganden in der betreffenden Puffer sein. Dies bedeutet, daß die Nachweisgrenze der Methode liegt typischerweise im Bereich zwischen 1 um und zwischen 1 und 100 mm, abhängig von dem Protein und dem Liganden.

Zusammenfassend ist ein Differential-Scanning-Fluorimetrie vielseitige Technik für eine breite Palette von Proteinen. Verwendung der hier vorgestellten Verfahren ist es möglich, schnell und kostengünstig bestimmt die Affinität des Proteins für die verschiedenen Liganden. Dies hat ein großes Potenzial für die Anwendung in der Proteinreinigung und Stabilisierung, die Aufklärung der Funktion oder Spezifität von Enzymen aus Metagenomen, und in der Wirkstoffforschung, vor allem in kleinen Labors.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Das StepOne real time PCR-Instrument	Life Technologies	4376357	DSF kann mit vielen anderen Instrumenten durchgeführt werden. Das StepOne-Gerät verfügt über eine sehr komfortable Software für die Datenanalyse.
Software für die thermische Verschiebung von Proteinen v1.0	Life Technologies	4466037
MicroAmp Schnelle optische 48-Well-Platten	Life Technologies	4375816
Optisches Dichtband	Life Technologies	4375323	Bio-rad Art.-Nr. 223-9444 ist ein alternativer Lieferant
96-Well-Platten mit U-Boden	Fisher	11521943
SYPRO Orange	Life Technologies	S6650	Für einen Anbieter kleinerer Volumina verwenden Sie Sigma Teile-Nr. S5692
SPSS Statistik Version 20	IBM		Andere Statistikpakete bieten ähnliche Funktionen
GraphPad Prism 6.02	GraphPad		Andere Statistikpakete bieten eine ähnliche Funktionalität
Handapplikator (PA1)	3M	75-3454-4264-6
Hexokinase aus Saccharomyces cerevisiae	Sigma-Aldrich	H5000
Glukose	Fisher wissenschaftliche	10141520