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Kombination von Mikrostereolithographie und Elektrospinnen auf Membranen Ausgestattet mit Nischen für die Hornhautregeneration Produzieren

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DOI:

10.3791/51826

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12. September 2014

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1Department of Materials Science and Engineering, University of Sheffield, 2Department of Chemistry, University of Sheffield, 3L. V. Prasad Eye Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir berichten über ein Verfahren zur Herstellung von Mikrotaschen in elektro Membranen, bei denen auf das Zellverhalten zu untersuchen. Insbesondere beschreiben wir eine Kombination von Mikrostereo und Elektro zur Herstellung von PLGA (Poly (lactid-co-glycolid)) Hornhaut Biomaterial Geräten mit Mikromerkmalen ausgestattet.

Zusammenfassung

Hornhautprobleme betreffen Millionen von Menschen weltweit ihre Lebensqualität deutlich zu reduzieren. Hornhauterkrankungen kann durch Krankheiten wie Aniridia oder Steven-Johnson-Syndrom sowie von externen Faktoren wie Verätzungen oder Strahlung verursacht werden. Aktuelle Behandlungen sind (i) die Verwendung von Hornhauttransplantaten und (ii) die Verwendung von Stammzellen im Labor erweitert und auf Trägern (zum Beispiel Amnionmembran) geliefert wird; Diese Behandlungen sind relativ erfolgreich, aber leider sind sie nach 3-5 Jahren scheitern. Es besteht ein Bedarf zur Entwicklung und Herstellung neuer Hornhaut Biomaterial Geräte in der Lage, im Detail imitieren die physiologische Umgebung, in der Stammzellen befinden sich in der Hornhaut. Limbus-Stammzellen in den Limbus (Kreisfläche zwischen Hornhaut und Sklera) in Nischen als Palisaden Vogt bekannt ist. In dieser Arbeit haben wir eine neue Plattform-Technologie, die zwei modernste Fertigungstechniken (Mikrostereolithographie und electrospinn kombiniert entwickelting) für die Herstellung von Membranen, die Hornhaut in einem gewissen Ausmaß der Limbus imitieren. Unsere Membranen enthalten künstliche Mikrotaschen, die Zellen mit Schutz bieten als die Palisades von Vogt zu tun in die Augen zielen.

Einleitung

Die Hornhaut, dem zentralen avaskulären äußersten Gewebe des Auges, ist eine der wichtigsten Gewebe Vision 1 beteiligt. Es gibt verschiedene Arten von Zellen, die die Funktion der Hornhaut aufrechtzuerhalten. Die obere äußere Schicht der Hornhaut besteht aus Epithelzellen, die ungefähr 5-7 Schichten in der Dicke 2 sein kann. Diese Schicht verhindert das Eindringen von Bakterien in die Hornhaut 3 und ermöglicht Zutritt von Sauerstoff 4. Es wurde berichtet, dass die Stammzellen des Hornhautepithels liegen in Nischen oder Krypten (mit einer Größe von 120-150 um) am Randbereich der Hornhaut als Limbus 5,6 bekannt. Da die Stammzellen teilen, die Tochterzellen auch als vorübergehende Verstärkerzellen bekannt reisen aus den Nischen und als Divisions weiterhin die Zellen zentripetal nach innen und nach oben bewegen, was zu terminal differenzierten Zellen in der zentralen Hornhautbereich 7,8. Diese Zellen werden routinemäßig weg mit dem Blinzeln des Auges E abgewischtxposing neueren Zellen unter 9.

Zusätzlich dazu, dass die Lage der epithelialen Stammzellen spielt die Limbus auch eine Rolle bei der Beibehaltung der vaskularisierten Bindehaut von der Hornhautbereich 10. Schäden an den Limbus konnte durch thermische / chemische Verbrennungen, Strahlung und auch genetische Krankheiten 10 verursacht werden. Wenn dies geschieht, wird der Limbus Barriere nach unten so dass die Bindehautzellen auf die Hornhaut zu bewegen, Vaskularisierung der Region, was zu Schmerzen und Blindheit in einigen Fällen gebrochen. Der Zustand wird als Limbusstammzellinsuffizienzen (LSCD) 10 bekannt.

Verschiedene natürliche Substrate wie möglich Stammzellträger für die Unterstützung in der Hornhautregeneration berichtet. So wurden beispielsweise auf Kollagenbasis Membranen Dravida et al. 11 und Rama und Mitarbeiter 12 verwendet berichteten über die Verwendung von Fibrin in einer Studie mit 112 Patienten. Derzeit jedoch die am häufigsten verwendete Methode der Behandlungist die menschliche Eihaut aus einer Gewebebank und Kultur Limbus Epithelzellen an der Oberfläche 13,14 zu verwenden. Sobald eine Monoschicht gebildet hat, wird die Amnionmembran bis auf die beschädigte Hornhaut, die alle Bindehautzellen und Narbengewebe chirurgisch aus es vor diesem Zelltransplantation 14 entfernt hat geklebt Zell-Seite. Die Amnionmembran verschlechtert innerhalb von Wochen bis Monaten verlassen die Epithelzellen auf das entblößte Fläche angebracht, um das Epithel 15,16 regenerieren. Diese Technik wurde bei der Wiederherstellung Vision erfolgreich aber es gibt immer noch ein paar praktische Fragen, die seine weit verbreitete Aufnahme klinisch zu beschränken. Wie der Amnionmembran ist menschliches Gewebe es braucht, um zu unterziehen Screening mit gute Gewebebankverfahren, bevor sie für die Zelltransplantation bei Patienten eingesetzt. Dieses Screening senkt nur die Gefahr der Übertragung von Krankheiten, jedoch nicht vollständig beseitigen 17. Darüber hinaus gibt es Berichte von Variabilität in der performance der Amnionmembran durch inter Spender Variation 18,19 und 19,20 verschiedene Verarbeitungsmethoden. Neben dem kleinen Risiko der Krankheitsübertragung besteht die Forderung, für die OP-Zentren, um Zugriff auf gut geführte Gewebebanken, nicht für alle verfügbar zu haben.

Obwohl die Amnionmembran relativ erfolgreich ist, gibt es einen Bedarf für die Entwicklung von neuen synthetischen biologisch abbaubaren Zellträger Alternativen für die Behandlung von Hornhauterkrankungen. Synthetische Träger würde die Notwendigkeit für das Bankverfahren sowie die Beseitigung der kleinen Risiko der Krankheitsübertragung und Inter-Spender Variabilität zu überwinden. In diesem Sinne sind Materialien wie Polyethylenglykol 21,22 und 23,24 PLGA wurden untersucht.

Bei der Entwicklung eines synthetischen Alternative zu den menschlichen Eihaut gibt es auch die Möglichkeit, in sie wünschenswerte Eigenschaften zu entwerfen, um hoffentlich helfen, das Überleben der kultivierten Zellen. Die inclusion von Mikrostrukturen innerhalb Biomaterial Geräte für die gezielte Steuerung des Zellverhaltens ist ein aufstrebendes Gebiet von Interesse. Viele Autoren haben berichtet, Arbeit an der Entwicklung von künstlichen Stammzellen Nischen 25-30. Diese Gruppe hat kürzlich die Schaffung einer mikro PEGDA Fibronektin-biofunktionalisierte künstlichen Limbus zur Lieferung von Limbus-Epithelzellen 22 und eine Methode für die Herstellung elektro biologisch abbaubare Membranen, die mikrogefertigte Taschen für die Unterstützung der Limbus-Epithelzellen 31.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine neue Fertigungstechnologie für die Entwicklung von Geräten mit Mikrostruktur Biomaterial, das in einem Ausmaß, die Mikroumgebungen, in denen Stammzellen befinden sich im Körper nachahmen zu entwickeln. Wir haben eine Technik, die Mikrostereolithographie und Elektro kombiniert, die die Herstellung von biologisch abbaubaren mikrostrukturierte Membranen, die grea zeigen können entwickeltt Potenzial für die Geweberegeneration Anwendungen.

Es ist wichtig zu bemerken, dass, obwohl in dieser Arbeit hat sich diese Technik auf die Herstellung von Ringen für die Hornhautregeneration angewendet wurde, kann die Technologie auf die Herstellung von Vorrichtungen zur Regeneration von einer breiten Palette von epithelialen Geweben, beispielsweise Haut, oral angewendet werden, Schleimhaut, Darm, Atemwege, Blase und Epithelien. Insbesondere wird in dieser Studie haben wir eine synthetische biologisch abbaubare Membran, die in einer ähnlichen Weise zu der Amnionmembran wirkt, um Zellen der Hornhaut liefern entwickelt. Diese Membran enthält Mikrotaschen von rund 300 um (größer als die Limbus-Krypten der Pallisades von Vogt (ca. 150 um)). Schließlich haben wir eine Verpackung Protokoll, das diese Membranen bei -20 ° C für mehr als 6 Monate, ohne Anzeichen einer Störung gespeichert werden können etabliert.

Protokoll

Ethik-Erklärung: Die in dieser Studie verwendeten Augen wurden nach der Erklärung über die Offenheit für Tierforschung verwendet:

1. Herstellung von PLGA Biologisch abbaubare Membranen Ausgestattet mit Mikrotaschen

  1. Die Ring Gerüste wurden durch eine Kombination von Mikrostereolithographie und Elektrotechniken 31 erstellt. Im Wesentlichen kann der Prozess in 2 Teilen (i) Schaffung PEGDA Vorlagen von Mikrostereolithographie und (ii) das Elektro auf die Vorlagen für die Reproduktion des zugrunde liegenden PEGDA Struktur (in diesem Fall einer mikroRing) zusammengefaßt werden. Diese zwei Schritte werden im folgenden (1 und 2) beschrieben.
    1. Herstellung von PEGDA Vorlagen von Mikrostereolithographie (microSL)
      1. Herzustellen, die Ringe mit einem 2-Schicht-Modell, mit der ersten Schicht (L1) die Basis der Struktur und die zweite Schicht (L2) präsentieren 6 Mikrotaschen mit Hufeisen Morphologies in einer Reihe von Größen von 300 bis 500 um. Die Herstellung von PEGDA Ringe wurde vor kurzem von dieser Gruppe 22 beschrieben.
        1. L1 erstellen, indem eine 1,2 cm schwarzer Kreis unter Verwendung eines geeigneten Zeichenprogramm.
        2. Erstellen L2 in der gleichen Weise, aber sind 8 weiß 0,5 x 0,35 mm hufeisenförmigen Strukturen. Verteilen Sie die kleinen weißen Hufeisenform innerhalb der schwarzen Kreisstruktur.
        3. Speichern L1 und L2 im JPEG-Format.
      2. In einem dunklen Glasfläschchen, mischen Polyethylenglykoldiacrylat (PEGDA, Mn = 250 g / mol) mit 1% w / w Campherchinon, einem Photoinitiator, auf einem Magnetrührer für 20 min.
      3. Erweitern Sie den Laserstrahl des Mikrostereolithographie mit einem Teleskoplinsenanordnung Set-up und projizieren es auf einem Computer programmierbare digitale multimirror Gerät (UV-fähigen DMD-Starter-Kit). HINWEIS: Der DMD reflektiert das Bild (in diesem Fall ein Ring) auf einen Spiegel über eine 10 cm Brennweite Rohr-Objektiv. Das Bild wird dann durch das Silber-CoA gerichtetTed Spiegel in ein Fläschchen mit dem photohärtbaren Polymer (PEGDA).
      4. Einstellen und sorgfältig reinigen Sie die Optik des Mikrostereolithographie einrichten.
      5. Setz 300 ul der PEGDA Mischung in eine Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte. Sicherzustellen, dass die Vertiefungen mit Teflon oder einem anderen nicht-haftenden Material für die einfache Entfernung der Struktur nach dem Härten vorbeschichtet.
      6. Schalter auf dem blauen Laser (MBL-III 473 nm; 150 mW) und laden L1 in die ALP3-Basis-Software zuvor auf dem PC installiert ist. Bestrahlen der ersten Schicht während 60 Sekunden. HINWEIS: ALP3-basic ist eine USB-Schnittstelle, die die Verbindung zwischen dem PC und dem Digital Micromirror Device bietet.
      7. In den Brunnen 250 ul mehrere der PEGDA, laden L2 wie oben beschrieben zu bestrahlen L2 für 60 sek.
      8. Entfernen Sie die nicht ausgehärtete Polymer und waschen Sie den Ring mit Isopropanol O / N.
    2. Herstellung von biologisch abbaubaren PLGA-Membranen mit Elektro
      HINWEIS: Die PEGDA Ringe wurden als Template verwendets, über die PLGA wurde mit der Wiedergabe der PLGA zugrunde liegenden Topographie, wie es über diese Vorlagen gesponnen wird elektrostatisch. Nach dem Spinnen wurde die Folie von PLGA-Polymer von dem Kollektor abgezogen. Die endgültige PLGA Membran nicht die PEGDA Ringen gelassen wurden, um die metallische Kollektor gebunden sind, enthalten.
      1. Verteilen der PEGDA Ringe auf einem galvaniAluminiumBlech (12 cm x 20 cm) zur Erzeugung eines statischen Elektro Sammler.
      2. Bringen Sie die Ringe mit leitfähigen Kohlenstoffband. ANMERKUNG: Diese Ringe einmal gebildet ist, kann als Matrize für Elektrowiederverwendet werden.
      3. Bereiten Sie die Polymerlösung für die Spinnerei. Auflösen PLGA (50:50 DL-Lactid (52 Mol%): Glycolid (48 mol%), 44 kg / mol) in Dichlormethan (DCM) bei 20% w / w-Konzentration.
      4. Stir O / N vor dem Gebrauch.
      5. Platz 4 Insulinspritzen (mit stumpfen Enden, 0,8 cm Innendurchmesser Nadeln) auf eine Spritzenpumpe. HINWEIS: Vier Spritzen gewährleistet schnellere Elektro als die Arbeit mit einer einzigen Spritze.
      6. Laden Sie 2,5 ml PLGA-Lösung in jedem Spritze.
      7. Elektrospinnen mit 30 ml / min Volumenstrom und Spannungen von 12 bis 15 kV. Lassen einen Abstand zwischen den Nadeln und dem Kollektor 15 cm.
      8. Elektrospinnen für 1 Stunde und 30 Minuten und schließlich vorsichtig schälen PLGA elektroBlatt vom Kollektor Unterstützung der PEGDA Ringen.
      9. Schneiden Sie die elektro Gerüste in 22 mm Durchmesser Kreise mit einem kreisrunden Loch Punch und Verlassen der Ringstruktur in der Mitte positioniert.

2. Langzeitspeicherung von PLGA Mikrofabrizierte Membranen

Hinweis: Die PLGA Ringe wurden hergestellt und von akkreditierten externen Unternehmen sterilisiert; Proben wurden bei einer externen Dosisbereich von 25-40 kGy bestrahlt.

  1. Montieren Sie die Membran in einem kleinen Behälter (Kunststoff-Petrischale) und legen Sie sie in einer Klasse Tasche medizinisch.
  2. Filterpapier verwenden, um kleine Filtertüten für die Trockenmittel erstellen. To Schaffung der Taschen, klappen Sie den Papierfilter (125 mm Durchmesser) und schneiden Sie die resultierende Halbkreis in der Mitte; versiegeln Sie die Enden zusammen mit Klebeband.
    1. Füllen drei Filterpapierbeutel mit 1 g Kieselsäure orange, Kobalt (II) chlorid und Kupfer (II)-Sulfat sind.
    2. Setzen Sie die drei Beutel Trocknungsmittel in der Klasse Tasche zusammen mit dem medizinischen elektro Membran.
  3. In die Tasche einen handelsüblichen sechs Spot Feuchtigkeitsindikator Karte, um jede Ansammlung von Feuchtigkeit während der Lagerzeit zu erkennen.
  4. Verwenden Sie ein Vakuum-Wärmesiegelmaschine Vakuum und den Beutel.
  5. Senden Sie die Ringmembranen an ein externes Unternehmen für γ-Bestrahlung.
  6. Speicher γ-bestrahlt PLGA Membranen in einem weiten Temperaturbereich von -20 ° C bis +37 ° C in einer feuchten Umgebung in einem Inkubator mit 5% CO 2.
  7. Post Lagerung, Prüfung der Feuchtigkeitsanzeiger, um zu bestätigen, dass die Höhe der Luftfeuchtigkeit ist unter 30%.
  8. USE Rasterelektronenmikroskopie (SEM), um die Faserintegrität zu bewerten.

3. Isolierung Limbale Explantate

Kaninchen Limbus Explantate wurden von Kaninchenaugen (von einem Bauernhof, wo Kaninchen werden für den Verzehr gezüchtet werden) isoliert.

  1. Desinfizieren Sie die Kaninchenaugen mit antiseptischen Lösung (3%).
  2. Die Augen zu reinigen, indem Sie alle rund um die Hornhaut überschüssiges Gewebe.
  3. Trenne die Limbus-Bereich (als dünne Kreisfläche zwischen der Hornhaut (transparent) und die Sklera (weiß) bezeichnet) von dem Rest der Hornhaut mit einem Präpariermikroskop.
  4. In Segmente (ca. 1,5 cm lang) unter der Dissektionsmikroskop geschnitten.
  5. Desinfizieren Sie die Limbus-Segmente in 1,5% antiseptischen Lösung für 1 min.
  6. Schneiden Sie die Limbus-Segmente in kleine Stücke (100-500 um) mit einer Skalpellklinge.
  7. Speichern die kleine Stücke von Gewebe in Kulturmedium (DMEM + Glutamax: Ham's F12 (1: 1), 10% fötales Rinderserum, 1 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin, 2,5 ug / ml Amphotericin, 10 ng / ml EGF und 5 ug / ml Insulin) bei 37 ° C und 5% CO 2 bis zur Verwendung (nicht mehr als 60 min).

4. Auswachsen von Zellen aus Limbale Explantate

Kaninchen Limbus-Explantate wurden auf beiden frisch gesponnenen mikrogefertigten Membranen und Membranen, die vakuumverpackt und für 6 Monate bei -20 ° C gelagert waren gegeben.

  1. Beschichten der Ringgerüste mit 15 ul Fibrinkleber (1: 1-Mischung von Fibrinogen aus humanem Plasma in einer Konzentration von 18,75 mg / ml und Thrombin aus Humanplasma in einer Konzentration von 2,5 U / ml) mit einem Zellschaber zum Verteilen des Fibrins gleichmäßig.
  2. Legen Sie die Gewebeexplantaten direkt auf den PLGA Mikrotaschen mit einer 25 G-Nadel und ein Binokular.
  3. Fügen Zellkulturmedien sehr vorsichtig, um das Lösen der Explantate.
    1. Medien ändern alle 3 Tage (in Abschnitt 3.7 beschriebenen Medien Rezept) und kEEP in der Kultur für 2 Wochen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
  4. Befestigen Sie die Proben mit 3,7% gepuffertem Formaldehyd für 10 min, gefolgt von 3 Waschschritten mit PBS.
  5. Durch Inkubation in 1 ug / ml 4 'gegenfärben, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) oder Propidiumiodid (PI) für 10 min bei RT.
  6. 3 mal waschen in PBS und die Proben mit Folie abgedeckt speichern.
  7. Bild die Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop bei Wellenlängen von 543 nm und 800 nm (Zwei-Photonen).

5. Einrichten Kaninchen Wounded Cornea 3D-Modelle

  1. Reinigen und desinfizieren Sie die Kaninchenaugen wie oben beschrieben.
  2. Umsponnen die Kaninchenaugen durch Eintauchen in 0,14% Ammoniumhydroxid für 5 min.
  3. Die Augen spülen in PBS und abkratzen das Epithel mit einem Sklerotom Messer.
  4. Schneiden und zu isolieren, die Hornhaut-Lederhaut Schaltfläche Entfernen von Restgewebe.
  5. Legen Sie die Hornhaut epithelialen Seite nach unten aufeine sterile Becher füllen und mit 0,5% Agar in DMEM gemacht.
  6. Einmal eingestellt, legte die Hornhäute epithelialen Seite nach oben in kleinen Petrischalen und fügen Kulturmedien (wie oben beschrieben Rezept) bis zum Limbus-Bereich. HINWEIS: Decken Sie das ganze Hornhaut; halten die Orgelkultur an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche.

6. Isolierung von Limbale Explantate und Integration von Ring Gerüste in der Kaninchenhornhaut 3D-Modelle

  1. Beschichten der Ringmembranen mit 15 ul Fibrinkleber (1: 1-Mischung von Fibrinogen in einer Konzentration von 18,75 mg / ml und Thrombin in einer Konzentration von 2,5 U / ml) .Use einem Zellschaber, wie oben beschrieben.
  2. Legen Sie die Gewebeexplantaten direkt auf den PLGA Mikrotaschen mit einer 25 G-Nadel und ein Binokular.
  3. Legen Sie die Ringe mit den Gewebe Explantate auf den entblößten Hornhäute mit den Explantaten nach oben und an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche Bedingungen. (Diese Bedingungen sind zuvor beschrieben worden 22).
  4. Pflegen Sie die Organkultur-Modellen für4 Wochen einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 Wechsel der Medien alle 2 Tage.

7. Bewertung der Hornhaut-Regeneration und Stammzell Wartung

  1. Nach 4 Wochen fixieren die Hornhaut mit 3,7% Formaldehyd.
  2. Verarbeiten die Hornhäute für konventionelle Histologie bis 6 um Paraffinschnitten zu produzieren.
  3. Fleck mit Hämatoxylin und Eosin (H & E).
  4. Für Immunzytochemie, Entwachsen die Abschnitte in Xylol (3 min) und rehydratisieren in 100% Ethanol (1 min), 70% Ethanol (1 min) und destilliertem Wasser (2 min).
  5. Abgrenzung der Abschnitte mit einem Dako Stift, um kleine Bereiche begrenzen und vermeiden übermäßige Verwendung von Antikörper.
    1. Behandeln das abgegrenzte Bereiche mit 0,05% Trypsin (100 ul) für 20 min (37 ° C).
  6. Gründlich mit PBS und 100 l 10% Ziegenserum (Blockierung) für 1 Stunde.
  7. Die Proben mit 100 ul des monoklonalen Maus-Antikörpers cytokera inkubierenZinn 3 (CK3) und 100 ul von p63 in 1% Ziegenserum O / N bei 4 ° C ist.
  8. Waschen mit PBS und Behandlung mit 100 ul biotinylierten sekundären anti-Maus-Antikörper (1: 1000 in 1% Ziegenserum) 1 h bei RT.
  9. 100 ul FITC-Streptavidin (1: 100 in 1% Ziegenserum) für 30 min bei RT.
  10. Behandlung der Proben mit DAPI, wie oben beschrieben.
  11. Bild die Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop bei Wellenlängen von 800 nm (Zwei-Photonen-) und 488 nm auf.

Ergebnisse

Elektromikrogefertigt Ringe wurden unter Verwendung einer Kombination aus Mikrostereo und Elektro (1 und 2) hergestellt. PEGDA Ringe verschiedener Größen wurden mit Mikrostereo (3) hergestellt ist; Diese Technik ermöglicht die Herstellung Strukturen in der Größenordnung von cm und der gleichzeitigen Aufnahme von Mikrostrukturen. In diesem Fall Ringe mit Durchmessern im Bereich von 1,2 bis 1,6 cm, enthaltend Mikrotaschen von 350-500 um wurden hergestellt (Figur 4).

In Bezug auf Herstellung, Sterilisation und Verpackung von Materialien für zukünftige klinische Anwendung wurde gefunden, daß die Vakuumverpackung in medizinischer Qualität Taschen signifikant verbessert die Fähigkeit zur Langzeitlagerung von PLGA Membranen (5) zu erreichen; die Verwendung von einem medizinischen Beutel (PET / Folien / LDPE) mit einer Dicke von 0,12 mm erlaubt es uns, eine längere Haltbarkeit erreichen. Dies wurde durch das Senden membr suchtane für unsere Helfer in Indien und Membranen wurden über einen Zeitraum von Monaten bei -20 ° C bei Raumtemperatur und bei 37 ° C in feuchter Umgebung gezielt (a feuchten Inkubator) gespeichert. Figur 5 zeigt, daß mit den absichtlich provozierenden Lagerbedingungen bei 37 ° C unter feuchten Bedingungen wurden die Membranen nur stabil nach ca. 1 Monat unter Nicht-Vakuum-Bedingungen verpackt, aber 3 erreicht Monaten Lagerung unter Vakuum verpackt Bedingungen (Figur 5 und Tabelle 1).

Tabelle 1 zeigt die Verbesserung der Lagerbedingungen, die auch unter den Bedingungen ausgewählt förderlich für die Wasseraufnahme und Quellung Faser, wenn man darauf achtet, Wahl der Tasche verwendet werden erzielt werden kann.

Die Ringe unterstützt Zellauswuchs von Limbus Explantate in verschiedenen Bedingungen (i) Ringe frisch zubereitet und (ii) Ringe für 6 Monate (6) gespeichert. Nach 4 Wochen wurde der Zellübertragung erreicht, wenn placing die PLGA-Membranen auf 3D-Modelle verwundet. Zellen wuchsen aus den Gewebe-Explantate auf den Membranen der Erstellung eines neuen Epithel auf den zuvor freigelegten Hornhaut (7) angeordnet ist. Positiv (Hornhaut ohne Behandlung) und Negativkontrollen (Hornhaut verletzt) ​​wurden ebenfalls in der Kultur für die gleichen Zeiträume aufrechterhalten. Die negativen Kontrollen bestätigten das Fehlen der Bildung von neuem Epithel in Abwesenheit von jeglichen zugefügten Zellen. Immunzytochemie gezeigt, dass die Zellen aus wachsen aus den Explantaten waren Hornhaut-Epithelzellen, da sie positiv für die Hornhaut-Differenzierungsmarker CK3 (7E) waren.

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Abbildung 1. Schematische Darstellung der Mikrostereolithographie Einrichtung für die Erstellung von PEGDA Ringen.

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Abbildung 2. Schematische Darstellung des Elektrospinnverfahren mit PEGDA mikrofabriziert Ringe als Vorlagen.

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Figur 3 (A) zeigt ein Beispiel einer statischen Kollektor (elektroplattierten Aluminiumblech mit PEGDA Ringe) zum Spinnen von mikrogefertigten PLGA Membranen. (B) und (E) zeigen verschiedene elektro Matten aus statischen Kollektoren abgezogen. (C) PEGDA Vorlagen unterschiedlicher Größen Hervorhebung der Vielseitigkeit der Verwendung von Mikrostereolithographie zur Herstellung der darunter liegenden Oberfläche. (D) zeigt ein PLGA mikrogefertigt Replik./files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4. REM-Aufnahme einer PEGDA Ring mit einem Hufeisen Mikrostruktur (A); hoher Vergrößerung REM-Aufnahme einer mikro Tasche (B). Phasenkontrastbild eines PLGA-Ring mit einem Hufeisen Mikrostruktur (C); hoher Vergrößerung Phasenkontrastbild einer mikro Tasche (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5: Einfluß der Temperatur und der Zeit der Lagerung von Vakuum und ohne Vakuum verpackt PLGA (50:50) Membranen (44 kg / mol) mit mikro-gefertigte Ringe über 6 Monate. Membranintegrität wurde als vollständig intakt Fasern erzielt (+++), einige Faserquellungs- (++), Faserzusammenführen (+) oder keine intakten Fasern (-). REM-Aufnahmen und drei Trockenmittel (Silica orange, Kobalt (II) chlorid und Kupfer (II)-Sulfat) zeigen keine Veränderungen in der Faserintegrität oder Feuchtigkeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 6 zeigt Fluoreszenzbilder Auswuchs der LEC von Limbus-Explantate auf frisch zubereitete biologisch abbaubare PLGA Ringe (A, B) und an den Ringen nach 6 Monaten Lagerung bei -20° C (C, D). Bilder (A) und (B) entsprechen, um Zellen mit DAPI (blau) und Propidiumiodid (rot) angefärbt. Bild B ist eine orthogonale Ansicht eines konfokalen z-Stapel von einem Explantat auf einer mikro Tasche platziert. Bilder (C) und (D) zeigen eine positive Färbung für p63 (grün). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 7 (A) zeigt ein Kaninchen verwundet Hornhaut-Modell mit einem Ring-Gerüst und Gewebeexplantaten auf dem Schafott, die zuvor mit Fibrinkleber beschichtet wurde entfernt (B) und (C) sind positive und negative Kontrollen. Die positive Kontrolle ist eine frische Rabbiner . t Hornhaut und die negative Kontrolle eine Hornhaut, wo das Epithel wurde absichtlich entfernt (die negative Kontrolle wurde ebenfalls für 4 Wochen kultiviert) (D) ist eine H & E-Bild einer Hornhaut Gewebezüchtung nach 4 Wochen in Kultur; Die Abbildung zeigt die neue vielschichtige Epithel von den Zellen, die sich aus den Explantaten auf den Nischen platziert gebildet (E) ist ein Bild, das zeigt Immunzytochemie Zellauswuchs von einem Limbus Explantation. Kerne sind mit DAPI (blau) gefärbt und die Zellen zeigt eine positive Färbung für Zytokeratin 3, eine Hornhautdifferenzierungsmarker (grün). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

PLGA (50:50)
Tag 0 1 Monat Monat 2 Monat 3 Monat 4 Monat 5 Monat 6
Nicht-Vakuumverpackt +++ - - - - - -
Abgesaugt (Bag A) (PE, PA Composite) Stärke: 0,14 mm +++ + - - - -
Abgesaugt (Bag B) (PET / Folie / LDPE) Stärke: 0,75 mm +++ +++ +++ + - - -
x; "> Faserintegrität für Membranen bei 37 ° C feucht gelagert 64px; "> -

Tabelle 1. Wirkung von Vakuum und verschiedenen Speicher Taschen Integrität von PLGA (50:50)-Membranen (44 kg / mol) untersucht mehr als 6 Monaten Lagerung. Membranintegrität wurde als voll intakt Fasern (+++), einige Faserquellung erzielt (++), Faserzusammen (+) oder keine intakten Fasern (-).

Diskussion

Diese Studie beschreibt (a) ein Verfahren zur Herstellung elektro Membranen, Mikroformen in ihnen und (b), wie solche Membranen für die klinische Verwendung von Vakuumverpackung, Gamma-Bestrahlung und Lagerung vor der Verwendung herzustellen. In dieser speziellen Anwendung haben wir PLGA-Membranen, die Mikrotaschen, die die physikalischen Eigenschaften der Limbus-Stammzellnischen nachahmen entwickelt. Die Ziele dieser Studie sind (i) die Methoden beschreiben, um dem Leser das notwendige Wissen, um in dem Beitrag der Stammzellnischen, Geweberegeneration und (ii) den Leser mit einem besseren Verständnis entwickeln und fertigen Gerüste enthält Mikroformen für die Forschung , wie elektro Gerüste für lange Zeiträume zu speichern.

In Bezug auf die klinische Anwendung, ist von größter Bedeutung, die die Speicherung der Ringmembranen. In dieser Arbeit wurde die Verschlechterung der Ring über einen Zeitraum von 6 Monaten untersucht. Abbau desMembranen wird durch Hydrolyse von einfach halten die Membranen frei von Feuchtigkeit wird der Prozess gestoppt angetrieben, so. Blackwood et al. Berichtet, dass durch Variation des Verhältnisses von PLA zu PGA, die Verschlechterung der Membran ändert 32. Diese Untersuchung zeigte auch, dass durch die Erhöhung der Menge des PGA, die Abbaurate der elektro Membranen in vivo 22 erhöht. Hier hat es sich gezeigt, dass mit Vakuumverpackung die Membranen zusammen mit etwas Trockenmittel und Bestrahlen und speichert sie bei niedrigen Temperaturen für 6 Monate, gibt es keine Änderung in der Faserintegrität und Abbau. Derzeit beträgt 6 Monate so weit wie wir mit diesen Membranen, die Mikrotaschen aber Speicherdaten für 1 Jahr auf Normalelektro Membranen bei -20 ° C 22 gemeldet und wir haben jetzt unveröffentlichte Daten für ihre Lagerung bei -20 ° C untersucht für 2 Jahre ohne irgendwelche Anzeichen von Zersetzung. So zur Langzeitlagerung, es wäre empfehlenswert, um sie trocken bei -20 speichern6, C, aber es ist möglich, sie bei Raumtemperatur lagern, auch in Indien für mindestens 6 Monate (möglicherweise viel länger). Die Einbeziehung einer Feuchtigkeitsindikator gibt eine einfache Kontrollmöglichkeit, dass die Verpackung Membranen trocken in diesem Fall werden sie fit für den Zweck sein gehalten.

Übertragung von Zellen, die aus diesen Ringen um 3D-Modelle Hornhaut wurde bei der Platzierung in den Limbus Explantate Mikrotaschen gezeigt. Diese Gruppe berichtete kürzlich Übertragung von Zellen auf einem in vitro-Modell Kaninchenhornhaut, indem Explantate auf Normal PLGA-Membranen (Membranen ohne Ringstrukturen) 24. Mit Hilfe der vorliegenden mikro Gerüste Zelltransfer wurde einen Schritt weiter als wir jetzt gezielt zu lokalisieren Gewebeexplantaten innerhalb der Mikrostrukturen. Die Fähigkeit, die Explantate direkt in den Nischen Ort ermöglicht es dem Chirurgen, die Membranen direkt in den Operationssaal Vermeidung der Notwendigkeit eines Reinraums zum ersten erweitern die Limbus-Stammzellen zu verwenden. Obwohl dieses Stück work hat sich auf die Entwicklung von Geräten für die Hornhauterkrankung konzentriert, kann dieser Mikrotechnik auch für die Entwicklung von Geräten für viele andere Anwendungen angewandt werden. Zukünftige Arbeit wird die Herstellung von Konstrukten, die für die Regeneration anderer Gewebe, wie Haut und Knochen zu erkunden.

Während der anfänglichen Konstruktion und Fertigung der Mikrostrukturen PEGDA kann zeitaufwendig sein, einmal hergestellt, können die Strukturen oft ohne Abbau verwendet werden. Bei der späteren Herstellung von PLGA mikro biologisch abbaubaren Membranen durch Elektrospinnen bei einer vergleichbaren Geschwindigkeit zu der Herstellung von einfachen (unstrukturierten)-Membranen nach der Montage des Kollektors durchgeführt werden. Obwohl in dieser Arbeit haben wir Mikrostereolithographie zur Herstellung der Formen verwendet, können andere Herstellungsverfahren wie beispielsweise 3D-Drucken oder Spritzen verwendet werden. Dementsprechend ist die zugrunde liegende Form könnte von anderen Polymeren oder Metallen anstelle von PE werdenGDA. Als solche ist diese Technik sehr vielseitig und können die Forscher einfach die Methode, um ihre eigenen Bedürfnisse und Einrichtungen entsprechen anzupassen.

Das hauseigene Mikrostereolithographie Set-up in dieser Studie verwendet wird nicht zulassen, die Herstellung von Konstrukten mit Funktionen unter 30 um; Dies ist keine Einschränkung für die hier beschriebene Anwendung Hornhaut aber entscheidend bei der Gestaltung von anderen Modellen sein können. In diesem Fall andere Techniken wie 2 Photonen-Polymerisation (2PP) könnte von Interesse sein, aber die Elektro Technik möglicherweise nicht die Wiedergabe von Strukturen auf der Sub-Mikron-Skala erlauben (dies wird derzeit von unserer Gruppe untersucht).

Kritischen Schritte in dem Herstellungsverfahren (i) Vermeidung des Überhärtung der PEGDA Vorlagen, die durch die Anpassung der Zeit und Menge an Photoinitiator gesteuert werden kann. (Ii) Steuerung der Elektrospinnbedingungen, wie Temperatur und Feuchtigkeit. (Iii) Speicherung entsprechend den electrospun Ring Membranen unter Verwendung von Vakuum-Verpackung und Trockenmittel.

Zusammenfassend indem Limbus Gewebeexplantaten innerhalb der Mikromerkmale der Membran haben wir Zellauswuchs aus den Explantaten auf der Nischen, Zellübertragung auf einem Kaninchenhornhaut verletzt und anschließende Reepithelisierung der Hornhaut gezeigt. Der Abbau der bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert Membranen wurde untersucht und ein Verpackungsprotokoll, das langfristige Lagerung von Membranen ermöglicht wurde entwickelt, wobei letztere weiter zu entwickeln Membranen für die klinische Verwendung ist.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir danken für die Finanzierung durch den Wellcome Trust Affordable Healthcare for India und ein EPSRC Landscape Fellowship für Ilida Ortega sowie für Beiträge von The Electrospinning Company Ltd.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Poly (Milchsäure-co-Glykolsäure)PuracPDLG5004
DichlormethanSigma Aldrich Or Fisher270997 Or D/1850/17>99,8% enthält 50-150 ppm Amylen-Stabilisator
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter KitTexas Instruments1076N732 (UV)
473 nm LaserLaser 2000MBL-III150 mW
Poly (Ethylenglykol) DiacrylatSigma Aldrich475629Mn = 250 g/mol, 500 ml
DEMEM + GlutamaxFisher12077549
Schinken' s F12Labtech bioseraLMH1236/500
Fötales RinderserumLabtech bioseriaFB-1090/50
EGFR& D236-EG-200
InsulinSigma Aldrich91077C-1G
AmphotericinSigma AldrichA2942-100ml
Penicillin/StreptomycinSigma AldrichP0781-100ml
DAPISigma Aldrich32670
PropidiumiodidSigma AldrichP4864
ThrombinSigma AldrichT9326
FibrinogenSigma AldrichF3879
p63Sigma AldrichP3737
CK3Merck MilliporeCLB218
HämatoxylinSLSHHS16-500ML
EosinSigma AldrichHT110232-1L
Medizinischer Beutel (PET/Folie/LDPE) Abziehbarer BeutelRiverside Medical Ltd. Derby, UKFolienlaminat PET/Folie/LDPE, (12,7,50)
Gammabestrahlung (Sterilisation)Angewandte Sterilisationstechnologien (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - externer Dosisbereich von 25-40 KGy
Kieselgel orangeSigma Aldrich10087
Kobalt(II)-chloridSigma Aldrich232696
Kupfer (II)-sulfatSigma-AldrichC-1297
Sechspunkt-FeuchtigkeitsanzeigekarteSCC, USA6HIC200
Vakuum-HeißsiegelmaschineAndrew James UK Ltd, Bowburn, UKVS518
Andrew James Vakuumierwalzen 28 cm x 40 Meter RollenAndrew James UK Ltd, Bowburn, GroßbritannienBR2805
Rasterelektronenmikroskop (REM)Philips/FEI XL-20 Konfokales REM-Mikroskop
Zeiss LSM 510 META
Videne Antiseptische LösungEcolab, Swindon, Großbritannien3%

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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