Workflow für Hoch Inhalt, einzelne Zell Quantifizierung der Fluoreszenzmarker von Universal Mikroskop Daten, Unterstützung von Open Source Software

Summary

Dargestellt ist eine flexible Informatik Workflow ermöglicht Multiplex bildbasierte Analyse fluoreszenzmarkierten Zellen. Der Workflow quantifiziert nukleäre und zytoplasmatische Marker und berechnet Marker Translokation zwischen diesen Fächern. Verfahren für Störung von Zellen mit siRNA und zuverlässige Methode zur Markerdetektion durch indirekte Immunfluoreszenz in 96-Well-Formaten zur Verfügung gestellt.

Abstract

Fortschritte im Verständnis der Kontrollmechanismen, die das Verhalten von Zellen in adhärenten Säugetierzellkultur-Modelle werden zunehmend abhängig von Arten der Einzelzellanalyse. Methoden, die zusammengesetzten Daten, die die mittleren Werte der Biomarker von Zellpopulationen liefern riskieren Subpopulation Dynamik, die die Heterogenität der untersuchten biologischen System zu reflektieren. In diesem Sinne werden die traditionellen Ansätze ersetzt, oder, komplexere Formen der zellulären Assay basiert auf der Beurteilung durch High-Content-Mikroskopie erlauben unterstützt. Diese Assays potenziell für eine große Anzahl von Bildern von fluoreszierenden Biomarkern, die von proprietären Softwarepakete begleitenden aktiviert, ermöglicht die Mehrparametermessungen pro Zelle. Jedoch haben die relativ hohe Kapitalkosten und overspecialization vieler dieser Vorrichtungen ihrer Zugänglichkeit für viele Forscher verhindert.

Beschrieben wird hier einuniversell einsetzbare Arbeitsablauf für die Quantifizierung von multiplen Fluoreszenzmarker Intensitäten von spezifischen subzellulären Regionen einzelner Zellen, die zur Verwendung mit Bildern von den meisten Fluoreszenzmikroskope. Der Schlüssel zu diesem Workflow ist die Umsetzung des frei verfügbaren Zell Profiler Software ^ein, um einzelne Zellen in diesen Bildern, Segment sie in definierten subzellulären Regionen unterscheiden und liefern Fluoreszenzmarker Intensitätswerte spezifisch für diesen Regionen. Die Extraktion einzelner Zellintensitätswerte von Bilddaten ist das zentrale Ziel dieser Arbeitsablauf und wird mit der Analyse der Steuerdaten von einer siRNA-Bildschirm für G1-Checkpoint Regulatoren in adhärenten menschlichen Zellen veranschaulicht. Jedoch kann der Workflow hier dargestellt, um die Analyse von Daten von anderen mittels Zellstörung angewendet werden (beispielsweise Verbindung Bildschirmen) und andere Formen der Fluoreszenz zelluläre Marker und sollten somit für einen weiten Bereich von Labors.

Introduction

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Verwendung der frei verfügbaren Software-Zelle Profiler Algorithmus geführte Abbau von Fluoreszenzmikroskopische Bilder von anhaftenden Zellen, einzelne Zellen und definiert subzellulären Regionen zu identifizieren durchzuführen. Dieser Ansatz, der als Bildaufteilung bezeichnet, erlaubt die anschließende Mehrparameter-Analyse der abgebildeten Zellen durch Quantifizierung fluoreszenzmarkierten Markern in jede Zelle oder subzellulären Bereich (bezeichnet als segmentierten Objekten) lokalisiert. Dieser Workflow stellt eine Grundlage für ermöglicht High-Content-Analyse und soll als Werkzeug, das weiter ausgebaut werden kann und geändert werden, um Multi-parametrischen anpassen, einzelne Zellanalysen im Labor, ohne Zugang zu spezialisierten High-Content-Instrumenten oder proprietäre Software dienen. Die mit diesem Manuskript geliefert Dateien enthalten ein Testset relevanter Rohbilddaten, Algorithmus-Einstellungen und die Unterstützung Skripte, um die beschriebene Analyse zu generieren. Die zur Verfügung gestellten Algorithmus Einstellungen foder Zell Profiler sind für die Beispieldatensatz und der Diskussion Abschnitt Details, welche Anpassungen notwendig sein, um den Einsatz von Bilddaten aus anderen Studien ermöglichen optimiert.

Sobald quantitativen Daten wurde mit Zell Profiler extrahiert, kann verschiedenen Labors unterschiedliche Anforderungen an, wie man das von den einzelnen Zellwerten im Rohdaten dargebotener Informationen haben; hier dargestellt ist ein Ansatz, mit dem Gatter werden auf die Rohdaten für jeden Assay verwendet. Verwendung dieser Gatter werden die Daten in binäre Bezug Reaktion umgewandelt, so dass die Visualisierung des Trends Verknüpfung verschiedener Behandlungen mit den Subpopulationen von Zellen, die eine Antwort durch den Gates definiert. Die Tore sind auf Beobachtungen der für die entsprechende negative und positive Kontrollen erhalten für jeden relevanten Messdaten Verteilungen eingestellt. Die Verwendung von Toren ist nur ein Beispiel dafür, wie man die rohe, zellbasierten Messungen fort. Auch hier dargestellt ist die Verwendung von Kern-DNA Intensität michasurements in ihrer Rohform als kontinuierlicher Wertebereich in Kombination mit den gated Daten. Andere Ansätze zur Verwaltung von Bildanalysedaten in Betracht gezogen werden, je nach der Art der Studie; statistische Alternativen zur Verwendung von Toren für die Zuordnung von Zellen, um Subpopulationen wurden berichtet ² und systematische Vergleiche von Strategien, um High-Content-Daten zusammenzufassen über eine große Anzahl von Parametern berichtet worden ^3.

High-Content-Analyse von Bilddaten haben den Einsatz in Zellstudien von Medikamenten-Reaktion gefunden, reverse Genetik und Umweltbelastung Signal ^4-6. Das Verdienst des Hochinhaltsanalyse beruht auf der Tatsache, dass algorithmische Analyse von Fluoreszenzmikroskopie Daten erlaubt die quantitative und räumliche Parameter gleichzeitig in einzelnen Zellen ⁷ betrachtet werden. Auf diese Weise können Zellergebnisse für mehrere Assays mit Querverweisen, Differentialverhalten Assay-d sein,efined Zell-Subpopulationen innerhalb Versuchsbedingungen und Assays verfolgt werden können Berücksichtigung der morphologischen Variablen umfassen. Die Strategien und Analyseablauf hier diskutiert, wie für die anderen High-Content-Ansätze sind in der Lage Liefern gemultiplexter Daten, die sich auf einzelne Zellen mit Querverweisen. High-Content-Methoden Anzug Studien, die Fluoreszenz-Mikroskop Bilder zu erzeugen und sind bis in die Tausende von Bildern für die Analyse von Daten, die von Zehn Bilder in geringem Durchsatz herkömmlicher Fluoreszenzbasis Mikroskopie erzeugt mit automatisierten High-Content-Screening-Plattformen produziert.

Der Workflow wird hier mit Beispieldaten aus dem separaten Assays werden in Bezug auf die beiden Kernfluoreszenzmarker Intensitäten oder nuklearen / cytoplasmatischen Translokation eines fluoreszierenden Reporterproteins, gemessen dargestellt. Der Arbeitsablauf ist flexibel, da diese Tests können einzeln oder in Kombination betrachtet, je nach eac werdenh Fragestellung gegeben von verschiedenen Forschern. Die Beispieldaten sind als Teil einer RNA-Interferenz (RNAi) Experiment (1) hergestellt. Kleine interferierende RNA-Oligonukleotide (siRNA) werden verwendet, um bestimmte Proteine ​​in HCT116 menschlichen colorektalen Karzinomzellen, die in Änderungen für zwei fluoreszierenden Reportern von Cyclin-abhängigen Kinase (CDK) Aktivität führen Knockdown. Die CDK6-abhängige Phosphorylierung des Kern Retinoblastomprotein an Serin 780 (P-S780 RB1) durch Antikörper-Färbung beurteilt. In den gleichen Zellen wird ein grün fluoreszierendes Protein-markierten Reporter von CDK2 Aktivität (GFP-Reporter CDK2) durch sein Atom zu Plasma-Relation, wo in der Abwesenheit von CDK2 Aktivität der Reporter befindet sich im Kern und auf CDK2 Aktivierung Shuttles in das Zytoplasma beurteilt ^8. Zusätzlich wird die Kern-DNA von jeder Zelle mit einem DNA-interkalierenden Farbstoff gefärbt, Bisbenzimid, die als Mittel, um Zellen in den Bildern zu erkennen und definieren Kerne Grenzen dient sowie einesa Maß der DNA Fluss die Informationen auf die Zellzyklusposition der Zelle (2).

Die Aktivitäten der CDK6 und CDK2 sind als Zellen Transit von G1 nach S-Phase des Zellzyklus ⁵ nachweisbar und folgen einander ^9,10 und als solche Übereinstimmung zwischen den beiden Reportern in einzelnen Zellen zu erwarten ist. Die Demonstration Datensatz verwendet hier analysiert als ein Beispiel die Wirkung von siRNA zielt CDK6 Retinoblastomprotein (RB1) und eine nicht-Ziel negative Kontrolle (Tabelle 1). Knockdown CDK6 sollte sowohl eine Abnahme des P-S780 RB1-Epitop und eine Ansammlung von Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus auszulösen. Das RB1 Zuschlags dient als Reagenz, um die Spezifität des Phospho-S780-Antikörper. Fluoreszenzmikroskopische Bilder von Formalin fixiert ^11, fluoreszierend gefärbt HCT116 Gewebekulturzellen für das algorithmische Bildanalyse verwendet. Die resultierenden Zahlendaten werden dann verwendet,Querverweis die Reporter und messen die Auswirkungen der verschiedenen Zuschlags Staaten.

Das Potential Größe der durch diese Art der Analyse gewonnenen Daten können eine Herausforderung zur normalen Analysewerkzeuge darstellen. Zum Beispiel können die einzelnen Zellendaten größer als einige Tabellenkalkulationssoftware aufzunehmen. Enthalten sind Perl-Skripte, die eine einfache, hoch repetitiv, überwacht die Verarbeitung der Daten durchzuführen, um Analyse grosser Datenmengen zu unterstützen. Die Perl-Skripte sind speziell für die von Cell Profiler, bei der Verarbeitung von Bilddateien mit einem bestimmten Dateinamenskonvention (Abbildung 3) erzeugten Ausgabedateien geschrieben und erlauben eine variable Anzahl von Feldern pro Vertiefung in die Analyse verwendet werden. Es ist zu Gate einzelnen Zellassay Daten häufig wichtig, Trends in Zellsubpopulationen ⁵ verfolgen und hier dargestellt, ist die Verwendung eines Perl-Skript flag jede Zelle basierend auf einem Satz Gate für jeden Test-Typ vorgegeben ist. Ebenfalls enthalten sind optionale Perl-Skriptenwelche eine Zusammenfassung der Daten Ergebnis für einzelne Vertiefungen (oder Bedingungen) liefert: Prozentsatz von Zellen innerhalb der eingestellten Gate und die Mittelwerte der Ausgangstestergebnisse. Letztere, homogener Art der Betrachtung der Daten ist gültig, wenn Antworten wirken sich auf alle oder die Mehrzahl der Zellen in einem gut. Wie oben erläutert, ist eine solche Beurteilung weniger nützlich, als die von den einzelnen Zelldaten Gating wo Reaktion auf eine Untergruppe von Zellen innerhalb einer Population beschränken lieferte.

Die Nützlichkeit der beschriebenen Arbeitsablauf wird durch siRNA oder die beschriebenen Marker-Assays nicht auf Störung begrenzt. Studien haben diesen Ansatz verwendet, um Reaktionen in der Gewebekultur-Experimente mit Kombinationen von siRNA, chemische Inhibitoren und Strahlenbehandlung und für die Beurteilung der Ausnahme CDK6 Marker und CDK2 Aktivität ⁵ zu untersuchen.

Konzeptionell kann die experimentelle Strategie eine Vielzahl von biologisch nützliche subzellulären Regionen automatisch registriert werdenin der Fluoreszenzmikroskopbilder vorhanden einzelnen Zellen. Auf diese Weise kann dieser Ansatz quantitative Multiplex Daten, aus denen biologische Informationen, die durch Techniken, die auf die Bevölkerung und nicht einzelne Zellen konzentrieren entgehen lassen kann ergeben. Mit geringfügigen Änderungen kann die Vorgehensweise und Analyse-Workflow beschrieben quantitative, einzelne Zelldaten für alle fluoreszenzbasierte Assay-Ausgänge und zellbiologischen Reaktionen, ergeben, wo quantitative Bewertung der DNA-Gehalt, Quantifizierung von Kern- oder Zytoplasma-Fluoreszenz oder das Pendeln von Markierungen zwischen diesen zwei Fächern entweder einzeln oder in einer Multiplexweise von Interesse ist. Als Publishing-Anforderungen sind in der Regel stärker auf die Einreichung der offen zugänglichen Rohdaten, den Zugang zu und die Vertrautheit mit kostenlosen Tools zur Bildmikroskopische Analyse, wie sie hier beschrieben wird, auch von unmittelbarem Interesse sein, Labore uns auf veröffentlichten Daten erneut analysieren.

Protocol

1. Experimentelle Störungs und Zellmarkierung für Response-Marker (Rückwärts Transfektion siRNA-Bildschirm)

1. In einer sterilen Gewebekultur Haube Pipette 70 ul von 200 nM siRNA in 1x siRNA Puffer in Vertiefungen einer sterilen, plain Platte mit 96 Vertiefungen. Verdünne Transfektion Lipids in 40 Volumina serumfreies DMEM-Medium und abzug 105 ul in jede Vertiefung, die siRNA.
   HINWEIS: Die Verdünnung 262,5 ul Lipids in 10,5 ml serumfreies DMEM ergibt einen Mastermix für eine ganze Platte mit 96 Vertiefungen von siRNA und liefert 2,6 & mgr; l Lipid pro Vertiefung. Die Verwendung von 200 nM siRNA Ausgangskonzentration in diesem Schritt eine Arbeitskonzentration von 20 nM in Schritt 1.3 zu liefern, aber Verfahren für Arbeitskonzentrationen bis 5 nM, mit der Ausgangskonzentration entsprechend angepasst (dh 50 nM) zu arbeiten. Niedrigere Arbeitskonzentration kann Off-Target falsch positive Werte zu reduzieren, obwohl sie die Größe des auf dem Zielantwort zu reduzieren, was zu der auf dem targe erhöhent der falsch negativen Ergebnisse.
2. Mischen Sie die Platte durch sanfte Vibrationen für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Eine Unterteilung der erhaltenen 175 & mgr; l in drei 50 ul Wiederholungen pro Target auf einem undurchsichtigen, Gewebekultur-behandelten 96-Well-Platte mit durchsichtigem Boden.
3. Reverse transfizieren durch Dispensieren 8000 Zellen pro Vertiefung in 150 ul DMEM 10% Serum enthält, direkt auf die 50 & mgr; l Lipid-siRNA-Komplexe. Verwenden HCT116 Dickdarmkrebs-Zellen, die ein GFP-markierten Marker Berichterstattung CDK2 Aktivität ^5,8. Kein weiteres Mischen erforderlich. Verschließen Sie die Platte mit einer sterilen, Kleber, atmungsaktive Membran, um Feuchtigkeit zu kontrollieren und Teller "Kanteneffekte" zu vermeiden und legen Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 48 Stunden.
4. Saugen Sie die Medien, so dass eine geringe Restmenge an Medien in den Vertiefungen bleibt. Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 100 ul 4% gepuffertem Formaldehyd in jede Vertiefung und inkubieren in einer Abzugshaube für 10 Minuten bei Raum temperatur.
5. Entfernen Sie die Befestigungslösung durch Absaugen der Platte. An diesem Punkt beendet wird der Versuch durch Waschen der Platte dreimal mit 100 & mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und dann abgedichtet zu speichern, unter 100 & mgr; l PBS in der Dunkelheit bei 4 ° C für bis zu einer Woche, oder gehen mit dem Permeabilisierung der Zellen.
   HINWEIS: Wir empfehlen die Verarbeitung Platten so schnell wie möglich nach der Fixierung und in der Regel bevorzugen die Lagerung von vollständig bearbeiteten Platten. Biozide Konservierungsmittel, wie Thimerosal, Natriumazid, oder kommerzielle Alternativen können hinzugefügt werden, um micoroganismal Wachstum zu verhindern. Zugabe von Phosphataseinhibitoren hilft, Phospho-Epitope zu erhalten, und andere Mittel, um die Proteinmodifikationszustände zu bewahren kann nützlich in relevanten Assay Kontexten
6. Entfernen PBS von der Platte und Permeabilisierung der Zellen durch Zugabe von 100 ul Permeabilisierung Lösung. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Saugen Sie das Permeabilisierung Lösung unter Verwendung einer MultiCHannel Pipette. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.
7. Blockieren die Zellen durch Zugabe von 100 ul Blocklösung pro Well für 30 min bei Raumtemperatur. Nehmen Sie den Block-Lösung durch Absaugen der Platte, dann mit 50 ul anti P-S780 RB1 Antikörper verdünnt 500fach im Block-Lösung für 2 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur zu untersuchen.
8. Dreimal waschen Sie die Platte mit 100 ul Waschlösung Platte, so dass die Lösung auf der Platte für jeweils 5 min. Sonde die Platte über Nacht im Dunkeln bei 4 ° C mit 50 ul fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper verdünnt 1000fach in Blocklösung mit 2 uM des Chromatins spezifischen DNA-Farbstoff Bisbenzimid ergänzt. Dreimal Vertiefungen wie zuvor und abgedichteten Speicher unter 100 ul PBS in der Dunkelheit bei 4 ° C. Bild die Platte innerhalb von zwei Wochen.

2. Bildgebung und Bildsegmentierung

1. Verwenden Sie eine konfokale oder Spinnplattenfluoreszenzmikroskop mit einem 20x-Objektiv getrennte nehmen 16-Bit, Graustufen- TIFF-Bildern in drei Kanäle, die der DNA-Farbstoff, GFP und Immunofärbung Fluorophore. Erfassen viele nicht-überlappende Bildsätze, die hier als Rahmen, um Bild etwa 1.000-2.000 Zellen pro Vertiefung.
2. Nennen Sie die Bilddateien systematisch, so dass jeder Dateiname ist eine einzigartige Kombination von "Experiment Name", "gut-Adresse", "Bildnummer" und "Kanalkennung", in dieser Reihenfolge (Abbildung 3). Das Beispiel-Datensatz verwendet "Blue" (Chromatin-DNA-Färbung) oder "Green" (GFP) oder "Red" (die immungefärbten Fluorophor) als Kanalkennungen. Die gut Adresse, Rahmennummer und Kanalkennung sind weiter als die Bild-Metadaten bezeichnet. Verwenden Sie den Unterstrich zu verwirrend gut und Rahmen Metadaten zu vermeiden.
3. Benennen Sie die Dateien mit den Metadaten-Elemente in der angegebenen Reihenfolge. Dies ist notwendig, um sicherzustellen, dass die nachfolgende Softwareschritte Correctly Gruppe Gruppen von Bildern für die Analyse.
4. Downloaden und installieren Sie die Freeware-Zell Profiler, Aktive Perl Community Edition, R statistischen Programmierumgebung und RStudio. Akzeptieren Sie alle Standardoptionen bei der Installation; PC-Nutzer Installation von Active Perl sollte alle Möglichkeiten zu PATH, Dateierweiterung Verein und Skriptzuordnung in dem dazu aufgefordert werden können. Aktive Perl ist optional für Mac-Benutzer, aber sie werden sonst müssen Sie die Perl-Skript in Schritt 3.2 vom Terminal-Befehlszeile anstatt Symbol Klick ausführen.
5. Öffnen Sie die Zelle Profiler-Software, klicken Sie auf "Datei", "Import-Pipeline" und dann "Aus Datei" und wählen Sie die Datei 3_channels_pipeline.cppipe (Abbildungen S1A und S1B). Die Datei enthält Anweisungen für die Software-Image-Datei-Metadaten aus dem beschriebenen Dateinamenskonvention interpretieren notwendig. Zell Profiler bezieht nun die Bilder, extrahiert Kern-DNA und Antikörper Intensitäten von thESE und verwendet den GFP-Kanal, um das Verhältnis von Kerngegen Cytoplasma Intensität für jede Zelle zu berechnen erfasst (Abbildungen 4 und 5).
6. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Ansicht Ausgabeeinstellungen" in der linken unteren Ecke des Zell Profiler-Fenster. An der Spitze der neuen Bildschirm sind Textfelder "Standardeingabeordner" und "Standard-Ausgabeordner 'beschriftet. Einer nach dem anderen finden Sie in den Ordner-Symbole auf der rechten Seite dieser Boxen und wählen Sie den Speicherort der Bilddateien für die Analyse und das Ziel für die extrahierten Daten, bzw. (Abbildung S1C).
7. Beginnen Sie mit der Bildanalyse, indem Sie die Schaltfläche "Analysieren Images" in der linken unteren Ecke des Zell Profiler. Am unteren Rand des Bildschirms beachten Sie die verbleibende Zeit für die Datenextraktion, der 'Stop Analysis "und" Pause "Buttons. Bei Bedarf unterbrechen die Analyse, indem Sie die "Pause" -Taste jederzeit, was nützlich ist,wenn gerade die Bilder analysiert (in Schritt 2.8 beschrieben).
8. Optional können die Fenster für eine der Bildanalyseschritte, indem Sie auf die Augensymbole in der Platte auf der äußersten linken Rand des Programmfensters (Abbildung S1D). Das Fenster "IdentifyPrimaryObjects" und solche für "Secondary" und "Tertiäre Objects beachten, um zu prüfen, dass die aktuellen Einstellungen in Cell Profiler ausführen Bildsegmentierung eignen (siehe Abbildung 1 und Diskussion für die Beratung über eine Veränderung dieser Einstellungen).
9. Klicken Sie auf "OK" im Meldungsfeld, wenn die Analyse abgeschlossen ist erscheint. Gehen Sie zu der Position 'Default Output Folder ", in der alle Dateien mit den Ergebnissen werden als durch Kommata getrennte-Wert (CSV) Dateien (Abbildung S2A) gespeichert.

3. Datenextraktion

1. Finden Sie die neue Datei "Nuclei.csv", die nur einige der Highlights istAusgabe von Zell Profiler. Diese Datei enthält einzelne Zelldaten für fluoreszierende Antikörper Kernstärke, Kern-DNA Intensität und GFP-Reporter CDK2 Verhältniswerte (6A & S2A).
   HINWEIS: Verschiedene Laboratorien werden, diese Art von Daten zu verarbeiten, um die Art der eigenen Assays angepasst werden soll. Für die aktuelle Daten empfohlenes ist die Verknüpfung der Zellen aus jeder Behandlungszustand nach den Antikörperdaten und die GFP-Reporter CDK2 Werte mit dem mitgelieferten Perl-Skript "2_gate_classifier.pl '.
2. Kopieren Sie die bereitgestellten Perl-Script-Datei "2_gate_classifier.pl" in denselben Ordner wie die "Nuclei.csv 'Datendatei (Abbildung S2A). Doppelklicken Sie auf das Symbol für das Perl-Skript und, wenn Sie gefragt werden, geben Sie den vollständigen Namen der Datendatei gefolgt von einem '.csv' Dateiname Namen für die Datei, in der die Zellen ausgeblendet werden und schließlich die Gate Werte für die Antikörper sindFluoreszenz und GFP-CDK2 Reporter Daten.
   HINWEIS: Wie Sie in erster Linie festzustellen, Gate-Einstellungen und wenden diese zur Analyse der Daten sind unten in der Vertreter Abschnitt Daten und 6 diskutiert (um die Daten zur Verfügung gestellt Verwendung "0.004" und "1,5" bzw. zu analysieren). Mac-Anwender sollten das Perl-Skript aus der Terminal-Befehlszeile durch Eingabe ausführen: "perl 2_gate_classifier.pl '.
3. Achten Sie auf die neu erstellte Datei, die die rohen Einzelzellentestwerte von den ursprünglichen Zell Profiler Daten mit Subpopulation Etiketten, die, wie jede Zelle aus jeder Vertiefung führt gegen beide Tore (6C) zeigen, kombiniert.
4. Zeichnen Sie die Daten für jede Versuchsbedingung mit den einzelnen Zell-Subpopulation Etiketten durch Öffnen des RStudio Software. Klicken Sie auf "Datei" und "Datei öffnen", wählen Sie die Datei 'versehen analysis.r'. Beachten Sie die Befehle an den 6B plotten, 7 und 8 in der oberen linken Fenster RStudio (Abbildung S2B). In der oberen linken Fenster, zwischen den Anführungszeichen Symbole in den Zeilen 5 und 6, geben Sie den Computeradresse des Ordners mit den gated Daten. Fügen Sie den Laufwerksbuchstaben und den Namen der Datei selbst, bzw. (zB "C: / Ordner Analyse / Analyse-Ausgang" und "nuclei_gated.csv").
   HINWEIS: Wenn RStudio wird zum ersten Mal auf einem Computer verwendet wird, wird die R-Grafikpaket "ggplot2" müssen zuerst installiert werden. Dies ist ein nur einmal Schritt für eine neue Installation von RStudio, nach dem dieser Schritt überflüssig. Um 'ggplot2' zu installieren, klicken Sie auf die Registerkarte namens "Packages" über dem Fenster in der unteren rechten Ecke des RStudio, klicken Sie auf die Schaltfläche "Install Packages", die sich unter diesem geöffnet. Ein neues Fenster wird angezeigt. Type 'ggplot2 "(Verzicht auf Zitate) in die' Packages 'sTempo in diesem neuen Fenster ein und klicken Sie auf die Schaltfläche "Installieren", um das Fenster zu schließen, installieren Sie die erforderlichen ggplot2 Funktionen und zum Haupt RStudio Fenster von Schritt 3.6 fort.
5. Markieren Sie die Zeilen 1 bis 17 in der oberen linken Fenster des RStudio, dann auf die Schaltfläche "Ausführen". Dadurch werden die experimentellen Daten, Grenzwerte und auch Ortsangaben in R (Abbildung S2C) eingeben. R wird nun vorübergehend die relevanten Daten für das Plotten zu halten.
6. Markieren Sie einzelne Blöcke des verbleibenden kode Zeile 17, und erstellen Sie die entsprechenden Grundstücke, indem Sie auf "Ausführen" Taste wie zuvor. Beachten Sie die Grundstücke in das Fenster in der unteren rechten Ecke des RStudio und speichern Reihe von Formaten, indem Sie auf die Schaltfläche 'Export' (Abbildung S2D).
7. Beim Schließen RStudio, klicken Sie auf "Nicht speichern", wenn Sie dazu aufgefordert. Dies verhindert Verwechslungen bei der nächsten Verwendung RStudio, die sonst Daten enthalten wirdder vorherigen Sitzung.

Results

Der Satz von Bildern beispielsweise die unter Verwendung des Reverse-Transfektion siRNA Screening-Protokoll seit vorbereitet und mit Zell Profiler Software analysiert. Der resultierende numerische Rohdaten ist so, dass jede Zelle einzeln dargestellt, rückführbar auf sein Image und auch der Ursprung und die für mehrere Fluoreszenzintensität Parameter (6A) gemessen. Für jede Zelle ermittelt die mittlere Atomfluoreszenzintensität für die P-S780 RB1-Antikörper und der integrierten DNA Intensität für die DNA-Farbstoff-definierten Kernmasken bestimmt. Bedeuten GFP Intensitätswerte für Kern und Plasma Regionen jeder Zelle werden ebenfalls aufgezeichnet ermöglicht die Berechnung der Kern gegen zytoplasmatische Fluoreszenz des GFP-Reporter CDK2. Stromabwärts dieser algorithmischen Messungen der Fluoreszenzintensität Gebrauch dieser Einzelzellendaten, um Tore zu beiden Tests, Kernantikörperfärbung und GFP-CDK2 Reporter definieren. Nachträgliche Anmerkung der Zellen auf the Grundlage Assayergebnis und die Verwendung dieser Markierungen an spezifische Subpopulationen ermöglichen, ferner durch eine dritte Messung (Kern-DNA-Gehalt) beschrieben charakterisiert werden.

Histogramm Plot der rohen Fluoreszenzintensität Daten für jeden Test versammelt sind ein wirksames Mittel zur Beurteilung, wie Zell-Subpopulationen verhalten unter verschiedenen Bedingungen. Die Histogramme in Abbildung 6B zeigen die Bevölkerungsverteilung einzelner Zelldaten von drei Vertiefungen für jede RNAi Zuschlags Zustand. Auf der linken Seite sind die Daten für die Kern Antikörper Intensität und auf der rechten Seite sind die entsprechenden Daten für das GFP-Reportergen CDK2. Der P-S780 RB1-Antikörper Daten zeigt, dass die Zellen weitgehend existieren in zwei Populationen im Hinblick auf diese posttranslationale Modifikation und die Zellpopulationen mit dem Verlust der RB1 auf S780 phosphoryliert als linke Spitze der Kernintensität, die angereichert ist unterschieden werden wenn CDK6 nach unten durch siRNA klopfte. Diese gleiche linke Spitzengesehen wird, wenn RB1 selbst ist die RNAi Ziel, was die völlige Entfernung des Proteins und damit P-S780 RB1 Färbung. Im Gegensatz dazu sind die gleichen Versuchsbedingungen für die gleichen Zellen, wenn sie über die GFP-CDK2-Reportertest beobachtet, zeigen eine andere dynamische in den einzelnen Zelldaten. Eine kontinuierliche Verteilung beobachtet wird, mit nur einer einzigen Spitze, aber siRNA, die den Zellzyklus (siCDK6) stört und verursacht Anhäufung in der G1-Phase führt zu einer Verlängerung der rechten Schulter dieser Verteilung (dh zeigt verstärkte Präsenz von Zellen, die ein Erhöhung der Kern / Zytoplasma-GFP-Verhältnis, aufgetragen auf der X-Achse).

Ebenfalls gezeigt auf die Histogramme von 6B sind die Gate-Werte (senkrechte Striche), die auf der Grundlage der Verteilungen der beiden Sätze von Testdaten ausgewählt werden. Das für die P-S780 RB1-Antikörper Daten die Regel verwendet wird, um das Gate Position als halbhohe definieren: an der linken Schulter des Hauptmaximums Breitenposition(Rechts) Spitze, wenn man die negative Kontrollzelldaten (non-targeting siRNA). Daten rot markiert sind Zellen mit einer reduzierten und abwesend P-S780 RB1, die mit diesem Tor identifiziert. Ein ähnliches Tor auf der gegenüberliegenden Schulter des Verhältnisses Wertverteilung positioniert ist für das GFP-CDK2 Reporter verwendet. Die daraus resultierenden Hoch Verhältnis Population Zellen, die fehlen oder Feature reduziert CDK2-Aktivität, sind grün markiert. Um Multiplex-Analyse der beiden Tests zu veranschaulichen 6C zeigt die Umsetzung der beiden Gate-Werte mit dem 2_gate_classifier.pl Perl-Script, um die Rohdaten (6A) in die annotierte Datei unten zu konvertieren. Diese neue Datei enthält die ursprünglichen Daten zusammen mit einer neuen Spalte der Klassenzuordnungen für jede Zelle und die beiden Gate-Werte verwendet werden, um sie zu unterscheiden (in diesem Fall die Gates von 0,004 für die Antikörper-Daten und 1,5 für das GFP-Reporter-CDK2 verwendet wurden, jeweils) .

Nachdem die einzelnen Zellen f eingestuftrom jedes Zuschlagszustand auf der Basis der beiden Tests ist es nun möglich, diese Klasse Etiketten verwenden, um die Annotation von Plots der Untersuchungsdaten zu unterstützen. Abbildung 7 zeigt Streudiagramme der einzelnen Zellendaten für die P-S780 RB1 und GFP CDK2 Assays aus den Beispieldaten für alle drei RNAi Bedingungen eingestellt. Zahlen Annotation der Quadranten auf den Streudiagramme zeigen die relativen Prozentsätze der einzelnen gated Subpopulation auf den gesamten für die Zuschlags Rahmen und sind im Bereich F unter Verwendung der oben beschriebenen Klasse Etiketten erzeugt. Diese Diagramme zeigen, dass, im Vergleich zu Zellen, die mit nicht-Targeting siRNA (7B), Zellen mit siCDK6 transfiziert offenbaren eine Nettodatenverteilungs transfiziert verschoben sowohl auf der Y-Achse nach unten (was die Abwesenheit von RB1 Phosphorylierung an Serin 780) und auf der rechten auf der X-Achse (das einen niedrigen CDK2 Aktivität, 7C). Beide Schichten sind für Zuschlags dieser Ziel erwartet. Im Gegensatz dazu werden die Daten aus siRB1 transfizierten Zellen (7A) zeigen einen Verlust der Antikörperfärbung in Übereinstimmung mit dem Verlust des Epitop, aber wenig Wirkung bei der Datenverteilung des CDK2 Reporter der Kontrollgruppe mit nicht-Targeting-siRNA, was keinen großen Effekt auf die GFP transfiziert -CDK2 Reporter ergibt sich aus RB1 Zuschlags.

Um die Verwendung von einzelnen Zellendaten, Subpopulation Klassifizierung und Test Multiplexing 8 weiter zu erforschen zeigt das Streudiagramm für die siCDK6 Daten aus 7C neben gepaart Histogramm Profile für die integrierte DNA Intensität. Die Paare der Histogramme beziehen sich auf gegenüberliegenden Hälften der gesamten Bevölkerung, auf der Grundlage der jeweiligen Antikörper Intensität (rechts von der Streu) oder GFP-Reportergen CDK2 Verhältniswerte (über dem Streudiagramm) unterteilt. Quantifizierung von Kern-DNA-Intensität für diesen Populationen zeigt zwei Peaks, 2N und 4N DNA Gehalt haben als linke und rechte Peaks auf. Die intentions der Gatter in den Abbildungen 6, 7 und 8 sind derart, dass die Zellen so niedrig identifiziert für P-S780 RB1 (bezeichnet: P-S780-) oder mit einer hohen Verhältniswert aus dem GFP-Reportergen CDK2 (beschriftet: G1) wird werden in der G1-Phase des Zellzyklus. Tatsächlich sind die DNA-Profil Histogramme für Subpopulationen mit einem dieser Assays identifiziert enthalten überwiegend Zellen mit 2n DNA Gehalt haben. DNA-Profile von der gegenüberliegenden Wohnbevölkerung (Beschriftung: P-S780 + oder Nicht-G1) enthält Zellen mit Ausschüttungen von 2 N bis 4 N, im Einklang mit solchen Zellen die Annahme einer Reihe von Zellzyklus-Positionen nach der G1-Phase.

Obwohl der Schwerpunkt hier ist die Generierung und Analyse einzelner Zelldaten von fluoreszenzBunt Bilder ist es auch sinnvoll sein, in der Lage, diese Daten zu nehmen und zusammenfassen jeden Assay auf einem gut-für-auch Grundlage der Variabilität zwischen Wiederholungen und die Performance überwachen aller Brunnen für einen bestimmten Test für einen ganzen Teller von Daten. einen A) die P-S780 RB1 Daten und b) die GFP-Reporter CDK2 Daten. Die in A und B aufgetragen Werte werden durch zwei zusätzliche Perl-Skripte mit diesem Manuskript vorgesehen erzeugt wird; 'Antibody_fluorescence_summary.pl "und" G1assay_summary.pl' auf. Diese Skripte verwenden die Rohdaten erstellt von Cell Profiler (Nuclei.csv) und Report-Daten pro sowie i) Gesamt Zellen gemessen pro Well, ii) Anzahl von Zellen innerhalb des Tor, iii) Prozent Zellen im Tor und iv) das arithmetische Mittelwert der gemessenen Rohdaten für so gut. Dies wird als geeignet für die Suche über große Mengen von Assaydatenoption, bevor die sich auf eine individuelle Behandlung von Daten mit gemultiplexten Beurteilung einzelner Zellendaten wie in dargestellt enthalten 8. Die Diagramme angezeigt hier plot 'iii) Prozent Zellen innerhalb des Tores für beide Assays, die die nicht normale Datenverteilungen für die P-S780 RB1 und GFP-CDK2-Daten in den Histogrammen in 6B gesehen entsprechen. Diese Skripte auch berechnen 'iv) das arithmetische Mittel der gemessenen Rohdaten für diese gut ", die Analyse von Daten für die homogene Population Antworten und normale Datenverteilung vor und nach der experimentellen Störung entsprechen würde.

Abb. 1: Übersicht über die Schritte im Workflow zur fluoreszenzmarkierten Mikroskopbild Daten quantitativ zu analysieren Der Workflow wird hier als vier Schritte (A) dargestellt Zunächst ist es notwendig, experimentell Zellen vorbereiten Fluoreszenz-Imaging.. Das hier beschriebene Beispiel ist das von aBildschirm, in dem siRNA-behandelten adhärenten humanen Tumorzellen werden für 48 Stunden an einem 96-Well-Gewebekulturplatte gezüchtet, fixiert und gefärbt. Verschiedene RNAi Bedingungen in dreifacher Ausführung in getrennten Vertiefungen in der Platte vorhanden sind. Zellen werden mit einem DNA-Farbstoff, einem Antikörper, der für RB1 auf der CDK4 phosphoryliert und 6 selektiven Zielstelle Serin-780 (P-S780 RB1) gefärbt, sondern auch stabil ein GFP-CDK2-Reportergen exprimieren, Berichts G1 Austrittszellzyklus. Gemeinsam sind diese Fluoreszenzsonden bilden zwei Tests innerhalb des Workflows getrennt beurteilt. (B) Parallel Mikroskopbilder für jeden Fluoreszenzsonde (Kanal) erzeugt und benannt, wie zum Detail, mit dem die Bildanalyse-Software kann die Daten zu organisieren sind. (C) Das Bilddateien werden in den Zell Profiler-Software, die einzelnen Zellen und die dazugehörigen Paare von Kern und Plasma vor was Intensitätsmessungen für die drei fluoreszierenden Sonden erkennen algorithmisch identifiziert geladened in jedem. (D) Schließlich ist ein Perl-Skript werden die produzierten Rohstoffen quantitative Daten zu organisieren. Dieser Schritt gilt Tore zu den Fluoreszenzintensitätsdaten für jede Zelle, effektiv Binning die Zellen in Subpopulationen, die aufgetragen werden können, verfolgt und ins Kreuzverhör genommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2: Experimentelle Daten, die von der Bildanalyse aus den Beispieldaten eingestellt wurden abgebildet und entsprechende Intensitätsmessungen pro Zelle aufgenommen erhältlich sind Die Fest, siRNA-behandelten, fluoreszierend markierten Zellen.. Repräsentative Bilddaten werden für jeden Parameter während der Bildanalyse aufgezeichnet (A) gezeigt Nuclear DNA Intensität. Die Intensität der Färbung der Zellkern-DNA-Farbstoff verwendet ergeben ein Maß für DNA pro Kern (B) Kernstärke von Phospho-RB1:. Immunfärbung für P-S780 RB1 spezifische über einen primären (schwarz) Antikörper und fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper (rot) ermöglichen eine Intensitätsmessung RB1 Phosphorylierung an . S780 pro Kern (C) GFP-CDK2 Reporter: Die verwendeten stabil ein GFP-markierten Reporterprotein, das zwischen dem Zellkern und Zytoplasma in einem festgelegten Raster mit dem Zellzyklus transloziert auszudrücken Zellen. Dual Messung des gekoppelten nuklearen und zytoplasmatischen GFP Intensität für jede Zelle ermöglicht die Berechnung eines Verhältnisses pro Zelle, die verwendet werden können, um G1-Phase von dem Rest des Zellzyklus unterscheiden. Drei siRNA Ziele werden verwendet, um die Analyse zu illustrieren; eine Non-Targeting-Negativkontrolle siRNA; CDK6 siRNA als positive Kontrolle in stören RB1 Phosphorylierung und Zellzyklus Fortschritt; RB1 siRNA zu Antikörper-Spezifität zu etablieren.k "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 3: Organisation der Bilddaten vor der Bildanalyse Die aus der Gewebekulturplatte werden die Bilder systematisch variiert, um damit die Bildanalyse-Software die Bilddaten zurück zu der ursprünglichen experimentellen Kontext beziehen gestattet.. Diese Information wird im Dateinamen für jedes Bild als jeder Vertiefung auf das Experiment Platte gelegt. (A) kann zu verschiedenen RNAi Targets oder Behandlungen, die auch Adressformen Teil des Dateinamens entspricht. (B) Die Rahmennummer ist Teil des Dateinamens ., wie jede Vertiefung abgebildet wird, um mehrere, nicht überlappenden Rahmen (C) zu sammeln werden Fluoreszenzsonden aus jedem Rahmen separat abgebildet werden; damit die Dateinamen müssen auch, welcher Kanal jedes Bild bezieht sich auf, um zu reflektieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abb. 4: Die Verwendung von Zell Profiler, um Kern-DNA und Antikörperfärbung zu messen Mit den Einstellungen in der vorgesehenen Pipeline-Datei (3_channels_pipeline.cppipe), den Zell Profiler Bildanalysesoftware Maßnahmen Fluoreszenz-Intensitätswerte für Kern-DNA und Antikörperbindungs ​​zu einzelnen Zellen . (A) Die Zellkerne werden in der "blauen" Kanal Bild von gefärbten DNA identifiziert. (B) < / Strong> Die Positionen der DNA gefärbten Zellkernen werden in einem 'Kerne Maske "statt. Die Kerne Maske wird dann auf (C), die blauen und roten Kanal Bilder (DNA und Antikörperfluoreszenzdaten bezeichnet) und die Fluoreszenzwerte von Bildsegmenten, die mit der Maske überlappen, gegen jede identifizierte Zelle aufgezeichnet lagert. Erfolgreiche Identifizierung separaten, benachbarten Kernen kann visuell im Erscheinungsbild der Kerne Maske bewertet. Zur Veranschaulichung wird in diesem Bildmaske dargestellt eingekreist, sind Beispiele, wo die gewählten Einstellungen für den Algorithmus sind falsch identifizierten benachbarten Kernen als Einzelzellkern. Anpassen der Einstellungen Algorithmus, um diese Ereignisse wird im Diskussionsabschnitt eingeführt zu minimieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 5: Verwendung von Zell Profiler nuklearen und zytoplasmatischen GFP Intensitäten messen Das GFP-markierten CDK2 Reporter transloziert zwischen dem Kern und dem Zytoplasma in Bezug auf die Zellzyklusposition der Zelle.. Zugleich dieser Zelle Profiler berechnet die DNA und Antikörperkernintensitäten pro Zelle (4), sie berechnet auch den Kern zum Cytoplasma-Verhältnis von GFP-Intensitäten für jede Zelle. (A) Die DNA-Farbstoff-Daten für jedes Bild wird zum Erzeugen a Nuclei Maske. (B) Cell Profiler verwendet der Nuclei Maske in Verbindung mit dem GFP-Bild aus dem GFP-Reportergen CDK2, um die Position jeder Zelle Saatgut und dann expandiert, um Umfangs jeder Zelle, um die gesamte Grundfläche von jeder Zelle zu schätzen. Dies wird zu einem neuen, "Zell Maske". (C) Die Kerne Maske wird aus der Zelle Maske subtrahiert einen Donut-ähnliche Reihe von Zytoplasma skizziert, die sich zu ergebendie "Zytoplasma Maske '. (D) Die Kerne Maske und Zytoplasma Maske von Cell Profiler verwendet werden, um Paare von nukleäre und zytoplasmatische GFP-Werte zu messen. Diese Wertepaare werden dann von Cell Profiler verwendet, um Verhältnisse, die als zur jeweiligen Position der Zelle im Zellzyklus informieren zu berechnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abb. 6: Datenextraktion - Verarbeitung roher einzelnen Zellendaten von imposanten Tore auf Testwerte Biologische Trends aus den einzelnen Zellendaten für die Antikörperfärbung und GFP-CDK2 Reporter-Assays werden mit gated Daten extrahiert. Histogramme der Rohdaten ermöglichen Identifizierung geeigneter Gate-Werten. Diese werden dann mit einem Perl-Skript auferlegt werden. (A) DieEndprodukt der Analyse der Bilddateien mit den bereitgestellten Einstellungen für Zell Profiler sind durch Kommata getrennte-Wert (CSV) Dateien. Diese Dateien c ontain einzelnen Zellendaten bezüglich jeder der verschiedenen subzellulären Segmenten. Die Datei 'Nuclei.csv' enthält alle ausgewählten Messungen bezüglich der Verwendung der Kerne Maske. Diese Messungen sind die nukleare Antikörper Intensität, Kernintensität und DNA, die das GFP-Verhältnis (Nucleus / Zytoplasma). (B) Histogramme der Antikörper zurückzuführen Intensität (links) und GFP-Reporter CDK2 Verhältnisse (rechts), aufgetragen aus einzelnen Zelldaten für jede siRNA Zuschlags Zustand . Die Balken auf der angezeigten Histogramme zeigen die gewünschten Gate-Positionen für diese Tests. Farbige Daten über die Histogramme zeigen die Wohn Subpopulationen. (C) Die Tore für die beiden Tests in B dargestellt sind, auf die Rohdaten mit dem Perl-Skript "2_gate_classifier.pl 'angewendet. Das Skripterzeugt eine modifizierte Kopie der Datei ursprünglichen Zell Profiler-Ausgang (Nuclei.csv) an nachfolgende Auftragung unterstützen. Die beiden Gate-Werte werden in der neuen Datei (farblich hervorgehoben hier) und eine neue Spalte 'Label' hinzugefügt wird aufgezeichnet. Die Etiketten bin jede Zelle in eine von vier möglichen Untergruppen auf der Basis der zwei torgeTestWerte für jede Zelle. Diese Etiketten sind in den nachfolgenden Grundstücke, die Berechnung der Beiträge der Teilgesamtheit als auch die Querverweise der in Cell Profiler generiert zusätzliche Parameter verfügen verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abb. 7: Streudiagramme für jede siRNA Zustand darstellt Rohdaten für Einzelzellen und Gate-Positionen Streudiagramme der indiviZwei-Zellen-Daten aller Bilder für die siRNA Bedingungen: (A) siRB1; (B) Sinon-Targeting Negativkontrolle, (C) siCDK6. Gegen die Y-Achse aufgetragen sind Werte der Kernfluoreszenz von anti-P-S780 RB1-Färbung. Gegen die X-Achse aufgetragen sind, die von der GFP-Reporter CDK2 berechneten entsprechenden Verhältniswerten. Die roten und grünen Balken zeigen die Positionen der Tore für die P-S780 RB1 Tor und die GFP-Reporter CDK2 Toren auf. Die zwei Gates trennen die Zellen in vier Untergruppen, und die Zahlen in den resultierenden Quadranten sind die prozentuale Anzahl der Zellen von jedem von diesen. Anmerkungen um die Achsen für A bezeichnen die vier möglichen Label-Elementen, um jede Zelle durch die 2_gate_classifier.pl Perl-Skript angewendet. Etiketten dieser Art sind in Bezug auf ihre jeweiligen Assay Gate dargestellt und werden in der R-Skript (analysis.r) verwendet, um die Plots in den 6, 7 zu erzeugen, und Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 8: Zellpopulationen durch die beiden G1 Transit Assays definiert zeigen 2N und 4N DNA-Profile in Übereinstimmung mit Testergebnis Das Streudiagramm der Daten für die siCDK6 Zellen aus 7C wiederholt.. Rund um das Streudiagramm sind Histogramme für integrierte Kern-DNA Intensität in Bezug auf Untergruppen der Bevölkerung. Diejenigen, über dem Streudiagramm beziehen sich auf die GFP-Reporter-Assay CDK2. Die, auf der rechten Seite des Streudiagramm beziehen sich auf Kern Phospho-RB1-Antikörper Messungen allein. Die farbigen Gateleitungen werden erweitert, um ihre Beziehung zu den Histogramme zeigen. Tor-Etiketten, mit denen die Zelle Daten wurden für diese zusätzlichen Grundstücke ausgewählt werden ebenfalls angezeigt. Zellen mit Verlust der RB1 an Serin 780 (P-S780-) oder solche mit einem hohen GFP-Reporter CDK2 Kern zu Plasma-Relation phosphoryliert (zeigt niedrige CDK2 Aktivität) zeigen überwiegend 2N-ähnliche DNA-Profile, während die gegenüberliegende Gegenstücke für den jeweiligen Assay zeigen eine Verteilung von 2N und 4N, die charakteristisch für eine gemischte, post-G1-Phase Population von Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 9: Zusammenfassung Grund gated Testwerte für jede siRNA Zustand Zusammenfassung Diagramme von gated (A) P-S780 RB1 Daten und (B) GFP-CDK2 Daten aus drei Vertiefungen für jede siRNA Knockdown Zustand.. Werte wurden aus dem rohen Zell Profiler Ausgang (Nuclei.csv) unter Verwendung der berechnetenPerl-Skripte 'antibody_fluorescence_summary.pl' (A) oder "G1assay_summary.pl" (B). Die aufgetragenen Werte sind Mittelwerte der prozentualen Zellen innerhalb des Gate jedes Assay angewendet. Die Balken zeigen die Standardfehler von dreifachen Vertiefungen berechnet. Ungepaarten, homoskedastisch T-Test-P-Werte für jeden Zuschlags Zustand im Vergleich zu nicht-targeting siRNA sind über die gezeichneten Daten dargestellt, wobei p <0,001 (**) und P <0,05 (*). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Figur.

Abbildung S1. Einrichten Zell Profiler Software zur Bildanalyse. (A) Screenshot of Cell Profiler, bevor die Bildanalyse-Einstellungen eingetragen werden. (B) Screenshot of Cell Profiler nach dem Algorithmus Details in "3_channels_pipeline.cppipe 'enthaltenen geladen wurden. Die hohe beleuchtete Registerkarte in der linken oberen Ecke zeigt an, dass dieser Bildschirm zeigt die Parameter für die Phase der Analyse "Loadimages. Durch Klicken auf die übrigen Teile der Liste darunter werden die Details für die weiteren Schritte in der Analyse zeigen. (C) Screenshot of Cell Profiler mit Details zum Eingabeordner und Ausgabeordner eingetragen. (D) Screenshot of Cell Profiler nach dem 'Analyze Button Bilder 'angeklickt wurde, um Analyse zu beginnen. Darüber befinden sich drei neue Fenster, welches die algorithmisch erzeugte Masken von der Software aus den Bildern unter Analyse erzeugt. Diese Fenster werden durch Anklicken der "Auge" Symbole in die offene Position neben der jeweiligen Schritte in der Analyse zugänglich, in der oberen linken Ecke des Hauptzellen Profiler-Fenster. Diese Ansichten zu helfen, um zu überprüfen, ob die Einstellungen der Erzeugung der Konfetti farbenen Masken einverstanden mit den beigefügten, ursprüngliche, Graustufendaten.

ent "> Abbildung S2. Die Verwendung von Perl und RStudio zu Tor einzelne Zelldaten und plotten die daraus resultierenden Zell-Subpopulationen. (A) der rechten Seite wird die gewählt, um den Ausgang .csv-Dateien (grüne Icons) aus dem Zell Profiler-Analyse erhalten Ordner. Die Perl-Skripte mit dem Manuskript (blaue Symbole) zur Verfügung gestellt werden in diesen Ordner kopiert. Hervorgehoben ist das Perl-Skript "2_gate_classifier.pl", der ein Doppelklick ausgeführt mit der Maus, um das Dialogfeld im linken Bereich zu produzieren hat. Dargestellt sind die Aufforderungen und entsprechend eingegeben Antworten notwendig, Tor die einzelnen Zellendaten aus dem "Nuclei.csv 'Datei. (B) Screenshot RStudio sofort nach dem Laden des" analysis.R' Skript. Hervorgehoben sind die Befehle, die gated Daten von A in laden die Software vor dem Auftragen (Anmerkung Angaben in den Zeilen 5 und 6 werden nach dem das geschlossene Daten auf dem Rechen befinden müssen angepasst werden,r für die Analyse verwendet). (C) Screenshot RStudio einmal Daten hochgeladen. (D) Screenshot RStudio zeigt hob die Codeblock erforderlich, um die in der unteren rechten Fenster angezeigt Grundstück zu produzieren. Codes für jedes Grundstück sind durch Leerzeilen getrennt und durch Art der Darstellung zusammengefasst.

siRNA Ziel	Platte und Adressen
Non-Targeting (NT)	E5, F5, G5
Retinoblastom (RB)	E7, F7 G7
Cyclin-abhängige Kinase 6 (CDK6)	B2, C2, D2

Tabelle 1: Well-Adressen und die entsprechenden in den Beispieldatensatz verwendet siRNA Bedingungen.

Discussion

Die beschriebene Arbeitsablauf stellt ein Verfahren für die Multiwell perturbance von Zellen mit siRNA, nachfolgenden Marker Erkennung und schließlich nutzen eine Reihe von softwaregestützten Schritte zur Gewinnung von quantitativen Daten aus den resultierenden Fluoreszenzmikroskopiebilder zu erleichtern. Der Ansatz beruht auf der Lieferung von nuklearen und zytoplasmatischen Intensitätswerte für einzelne Zellen, die breite praktische Anwendung in vielen zellbasierten Anwendungen hat konzentriert. Die Beispieldaten verwendet, hier in einer siRNA Bildschirmeinstellung, in der zwei fluoreszierende Assays für G1-Phase des Zellzyklus Transit getestet und zurück zu einer direkteren biophysikalischen Messung der Zellkern-DNA-Gehalt korreliert erzeugt.

Die Verwendung eines fluoreszierenden DNA-Farbstoff, um Bild nukleäre DNA ist ein unverzichtbarer Schritt in der Bildsegmentierungsprozess, da es erlaubt die Identifizierung von individuellen Zellen, und die resultierende "Nuclei Maske 'dient als Ausgangspunkt für die entsprechende cytoplasmi identifizierenc Regionen. Die GFP-markierten Reporter CDK2, die stabil in den Zellen exprimiert wird, gibt eine variable noch durchweg höher als Hintergrundsignals in das Zytoplasma durch die diese Kammer kann abgegrenzt werden. Die gleiche Analyse Leitung sollte für die Analyse von Protein Translokationsereignisse Verwendung anderer geeigneter Fluoreszenz-Reportern verbunden und ihre Reaktion auf perturbance sein. Auch Austausch des GFP-Reporter mit CDK2 Cytoplasma-spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen erlauben würde die alternative Verwendung dieses Algorithmus, um die Abmessungen des Cytoplasmas und der relativen Größe der Zellen in den Bildern zu messen.

Eine weitere Designüberlegung bei der hier beschriebenen Bildsegmentierungsstrategie ist die Verwendung von Zell Profiler integrierte Intensitätswerte für die Quantifizierung der DNA zu liefern. Integration der Intensitätswerte für die Kern-DNA-Färbung Daten ermöglichen mögliche Variationen in Kerngröße und stellt eine gute Übereinstimmung für die Quantifizierung Profile gesehenfür Propidiumiodid gefärbten FACS-Daten. Jedoch können integrierte Intensität nicht liefern ein geeignetes Mittel, um die Proteinfunktion zu kontrollieren, wo mittlere Konzentration von Durchschnittsintensität von Antigen Fluoreszenz exemplifiziert ist biologisch relevant als die integrierte Gesamtmenge an Protein (und assoziierten Fluoreszenz) in einem Zellkompartiment. Daher mittlere Intensität Werte wurden für die P-S780 RB1 und GFP-Daten verwendet. Die Option, zwischen den beiden Modi (Mittelwert oder integrierten) der Datenauswertung auf dem Panel des Zell Profiler Software 'ExportToSpreadsheet' gefunden zu ändern.

Die Analyse Einstellungen im 3_channels_pipeline.cppipe Datei für die Bilder in dem Beispiel Datensatz optimiert. Die Analyse der neuen Bilder-Sets mit diesem Protokoll wird verlangen, dass die Dateinamen übernehmen die oben beschriebene Namenskonvention (Abbildung 3). Auch Werte Empfindlichkeit um die Helligkeit des Zellkern-DNA-Färbung und Schwellenwerte für den Hintergrund anzupassenIntensitäten in den neuen Bildsätze können müssen innerhalb der Zelle Profiler-Einstellungen angepasst werden. Angesichts der Schlüsselrolle der DNA-Färbung hält für den Bau der verschiedenen Bildsegmentierung Masken, ist die Anwendung der richtigen Empfindlichkeitseinstellungen für diesen Kanal Schlüssel für die erfolgreiche Analyse der neuen Bilddaten mit der Zell Profiler Software. Die zur Verfügung gestellten Zell Profiler Einstellungsdatei (3_channels_pipeline.cppipe) enthält Hinweise auf die am häufigsten nützliche Parameter zur Anpassung der Analyse neuer Daten. Diese Hinweise sind in das Textfeld am oberen Rand des Bildschirms in der Zelle Profiler Hauptfenster und sind Leitlinien für die Änderung der Empfindlichkeitseinstellungen und Einstellung die Anzahl der Kanäle untersucht werden. Wie in Abschnitt 2.8-Protokoll, um die Einstellungen für neue Bilddaten zu testen angeklagt kann es notwendig sein, um die Bildsegmentierung während der Bildanalyse, indem Sie auf die offene "Auge" Symbole für jeden der zu beobachten "Identifizieren ... Objekte" Protokollschritte (Abbildung S1D ). Insbesondere wird die Visualisierung der Bilddaten durch "IdentifyPrimaryOjects 'zeigen, wenn die Kerne Maske korrekt aus Bildern der DNA-Färbung identifiziert. Auf der Zell Profiler Software Seite für die 'IdentifyPrimaryOjects' Modul ist der Schwellenwert-Korrekturfaktor. Versuch und Irrtum Einstellung dieses Wertes werden die meisten Kernerkennungsfehler zu beheben. Die Werte Gleichgewicht der DNA Kanal gegen die Hintergrundintensität für jedes Bild. Threshold Korrekturfaktor Werte Scharnier um 1, wobei mehr als dieses ist strenger (gut für klare Bilder) und weniger als 1 ist nachsichtig (um Bilder geeignet mit weniger Kontrast zwischen Färbung und Hintergrund).

Das rohe Ausgabe einzelner Zellendaten aus Zell Profiler kann in unterschiedlicher Weise auf die Bedürfnisse der anderen Studien entsprechen analysiert werden. Hier dargestellt ist der Einsatz von einem Perl-Skript zu Toren, zwei der gemessenen Parameter pro Zelle, um das Extrahieren biologische Trends aus der Daten ein, um assistd Genehmigung Querverweise der identifizierten Untergruppen mit zusätzlichen Messungen. Zwar ist es auch möglich, Elemente der Anschnitt im Rahmen der Zell Profiler umfassen, die alternative Route verwendet hier eine größere Flexibilität und Geschwindigkeit, insbesondere wenn große Datenmengen zu beurteilen sein. Der langsamste Stufe in den post-Bildaufnahme Phasen des derzeitigen Protokolls ist der Betrieb des Zell Profiler Software. Zell Profiler hier wird ohne dass Tore, ein un-gated Rohdatensatz, die schneller mit der anschließenden Perl-Skript erneut analysiert werden können, erzeugen mit unterschiedlichen Gate-Werten führen und, wenn nötig, iterativ. Nicht alle Studien werden im Voraus wissen, die geeignet Tor Werte, da dies mit Reagenzien, an einem bestimmten Satz von Daten unterscheiden und möglicherweise im Laufe der Zeit. Es wird daher empfohlen, Histogramme Darstellung der Rohdaten Verteilung von Zell Profiler für positive Kontrollen und Mock-gestörten Zellen, um erhalten zu generieren, um geeignete Gate wertvolle identifizierenes für die Parameter von Interesse.

Die Perl-Script geschrieben, um einen fest definierten Spaltenstruktur von Daten aus Zell Profiler akzeptieren und kann nicht mehr funktionieren, wenn ein Benutzer die Anzahl der Parameter Ausgabe von Cell Profiler mit den Einstellungen des "ExportToSpreadsheet 'modifiziert. Als Beitrag zur Umsetzung Änderung der Einstellungen Noten innerhalb der Perl-Skript-Dateien enthalten. Um zu sehen, diese sehen können Sie das Skript in einem Texteditor, vorzugsweise Texteditor für Programmierer, um Farbcode Perl-Elemente gesetzt (zB http://www.activestate.com/komodo-edit). Diese Hinweise zeigen an, wo das Skript anpassen, um auf Änderungen im Datenformat anpassen. Ähnlich wie bei den Perl-Skripte, die R-Code-Datei zur Verfügung gestellt (analysis.r), enthält die Anweisungen für die Darstellung der Zahlen aus der Bildanalyse-Daten können in einem Texteditor oder RStudio Software gelesen werden, um zusätzliche Hinweise zur Verwendung und Anpassung zu sehen. Diese Notizen können mit Details zu regulären Ausdrücken und Perl 12 und die ggplot2 ¹³ Paket für R, die beide bilden die Grundlage dafür, wie die Daten gelesen werden, kommentiert und aufgetragen sind.

Neue Studien unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie sowie Rohdaten mit Open-Source-Publikationen hinterlegt sind zugänglich für Analysemethoden, wie sie hier beschrieben. Das Wesen der High-Content-Daten eignet sich für rekursive Analyse mit verschiedenen analytischen Schwerpunkte je nach Forschungsinteresse eines jeden Betrachters. Obwohl die Fragen, die von den Daten gefragt werden können, sind von den Sonden ursprünglich beschränkt Bilddaten können oft sinn über den Rahmen von Studien, die sie erzeugt, erneut analysiert werden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AllStars siRNA mit Negativkontrolle	Qiagen	1027280	siRNA mit Negativkontrolle.
CDK6 siRNA	Dharmacon/ Benutzerdefinierte Synthese	NA	Antisense-Sequenz: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU
RB1 siRNA	Dharmacon/ Benutzerdefinierte Synthese	NA	Antisense-Sequenz: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT
5x siRNA-Puffer	Thermo Scientific	B-002000-UB-100	Zur Verdünnung mit nukleasefreiem, nicht DEPC-behandeltem Wasser.
Nulcease-freies Wasser (nicht DEPC)	Applied Biosystems	AM9937	Zur Verdünnung von siRNA-Puffern.
Hiperfect	Qiagen	301705	Transfektionslipid.
DMEM	Life Technologies	41966052	mit Pyruvat und hohem Glukosegehalt angereicherte Gewebekulturmedien.
96-Well-Gewebekulturplatte	Falcon	3072	Normale, 96-Well-Gewebekulturplatte für das parallele, kompartimentierte Mischen von Transfektionskomplexen.
Packard Viewplate	Perkin Elmer LAS	6005182	96-Well-TC-Platte mit optischer Basis, auf der Zellen transfiziert, gezüchtet, fixiert und schließlich abgebildet werden. Lieferung mit undurchsichtigen, selbstklebenden Plattendichtungen, die bei der Lagerung von gebrauchten Platten verwendet werden.
Atmungsaktive Membran	Alpha Labs	LW2783	Sterile, gasdurchlässige, selbstklebende Membran.
Neutral gepuffertes Formalin, 10%	Sigma-Aldrich	HT5012-1CS	10% Formalin (4% Formaldehyd) Fixiermittel, das im Protokoll sauber verwendet wird.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100PC	Nichtionisches Waschmittel
[header]
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Trizma-Base (Tris(hydroxymethyl)aminomethan)
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Für Plattenwaschlösung.
Anti-P-S780 RB1 Antikörper	Abcam	ab32513	Kaninchen monoklonal
AlexaFluor647 Anti-Kaninchen	Invitrogen	A21245	Hochgradig kreuzadsorbierter, fluoreszenzmarkierter Sekundärantikörper.
Hoechst 33342 (Bisbenzimid)	Sigma-Aldrich	B2261	Fluoreszierender, Chromatin-interkalierender DNA-Farbstoff.
Permeabilisierungslösung	NA	NA	0,1% Triton X-100 in 50 mM Tris-gepufferte Kochsalzlösung, pH 8,0.
Tellerwaschlösung	NA	NA	Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20.
Blocklösung	NA	NA	5 % Milchpulver in Tris-gepufferter Kochsalzlösung und 0,1 % Tween-20. Zum Blockieren der Platte vor der Immunfärbung und Verdünnung von Antikörpern.
Cell Profiler 2.1	Broad Institute		http://www.cellprofiler.org/download.shtml
Active Perl Community Edition	ActiveState		http://www.activestate.com/activeperl/downloads
R Programmierumgebung	Die R Foundation		http://www.r-project.org
Rstudio	Rstudio		http://www.rstudio.com/