Erzeugung transgener Hydra Durch Mikroinjektion Embryo

Zusammenfassung

Stabil transgene Hydra werden durch Mikroinjektion von Plasmid-DNA in Embryonen hergestellt, gefolgt von zufälliger genomischer Integration und asexueller Vermehrung, um eine einheitliche Linie zu etablieren. Transgene Hydra werden verwendet, um Zellbewegungen zu verfolgen, Gene zu überexprimieren, die Promotorfunktion zu untersuchen oder die Genexpression mithilfe von RNAi zu unterbinden.

Zusammenfassung

Als Mitglied des Stammes Cnidaria, der Schwestergruppe aller Bilaterien, kann Hydra Licht auf grundlegende biologische Prozesse werfen, die mehrzellige Tiere gemeinsam haben. Hydra wird als Modell für die Untersuchung von Regeneration, Musterbildung und Stammzellen verwendet. Die Forschungsbemühungen wurden jedoch durch das Fehlen einer zuverlässigen Methode für Genstörungen zur Untersuchung der molekularen Funktion behindert. Die Entwicklung transgener Methoden hat die Erforschung der Hydra-Biologie neu belebt¹. Transgene Hydra ermöglichen die Verfolgung lebender Zellen, die Sortierung zur Gewinnung reiner Zellpopulationen für die biochemische Analyse, die Manipulation der Genfunktion durch Knockdown und Überexpression sowie die Analyse der Promotorfunktion. Plasmid-DNA, die in Embryonen im Frühstadium injiziert wird, wird zu Beginn der Entwicklung zufällig in das Genom integriert. Dies führt zu Schlüpflingen, die Transgene in Gewebeflecken in einer oder mehreren der drei Linien (ektodermale Epithel, endodermale Epithel oder interstitiell) exprimieren. Die Erfolgsquote, ein Junges mit transgenem Gewebe zu erhalten, liegt zwischen 10 % und 20 %. Die asexuelle Vermehrung des transgenen Jungtiers wird verwendet, um eine einheitlich transgene Linie in einer bestimmten Linie zu etablieren. Die Erzeugung von transgenem Hydra ist überraschend einfach und robust, und hier beschreiben wir ein Protokoll, das einfach und kostengünstig implementiert werden kann.

Einleitung

Hydra ist verwendet worden, um die Regeneration, Musterbildung zu studieren, und Stammzellen für etwa 250 Jahre ² Hydra hat eine einfache Körperplan, bestehend aus drei Zelllinien. Ektodermalen Epithelzellen, endodermalen Epithelzellen und interstitiellen. Der rohrförmige Körper wird von der ektodermalen und endodermalen Epithelzellen Abstammungslinien, von denen jede eine einzelne Zellschicht ausgebildet ist. Alle epithelialen Zellen im Körper Spalte mitotischen. Wenn Epithelzellen in den Extremitäten ³ verschoben wird, der Kopf (Mund und Tentakeln) in der mündlichen Ende oder dem Fuß (basal Scheibe) an der aboralen Ende, sie ....

Protokoll

1. Herstellung von Plasmid-DNA, Nadeln und Injektions Geschirr

1. Bereiten Sie die Plasmid-DNA mit einem High-Speed-Maxi oder Midi-Kit und konzentrieren die DNA auf 2,5 mg / ml mit Ethanol-Fällung. Das DNA-Pellet sollte in Nuklease-freiem deionisiertem Wasser gelöst werden. Speichern die DNA in 10-20 ul-Aliquots bei -20 ° C. (Siehe Zusatz Tabelle 1 für eine Liste der verfügbaren Vektoren)
2. Machen Sie eine Spritz Gericht unter Verwendung von Agarose, eine Mulde zur Aufnahme Embryonen in einem 100 x 15 mm Petrischale konstruieren.
   1. Legen Sie ein 75 x 50 Glasobjektträger in einen 100 x 15 mm Petrischale in einem Winkel. Pour ca.....

Ergebnisse

Gründung transgenen Linien Hydra

Jungtiere ernähren transgenen alle 2-3 Tage mit Artemia-Nauplien. Jungtiere manchmal nicht für ein oder zwei Tage zu essen nach dem Schlüpfen. Einige neue Jungtiere nie zu essen, und damit wird nicht überleben. Wenn das Jungtier ist entweder in der transgenen ektodermalen (Abbildung 1A) oder endodermalen Epithel, damit das Tier zu knospen und sammeln die Knospen, die den meisten transgenen Gewebe (Abbildung 1B, C).

Diskussion

Hydra routinemäßig reproduziert ungeschlechtlich, erfordert aber Umweltreize zu produzieren Gameten zu beginnen. Diese Stimuli werden für die meisten Arten Hydra gut definiert und kann von Stamm zu Stamm unterscheiden. Ein wesentliches Hindernis für die Herstellung von transgenen Hydra Erhalten Embryonen regelmäßig, weil es schwierig im Labor zu induzieren Hydra sexuelle geworden sein kann. Der AEP-Stamm ²⁵ erzeugt jedoch Gameten leicht im Labor und dies ist der einzige Sta.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
AEP Hydra Strain			E-Mail: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu oder Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
High Speed Maxi Kit	Qiagen	12662
100 x 15 mm Petrischalen	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Glasmikroskop Objektträger	Sigma	CLS294775X50
Mikroinjektion Fischschimmel	IBI Scientific	FM-600
Borosilikatglas mit Filament	Sutter Instrument	BF100-50-10	Außendurchmesser: 1,0 mm, Innendurchmesser: 0,50 mm, 10 cm Länge
Flammende/Braune Mikropipette Abzieher	Sutter Instrument	P-97
Phenolrot	Sigma	P3532
Juwelierzange, Durmont #5	Sigma	F6521
Skalpellklinge #15	Fischer	50-822-421
Mineralöl	Sigma	M8410-500ML
Mikroinjektor	Narishige	IM-9B
Magnetständer	Narishige	GJ-1
Eisenplatte	Narishige	IP
Joystick Mikromanipulator	Narishige	MN-151