Eine Next-Generation Tissue Microarray (ngTMA) Protokoll zur Biomarker-Studien

Summary

Das Protokoll zielt auf die Optimierung der Konstruktion und Qualität der Gewebe-Mikroarrays für Biomarker-Forschung. Es umfasst Aspekte der Planung und Design, digitale Pathologie, virtuellen Schiebe Anmerkungen und automatisierte Gewebeanordnungs.

Abstract

Biomarker-Forschung setzt auf Tissue Microarrays (TMA). TMA durch wiederholte Übertragung von kleinen Gewebekernen aus einem "Spender"-Block in eine "Empfänger"-Block erzeugt und dann für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet Biomarker. Die Konstruktion von herkömmlichen TMA ist arbeitsintensiv, ungenau und zeitaufwendig. Hier wird ein Protokoll mit der nächsten Generation Tissue Microarrays (ngTMA) skizziert. ngTMA auf TMA Planung und Design, digitale Pathologie und automatisierte Gewebemikroarray-basierte. Das Protokoll wird am Beispiel von 134 Patienten mit metastasiertem Kolorektalkarzinom dargestellt. Histologischen, statistische und logistische Aspekte berücksichtigt werden, wie der Gewebetyp, spezifische histologische Regionen und Zelltypen für die Aufnahme in der TMA die Anzahl von Gewebeflecken, Probengröße, statistische Analyse, die Anzahl der Kopien TMA. Histologischen Präparaten für jeden Patienten abgetastet und auf einem Web-basierten digitalen Plattform hochgeladen. Dort werden sie angezeigt und annotated (markiert) mit einem 0,6-2,0 mm Durchmesser Werkzeug, mehrere Male mit verschiedenen Farben, um Gewebebereiche zu unterscheiden. Spenderblöcke und 12 "Empfänger"-Blöcke in das Gerät geladen. Digitale Folien werden abgerufen und an Spenderblock Bilder abgestimmt. Wiederholt Anordnungs von kommentierten Regionen wird automatisch durchgeführt, was zu einer ngTMA. In diesem Beispiel sind sechs ngTMAs geplant, die sechs verschiedenen Gewebetypen / histologische Zonen. Zwei Kopien der ngTMAs sind erwünscht. Drei bis vier Schieber für jeden Patienten abgetastet werden; 3 Scan-Durchläufe nötig sind und über Nacht durchgeführt. Alle Folien sind kommentiert; verschiedenen Farben werden verwendet, um die verschiedenen Gewebe / Zonen, nämlich Tumorzentrum, Invasionsfront, Tumor / Stroma, Lymphknotenmetastasen, Lebermetastasen und Normalgewebe darstellen. 17 Anmerkungen / Fall gemacht werden; Zeit für Annotation 2-3 min / Fall. 12 ngTMAs sind enthalten 4.556 Spots produziert. Anordnen Zeit ist 15-20 Stunden. Aufgrund seiner Präzision, Flexibilität und Geschwindigkeit, ist ein leistungsfähiges ngTMAWerkzeug, um die Qualität der TMAs weiter zu verbessern in der klinischen und translationalen Forschung.

Introduction

In den letzten zwei Jahrzehnten haben Tissue Microarrays (TMA) einen bemerkenswerten Einfluss auf die Biomarker-Untersuchung Studien hatten. TMAs sind im wesentlichen Gewebe "Archive" durch die wiederholte Übertragung von kleinen Gewebekerne, in der Regel in einer Größe von 0,6 bis 2,0 mm Durchmesser hergestellt, aus Paraffin eingebettet "Spender"-Blöcke in einem einzigen TMA "Empfänger"-Block (Abbildung 1) ^1. Mit einem kleinen Kerngröße, können etwa 500 verschiedene Gewebeflecken aus wenige oder viele verschiedene Patienten in einen TMA ² angeordnet werden.

Die Verwendung von TMA für prognostische oder prädiktive Biomarkerstudien hat viele Vorteile. Man betrachte das Beispiel, wo die Expression eines Proteins Biomarker durch Immunhistochemie ist an 450 Patienten ausgewertet. Anstatt der Durchführung 450 immunhistochemische Färbungen auf 450 Patienten Folien aus der gleichen Anzahl von Blöcken unterteilt, können kleine Kerne von jeder Probe auf einem einzigen T angeordnet werden,MA-Block. Auch wenn mehrere Kerne werden von jedem einzelnen Patienten entnommen werden eine minimale Anzahl von Blöcken erzeugt. Das hat den erheblichen Einfluss von Kosten und anderen Ressourcen drastisch abnehm sowie die Verringerung Gewebe Verschwendung. Zusätzlich ermöglicht dies angemessen versorgt Studien unter Verwendung einer großen Anzahl von Geweben unter den gleichen experimentellen Bedingungen ausgewertet werden.

TMAs haben viele verschiedene Anwendungen. Zum Beispiel können sie verwendet werden, um die Morphologie, Proteinexpression, RNA-Expression und DNA-Aberrationen folgenden Färbung mit verschiedenen Farbstoffen zu untersuchen, oder nach Immunhistochemie oder chromogene und selbst Fluoreszenz in situ Hybridisierung ^3-7. Jüngste Studien haben auch den inner TMAs und Ring Variation in Färbeprotokollen testen, stellen Spezifität oder Sensitivität von Antikörpern für bestimmte Gen-Mutationen und die Interobserver Reproduzierbarkeit der Proteinexpression in internationalen Kooperationen bestimmen ^8-11.

Der Bau der traditionellen TMAs mit Patienten stammenden Gewebe ist eine lange Mehrschritt-Verfahren (Abbildung 2). Es beginnt mit der Suche nach möglichen geeigneten Fällen und Auswahl von Diagnose Dias aus dem Archiv in einem Institut für Pathologie, oder andere Institut, von wo sie abgerufen werden. Der Pathologe beurteilt die Folie pro Fall und wählt die Vertreter Rutsche für die Zwecke der Studie. Als nächstes wird der interessierende Bereich mit einem Stift unter dem Mikroskop direkt markiert. Dies ist oft schwierig und ungenau und führt nur zu einer "Schätzung", wo Gewebe Schläge vorgenommen werden soll. Danach werden die Paraffinblöcke entsprechend dieser markierten Folien aus dem Archiv abgerufen. Ein schneller Vergleich zwischen Block und Schieber gemacht. Mit einer halbautomatischen oder hausgemachte Gewebe Arrayer wird die Spenderblock im Kostenvoran Region von Interesse ausgestanzt und in einen Empfänger TMA Block übertragen. Konstruktion von TMA mit diesen Anordnungsverfahren ist arbeitsintensiv, zeitaufwendig, ungenau und unflexibel. Vorbereiten einer TMA von 475 Stellen in 3 Kopien wird auf etwa 84 Stunden Arbeit.

Planung und Design (oder Beratung), die digitale Pathologie kombiniert mit Know-how in der Histologie und automatisierte TMA Anordnen ^12: Ein neuer Ansatz für den Bau von TMA wurde kürzlich durch das Institut für Pathologie der Universität Bern, die auf drei Komponenten beruht eingeführt. Gemeinsam wird dieses Konzept genannt nächste Generation Tissue Microarray (ngTMA). Im Folgenden wird ein Protokoll für ngTMA basierend auf dem Beispiel der 134 Patienten mit metastasiertem kolorektalem Karzinom beschrieben. Hier Primärtumoren sowie Lymphknotenmetastasen und Lebermetastasen sind in ngTMAs für nachfolgende Biomarker-Analyse angeordnet werden. Zusätzlich werden kleine Gewebekerne von jedem Patienten für zukünftige Nukleinsäureextraktion gewünscht.

Protocol

HINWEIS: Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Inselspital, Bern, Schweiz (07-10-13) genehmigt worden. Gewebe wurden von der Tumorbank Bern, Institut für Pathologie der Universität Bern erhalten.

1. Planung und Design (Consulting)

1. Denken Sie über die Forschungsfrage beantwortet werden. Entscheiden Sie sich für den Gewebetypen, die in das Projekt einbezogen werden. Bestimmen Sie, was histologische Strukturen sind wichtig, um die Frage zu beantworten.
2. Festzustellen, die die nützlichsten Kerndurchmesser und die Anzahl der Kerne pro Patient für das Projekt. Entscheidet über die Anzahl der Kopien der nächsten Generation Tissue Micro Array (ngTMA) bezogen auf die Menge der Biomarker zu untersuchen.
3. Betrachten statistische Aspekte wie Stichprobengröße und-Analyse nach der Tissue Microarray (TMA) aufgebaut ist. Bestimmen Sie die Anzahl der Patienten, für die Aufnahme in die Studie und zu etablieren Kontrollgeweben für das Array.
4. Rufen Sie die histologische (oderDiagnose) Hämatoxylin und Eosin (H & E) Dias von jedem Patienten. Kurz die Dias und bestimmen Sie diejenigen, die relevante Informationen und Histologie für das Projekt.
   HINWEIS: Stellen Sie neue Abschnitte der Paraffinblöcke, wenn besondere Flecken oder Immunhistochemie Schlitten für Dias Scannen und Annotation gewünscht, anstelle von H & E Dias

2. Schieben Scanning

1. Schalten Sie PC und Dia-Scanner und Scan-Software geöffnet. Wählen Sie "Automatik-Modus" für Hellfeld Scannen von der Vorschau-Bildschirm.
2. Klicken Sie auf "Scan-Optionen", um die Diashow Qualitätsparameter einzustellen. Zu diesem Zeitpunkt wählen, ob Träger werden direkt auf die digitale Plattform von Internet oder auf einem lokalen Laufwerk (oder externes Laufwerk) zugänglich gescannt werden und stellen die Arten des Scannens und der Anzahl der Schwerpunkte.
3. Klicken Sie auf "Server-Parameter", um zum "Case-Center" zu scannen. In diesem Schritt fügen Sie mehr Zeitschriften, beschriften alle Folien und setzender Ordner in der Rechtssache Center, wo die Folien gespeichert werden sollen. Jedes Magazin kann bis zu 25 Dias.
4. Überprüfen Sie die Qualität / Sauberkeit tatsächlichen histologischen Präparaten für das Scannen. Falls notwendig, reinigen Folien mit 70% Ethanol.
5. Legen Sie bis zu 25 Objektträger pro Magazin mit dem nach innen weisenden Etiketten (3A)
6. Legen Sie das Magazin in den Scanner. Für mehr als ein Magazin, legen Sie sie auf der jeweils anderen.
7. Dia scannen, indem Sie auf den grünen Pfeil (3B). Wenn alle Objektträger gescannt werden, entladen die Zeitschriften und schloss das Programm ab, PC und Dia-Scanner.

3. Digital Slide Annotation

1. Geben Sie die Browser-Adress für digitale Dia-Management-Center und laden Sie die kostenlose digitale Dia-Viewer-Software.
2. Öffnen Sie die digitale Dia-Viewer-Software und wählen Sie den Ordner mit den digitalen Objektträger (4A).
3. Notizen hinzufügen, neu anordnen und verwalten die digital Dia-Ordner oder Benutzerrechte vergeben, um Kollegen oder Anlagen hinzufügen zu dem Ordner.
4. Klicken Sie auf die gewünschte digitale Dia in der digitalen Dia-Betrachter angezeigt.
5. Mit Hilfe der Vergrößerungswerkzeug, bewerten Sie die Folie und finden Sie die Gegenden für die Integration in die ngTMA.
6. Mit dem 'TMA Anmerkungswerkzeug ", wählen Sie die Größe des gewünschten Kern und die Farbe der Annotation. Legen Sie die Anmerkung auf der digitalen Dia indem Sie darauf klicken (Abbildung 4B).
7. Bewegen Sie die Annotation zu den gewünschten histologischen Strukturen zur Einführung in das ngTMA (4C).
8. Wiederholen Sie diesen Vorgang der Annotation wieder mit Hilfe der Anmerkungswerkzeug, die Auswahl einer Kerngröße und einer gewünschten Annotation Farbe. Wiederholen Sie den Schiebe Betrachtung und Kommentierung auf allen Folien im Ordner.
9. Alternativ legen Gewebe Kerne für die PCR in 0,2-ml-Röhrchen statt Integration in die TMA. Anmerkungen versehen Folien mit einer anderen Farbe zu identifizierenDiese Spots für weitere molekulare Analyse.
10. Erstellen Sie eine Liste aller Fälle mit den entsprechenden Anmerkungen und Farben.

4. Tissue Microarray Bau

1. Rufen Sie die entsprechenden Paraffingewebeblöcke für alle digitalen kommentierte Dias, sortieren Blöcke in der gewünschten Reihenfolge für die Gewebemikroarray.
2. Stellen Sie sicher, dass die Gewebeblöcke haben ein Minimum von 4 mm Dicke. Wenn nicht, ist Rückbettung von Gewebe notwendig.
3. Schalten Sie den PC "ON" und automatisierte Gewebemicroarray-Instrument. Öffnen Sie das Gewebe Microarray-Software und geben Sie einen Namen für das Projekt
4. Führen Sie einen "Werkzeugwechsel", und wählen Sie die gewünschte Werkzeugdurchmesser für das Projekt (dh 0,6, 1,0, 1,5 oder 2,0 mm).
5. Legen Sie bis zu 12 "Empfänger" TMA-Blöcke in die Maschine. Geben eine ID zu jedem der 12 Blöcke
6. Erstellen Sie eine TMA-Layout für jede Empfängerblock. Beobachten Sie eine TMA-Design mit der Anzahl der Zeilen, Spalten und zuvorkommeny-Linien sowie Abstand zwischen den Kernen. Ein neues Layout für die einzelnen Empfängerblock oder verwenden Sie das gleiche Layout wiederholt.
7. Platzieren Sie den Cursor auf dem Empfängerblock-Layout, um die ersten Kern nehmen.
8. Als nächstes laden bis zu 60 Spenderblöcke in das Gewebe Microarray (5A). Zeigen zehn Blöcke in jeder Zeile von A bis F. Geben Sie jedem Block ein Spender ID. Bilder von jeder Spenderblock beobachten auf dem Computerbildschirm automatisch vom Gewebe Microarray erworben.
9. Beginnend mit dem ersten Block, klicken Sie auf "Verschieben". Beachten Sie die annotierte digitale Dia in der digitalen Dia-Management-Center (oder auf dem externen Laufwerk) gespeichert unter Verwendung der digitalen Dia-Betrachter. Anzeigen des Bildes und des Spenderblocks und die digitale Dia Seite-an-Seite.
10. Auswahlreferenzpunkten auf dem Block Bild zu dem Spenderblock Bild mit dem digitalen Objektlagern
11. Nach dem Klick auf "Weiter", beobachten die Anmerkungen auf ein größeres Bild des Blocks. (5B </ Strong>). Klicken Sie oben auf die Anmerkungen zu bestätigen, und klicken Sie auf "Start".
    HINWEIS: Dies fordert das Gewebe Microarray starten ein Loch von 0,6 mm Durchmesser in der Empfängerblock bei der gewählten Ausgangspunkt. Dann in einem zweiten Schritt unter Verwendung des Stanzwerkzeugs, stanzt das Instrument Loch im Gewebe der ausgewählten Spenderblock in der genauen kommentiert und bestätigt Region. Kerne werden dann aus dem Spender auf den Empfänger übertragen Block.
12. Nach etwa 500 Kerne, reinigen Sie den Bohrer und Stanzwerkzeug mit einem Putzlappen Xylol.
13. Wenn Gewebe Kerne sind erwünscht (eher als Schläge in ein ngTMA), klicken Sie auf den "PCR"-Tool für den Block, bestätigen bis zu 4 Anmerkungen und klicken Sie auf "Start". Dies wird Punsch und übertragen Sie die Kerne in einer 0,2-ml-Tube.
14. Wiederholen Sie Punkt 4,9-4,11 mit der zweiten Spenderblock, und so weiter.
15. Nach der Verwendung alle Spenderblöcke, geben Sie eine zweite Runde der Spenderblöcke (61-120) in das Gewebe-MikroarrayER und weiterhin Schritte 4,8-4,11.
16. Aktualisieren Spender und Empfänger Blockbilder während der Projektfortschritt beim Bohren und Stanzen auftritt (Abbildung 5C).
17. Führen Sie eine "Export", nachdem das Projekt abgeschlossen ist. Suchen Sie die Datei mit den .xslx Spender und Empfänger-Block-IDs, die Lokalisierung aller Schläge innerhalb der TMA sowie der TMA-Layout / Design, in der exportierten Ordner. Speichern Sie alle Bilder Spenderblock mit allen überlagert Annotation als jpg-Bilder in der exportierten Ordner (5D). Der letzte Block TMA ist dann bereit.

Results

Planung und Design

Hier das Beispiel von 134 Patienten mit metastasiertem kolorektalem Karzinom, die für eine bestimmte Reihe von Biomarker untersucht werden, verwendet. Nicht nur ist ein ngTMA für diese Patienten geplant, aber DNA-Extraktion durch Mutationsanalyse für eine angegebene Gen gefolgt.

Während der Planung und Entwurfsphase ngTMA wurden folgende Aspekte entschieden. Von jedem Patienten wird 6 verschiedene histologische Regionen untersucht werden: Tumorzentrum, Tumorinvasionsfront, Bereiche der dichtesten Tumorknospung (Tumor / Stroma-Interaktion), Normalgewebe, Lymphknotenmetastasen und Lebermetastasen. Drei Tumor Spots pro Tumorgewebe Bereich und zwei normalen Gewebe Spots sind in das Projekt (n = 17 Spots pro Patient) aufgenommen werden. Da es ist geplant, dass mehr als 50 Biomarker auf dieser Patientenmaterial untersucht werden können, werden zwei Exemplare des endgültigen ngTMA gewünscht. Aufgrund der möglichen Kleinheit Lymphknoten und distant Metastasen, eine kleine Kerndurchmesser von 0,6 mm für TMA Konstruktion für alle Gewebe gewählt wird.

Zusätzlich ist vorgesehen, dass jede Region getrennt angeordnet sein, so dass 6 ngTMAs mit verschiedenen histologischen Bereiche erzeugt werden: ein ngTMA enthaltenden Geweben aus a) Tumorzentrum, B) Invasionsfront, c) Tumorknospung Bereiche d) normales Gewebe , e) Lymphknotenmetastasen und f) Lebermetastasen.

Für die TMA-Design mit einem 0,6 mm-Werkzeug wird ein komfortablen Abstand von 0,4 mm zwischen Schläge gewählt werden. Da Auswertung Gewebeflecken in langen Reihen und Spalten ist oft lästig, werden zwei Ausführungen gewählt. Für die Tumorblöcke mit 3 Schlägen pro Gewebebereich wird ein Design mit sechs Teile angelegt. Dies führt zu einer Gesamtzahl von 402 Schlägen Gewebe. Für normales Gewebe Schläge, Schläge sind 2 pro Fall einbezogen werden. Ein Layout passend 432 Schläge insgesamt gewählt wird.

Außerdem, für jeden Fall bis zu 4Kerne mit 0,6 mm wird zusätzlich ausgestanzt und in 0,2-ml-Röhrchen platziert werden. Diese Gewebekernen wird auch kommentiert werden.

Zusammenfassend wird 6 ngTMAs verschiedener Gewebe produziert werden (5 x 3 Arrays Tumor Schläge x 134 Patienten; 1 Normalgewebe Array x 2 Schläge x 134 Patienten) zusätzlich zu 4 Kerne pro Patient für Rohre. Zusammengenommen wird 2814 Anmerkungen gemacht werden.

Als nächstes werden die entsprechenden H & E Folien aus ausgewählten Patienten aus der Folie Archiv. Jeder Fall wird kurz von einem Pathologen überprüft und repräsentativsten Dias von jedem Gewebetyp ausgewählt werden.

Scannen

Digitale Folien jeder histologischen Schnitt sind für zukünftige Annotation gemacht. Für diese Studie sind 3-4 Gewebeschnitten, die pro Fall, dh, primäre Darmkrebs gescannt werden, mit oder ohne Normalgewebe, Lymphknotenmetastasen und Lebermetastasen und möglicherweise eine zusätzliche Rutsche conTaining normalen Schleimhaut.

Bis zu 10 verschiedene Magazine können vollständig in die Dia-Scanner eingelegt werden; daher 250 gleitet in einem einzigen Durchlauf abgetastet werden. Zeit zum Abtasten und digitale Foliengröße variiert mit den Abmessungen des Gewebes und der gewünschten Qualitätsfaktor. Der Qualitätsfaktor reicht von 0 bis 100. Hier wird ein Qualitätsfaktor von 60 gewählt, da sie eine geringere Scandateigröße produziert ohne spürbaren Verlust von Scan-Qualität. Kleine Biopsien in weniger als 30 s abgetastet werden, wobei ganze Gewebeschnitte, wie die, die in diesem Beispiel verwendet wird, kann zwischen 2 und 10 min dauern. Digitale Dia-Größe kann auch im Bereich von 2 MB bis 2 GB. Mit Hilfe eines Qualitätsfaktor von 60, scannt zwischen 600 MB und 1 GB hergestellt.

Zwischen 402 und 536 Objektträger werden für dieses Projekt in Höhe von 3 Scanläufe erforderlich. Jeder Lauf wird über Nacht durchgeführt. Ca. 500 GB Speicherplatz benötigt wird. Die Objektträger werden direkt auf eine digitale Plattform namens Fall Zentrum gescannt (ngtma.unibe.pathcasecenter). Fall Center ist von überall zugänglich mit Internet-Zugang durch Eingabe der benannten Benutzername und Passwort.

Anmerkung

Für Anmerkungen, sollten zwei Aspekte berücksichtigt werden: 1) verschiedene Gewebebereiche sollten verschiedene Farben Annotation gegeben werden und 2) die Anzahl der Anmerkungen sollte die Anzahl der gewünschten Kopien des endgültigen ngTMA zu reflektieren.

In diesem Fall haben 3 Punkte pro Tumorbereich für eine einzelne Kopie ausgewählt. Für 2 Kopien, muss jede Region mit 6 Spots annotiert werden. Nützlich sind grün für normale Gewebe, blau für die Tumorzentrum, gelb für die Tumorinvasionsfront, rot für Bereiche Tumorknospung (Tumor / Stroma) Interaktion, schwarz für Lymphknotenmetastasen, türkis für Fernmetastasen und schließlich weiß für Regionen zu sein für Rohre verwendet. Annotation von jeweils 2-3 Minuten benötigt.

ngTMA Bau

Diese Studie benötigt 6 ngTMA Blöcke to in 2 Kopien aufgebaut werden, was in 12 abschließenden Blöcken. Die maximale Anzahl der Empfänger, die durch die Blöcke Arrayer unterstützt werden kann, ist 12. Jede Tumor Block 402 Gewebe Spots beinhalten und jedes normale Gewebe Block 268 Spots, in Höhe von insgesamt 4.556 Spots im gesamten Projekt enthalten.

Ein TMA Layout wird für jeden Empfänger Block erstellt, und das Projekt wird gespeichert (6A, 6B). 60 Gewebeblöcke in das Gewebe Microarray parallel geladen werden; ein Bild von jedem Spender Block genommen wird. Beginnend mit dem ersten Spenderblock, wird der entsprechende kommentierte digitale Dia von Case-Center abgerufen werden. Slide Anpassung durchgeführt, die zwischen 1-3 Minuten dauern kann. Anmerkungen werden bestätigt und die Arrayer wird aufgefordert, beginnen Stanzen (Abbildung 7). Kern Stanz-und Transferzeit beträgt etwa 12 Sekunden. Verlust der Kerne während dieses Verfahrens ist gering. Gesamtzeit zum Ordnen dieses Projekt beträgt etwa 24 Stunden, einschließlich der Zeit für slide / Block-Matching und Nachladen des Instruments. Einige Beispiele für ngTMA sind in 8A dargestellt. Kerne für die nachfolgende molekulare Analyse kann auch zu diesem Zeitpunkt (8B) ausgestanzt werden.

Abbildung 1. a) Ein "Spender"-Block. Kerne aus dem Spenderblock ausgestanzt und in B) einen Empfänger Block oder Tissue Microarray (TMA) übertragen.

Abbildung 2. Die herkömmliche Tissue Microarray-Workflow. A) histologischen Präparaten aus dem Archiv abgerufen und B) an den Pathologen f gegeben oder Bewertung. CD) Anmerkungen werden auf den Folien, die den "geschätzten" Region für die Übertragung aus E.) Die entsprechenden Gewebeblöcke abgerufen werden. F) Block und Rutsche für passenden Vergleich, der G kann), manchmal eine schwierige Aufgabe sein. HJ ) Gewebemikroarray dann stattfindet. K) Kerne werden immer wieder übergeben und L) eine endgültige TMA aufgebaut ist.

Abbildung 3. a) bis zu 25 Dias in jedem Magazin für das Scannen. B) Anpassung der Qualitätsfaktor gesetzt und Größe hergestellt werden können. Scanfortschritt überwacht werden kann.

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Abbildung 4. A) gescannten Dias können auf die web-basierte Plattform, Fall Center. B) Digitale Folien angezeigt werden können hochgeladen werden. Die TMA-Annotation Tool ermöglicht dem Benutzer, die Kerngröße und Farbe für Annotation. C erforderlich) Anmerkungen können direkt auf die digitale Folie platziert werden soll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. a) bis zu 60 Blöcke in das Gewebe Microarray, nämlich 10 Spenderblöcke pro Zeile und 12 Empfänger Blöcken sowie B) Ein Bild von jedem Spender-Block. Geladen werden können, wird genommen, die digital Schieber abgerufen. Abstimmung von Block und Rutsche ist getan und Anmerkungen werden für Block Stanzen. C) Der Fortschritt der Anordnungs kann überwacht werden, während das Gerät Stanzen. D) nach dem Stanzen durchgeführt wird, ein Export der Standort jeder Stelle im Layout, aber auch ein Bild von jedem Spender Block mit entsprechenden Anmerkungen gemacht.

Abbildung 6. Diese TMA-Layouts wurden Anordnen der A) Tumorblöcke und B) normalen Geweben verwendet.

Abbildung 7. Screenshot der Microarray-Gewebe-Software. Auf der linken Seite, 12 refänger Blöcke können in dem Gerät angeordnet werden. Auf dem Boden, werden die Bilder der einzelnen Spenderblock übernommen. In der Mitte, der TMA-Layout wird der Fortschritt der Stanz sowie vergrößerte Bilder der einzelnen Spenderblock mit Anmerkungen gefunden.

Abbildung 8. A) Einige Beispiele für neu erstellte ngTMA Blöcke. B) Weitere Schläge Gewebe können für nachfolgende molekulare Analyse entnommen werden. Diese Kerne ausgestanzt und in 0,2 ml-Röhrchen gegeben.

Abbildung 9. Beispiele für ngTMA Biomarker-Anwendungen. A) Immunhistochemie-Färbung von Ki67 in der Darmkrebs. Dual HER2 Immunhistochemie / in situ-Hybridisierungsassay, welches B) geringe Expression des Proteins (braun) und keine Amplifikation des HER2-Gens (schwarz) relativ zu dem Zentromer (rot), c) eine hohe Expression des Proteins (braun) und HER2-Genamplifikation ( schwarz), bezogen auf Zentromer (rot). D) Chromogene in situ Hybridisierung Her2 single mRNA-Transkripte in der Brustkrebs ngTMA. E) Immunhistochemie für CD8 in Darmkrebs. F) Doppel Immunhistochemie-Färbung für pan-Zytokeratin-Marker AE1 / AE3 (braun, Tumorzellen) und CD68 (rot;. Makrophagen) Hervorhebung Tumor-Mikroumgebung in der Darmkrebs Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

In diesem Beitrag wird ein Protokoll für ngTMA beschrieben. ngTMA ist ein neu etabliertes Konzept zur Gewebemikroarray mit Planung und Design, digitale Pathologie und Dia-Annotation sowie automatisierte ^{Gewebemikroarray-12.}

Im Vergleich zu herkömmlichen Gewebemikroarray bietet ngTMA viele Vorteile. In einem ersten Schritt wird die Projektierungsphase kritisch. Der Schwerpunkt liegt auf der Beantwortung einer gezielten Fragestellung. Dies sollte berücksichtigt werden die histologischen Fragen (zB, welche Regionen und wie viele Flecken will ich gehören?), Die statistische Planung (zB Stichprobengröße? Wie kann ich meine Proben später zu analysieren?) Und logistische Überlegungen (zB wie viele Biomarker und daher, wie viele Kopien ngTMA?). Eine spezifische ngTMA wird für die spezifischen Bedürfnisse gemacht, ob es für Biomarker-Screening und High-Throughput-oder, um spezifische histologische Aspekte nur auf ein paar gut ausgewählte cas studierenES.

Eine, wenn nicht die, am wichtigsten Nachteil herkömmlicher Gewebemikroarray die geringe Genauigkeit, mit der Markierungen auf den histologischen Objektträgern hergestellt werden. Die histologische Untersuchung spezifischer Strukturen, Zellen oder Bereiche nahezu unmöglich gemacht. ngTMA ermöglicht hohe Genauigkeit, da Anmerkungen direkt auf den digitalen Objektträger platziert. Dies ermöglicht dem Forscher, genau Wählen Sie die Regionen gestanzt werden, einschließlich spezifischer Zellen. In diesem Beispiel sind die verschiedenen Bereiche innerhalb des gleichen Gewebeblock aus zum Ordnen tanzt, wie die Tumorzentrum der Invasionsfront und Bereiche der Tumor / Stroma-Wechselwirkung durch das Vorhandensein von kleinen Tumorzellhaufen oder sogar einzelne Zellen markiert. Diese Genauigkeit kann nur mit ngTMA erreicht werden. Drittens, weil Objektträger werden auf einem Web-basierten digitalen Plattform abgetastet gleiten Ansicht und Kommentierung durch den Computer nicht mit dem Mikroskop durchgeführt werden. Das Gewebe Anordnungs Software bietet eine benutzerfreundlicheSchnittstelle mit einem hohen Grad an Flexibilität und damit verschiedene Layouts und ngTMA Design erreicht werden kann. Da TMA Aufbau wird automatisch durch Bohren durchgeführt wird, gibt es wenig Notwendigkeit für praktische Manövrieren und die Zeit für die Konstruktion erheblich reduziert. Die Zeit für die TMA Bau in diesem Beispiel ist hier zwischen 24 Stunden. Bei Verwendung eines herkömmlichen TMA Ansatz und Schätzen 15 Schläge pro Stunde, wäre dieses Projekt etwa 304 Stunden zu nehmen.

ngTMA kann angewendet werden, um Protein-Expression, mRNA oder DNA sowie Kombinationen davon zu untersuchen. 9 veranschaulicht einige dieser Anwendungen potentielle Biomarker. Standard Immunhistochemie angewendet werden, um die Verbreitung von Krebserkrankungen unter Verwendung von Index Ki-67 zu bestimmen. Ein kombinierter Ansatz zur Proteinexpression und DNA-Amplifikation für Gene wie HER2 Untersuchung verwendet werden. Gewebe können auf einem einzigen ngTMA versammelt, um Kosten, Auslastung und anderen Gewebe Ressource zu verringerns. Zusätzlich können chromogene mRNA in situ Hybridisierung für HER2 und andere Gene durchgeführt werden, um einzelne mRNA-Transkripte in einer Vielzahl von Fällen unter Verwendung einer minimalen Anzahl von Gewebeschnitten zu identifizieren. Immunhistochemie von Immunmarker, wie CD8 können im Rahmen der Tumormikroumgebung dargestellt werden. Doppel Immunhistochemie kann auch verwendet werden, wie Interaktionen zwischen Immunzellen (rot markiert) und Tumorzellen (in braun markiert) an der Invasionsfront von Krebs auf bestimmte Bereiche von Interesse zu markieren. Solch ein Bereich von Interesse nicht unter Verwendung herkömmlicher Gewebemikroarray erfasst haben.

Dennoch enthält diese Protokoll einige Einschränkungen. Die wichtigste Herausforderung ist die Überlappung zwischen Donor-Block und digitale Dia. Mehrere Faktoren können diesen Schritt zu beeinflussen. Erstens sollte der letzte Abschnitt des Blocks für Dia Scannen verwendet werden. In vielen Fällen ist das H & E ist nicht der letzte Abschnitt des Spenderblocks, Käther ist es ein immunhistochemischen oder anderen Fleck. In diesem Fall wird auch ein gefärbtes Schieber verwendet werden, solange der letzte Fleck abgetastet und annotiert oder einer neuen H & E vorgenommen werden sollen. Vorsicht ist auch bei der Gewebeschnitte werden gemacht, wie Gewebe können im Wasserbad, die anspruchsvolle Anpassung der Rutsche und Block führt zu erweitern. Zweitens, im Moment Projekte bis 12 Empfänger TMA Blöcke auf einmal verarbeitet beschränkt. Größere Projekte von mehr als 12 TMAs muss zu einer zweiten Projektnamen zugeordnet werden. Drittens müssen die Spenderblöcke mit Standard-Formen und-Kassetten als das Instrument kann sich nicht auf verschiedene Größen einstellen werden. Schließlich müssen die Spenderblöcke minimale Höhe (4 mm), um eine optimale Bohrung erzielen überschreiten. In einigen Fällen erfordert dies Rückbettung von Geweben.

Hunderte von Publikationen in den letzten Jahren unterstreichen die TMA als ein unschätzbares Werkzeug für Biomarker-Forschung. TMAs wurden verwendet, um Lungen ^13, kolorektalen ^7, bre studierenAST ^{14, 15} Prostata, Pankreas ^16, der Blase ¹⁷ und Magenkrebs ^18, um nur einige zu nennen. Eine zunehmende Anzahl von Autoren haben die Verwendung von TMA mit Bildanalyse und bedeutende Schritte werden in dieser Richtung gemacht ^19-21 zusammengefasst. Doch neben einer Handvoll von Forschungsgruppen, die innovative Ideen TMA ^22-24 veröffentlicht haben, wenig Aufmerksamkeit gegeben worden, um die TMA-Technik selbst zu optimieren. Automatisierte Gewebe Microarrayer, wie der ATA-27 um Estigen / Beecher tun geben Layout-Design und zweckmäßige und automatisierte Gewebe Stanzen. Dies stellt jedoch nur ein Aspekt der ngTMA Konzept.

ngTMA ist eine wesentliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Gewebemikroarray-Techniken. Es enthält Fachwissen in der Histologie und TMA-Design mit der Flexibilität der digitalen Pathologie und der Genauigkeit der digitalen Anmerkungen mit der Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit des automatischen TMA Konstruktion. Die Kombination NGTMA und Bildanalyse zur Auswertung von Protein und molekulare Biomarker wird ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Qualität der klinischen und translationalen Forschung in der Zukunft weiter zu verbessern.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pannoramic 250 Flash II	3DHistech		Objektträgerscanner
TMA Grandmaster	3DHistech		Tissue Microarrayer
Pannoramic Viewer	3DHistech	kostenlose	Objektträgerbetrachtungssoftware
Case Center	3DHistech		Digitale Objektträgerplattform