Es wird ein neuartiger Ansatz für die Konstruktion der elektronischen Zunge (eT) beschrieben, der das Design und die Produktion von Sensormaterialien erheblich vereinfacht und es dem eT ermöglicht, kontinuierliche Entwicklungsprofile und Landschaften für Proben in Flüssigkeit zu erzeugen. Die erhaltene eT ist effizient für gängige Proteinanalysen, wie z. B. die Diskriminierung.
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Methodenartikel
Elektronische Zunge generieren Continuous Erkennungsmuster für die Protein-Analyse
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Im aktuellen Protokoll wurde ein kombinatorischer Ansatz entwickelt, um das Design und die Produktion von Sensormaterialien für den Aufbau elektronischer Zungen (eT) für die Proteinanalyse zu vereinfachen. Durch das Mischen einer kleinen Anzahl einfacher und leicht zugänglicher Moleküle mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften, die als Bausteine (BBs) verwendet werden, in unterschiedlichen und kontrollierten Anteilen und durch die Möglichkeit, dass sich die Mischungen auf der Goldoberfläche eines Prismas selbst zusammensetzen, wurde eine Reihe von kombinatorischen Oberflächen mit geeigneten Eigenschaften für die Proteinsensorik geschaffen. Auf diese Weise kann eine große Anzahl von kreuzreaktiven Rezeptoren schnell und effizient gewonnen werden. Durch die Kombination eines solchen Arrays von kombinatorischen kreuzreaktiven Rezeptoren (CoCRRs) mit einem optischen Detektionssystem wie der Oberflächenplasmonenresonanztomographie (SPRi) kann das erhaltene eT die Bindungsereignisse in Echtzeit überwachen und kontinuierliche Erkennungsmuster erzeugen, einschließlich eines 2D-Continuous-Evolution-Profils (CEP) und einer 3D-Continuous-Evolution-Landschaft (CEL) für Proben in Flüssigkeiten. Ein solches eT-System ist effizient für die Unterscheidung gängiger gereinigter Proteine.
Einleitung
Präzise und schnelle Proteinerkundungsmethoden sind in der medizinischen Diagnostik und der Proteomik sehr wichtig. Klassische Proteindetektions Arrays, wie Biochips, auf der "Schloss-und-Schlüssel" Anerkennung Prinzip und erfordern spezifische Rezeptoren wie Aptamere, Antikörper oder Mimetika.
In den letzten Jahren hat Differenzmess inspiriert durch den menschlichen Geruchssinn und gustation als Alternative 1 entstanden. Diese elektronische Nase / Zunge (DE / ET) Ansatz basiert auf unterschiedlichen Bindung von Analyten auf ein Array von kreuzreaktiven Rezeptoren (CRRs), die nicht brauchen, sehr spezifisch oder selektiv für die Zielmoleküle zu sein auf der Basis ermöglichen so die mühsame zu überwinden Prozess der Entwicklung hochselektiver Rezeptoren. Es ist die kombinierte Antwort aller Rezeptoren, die ein eindeutiges Muster für jede Probe erstellt, wie ein Fingerabdruck, so dass ihre Identifikation.
Die beiden wichtigsten Herausforderungen für die Entwicklung von elektronischen Nase / Lasche wirksame Protein Erfassungs sind die Herstellung von Sensorelementen, die die Fähigkeit zu strukturell ähnlichen Analyten und das entsprechende Übertragungssystem für das Bindungsereignis zu unterscheiden. Bisher wurden Untersuchungen verschiedene Ansätze zur Entwicklung Array 2 angegeben. Beispielsweise in einer Studie einer Array-basierten Identifizierung von Proteinen wurde unter Verwendung von Tetra-CRRs carboxyphenylporphyrin Derivaten hergestellt durch Kopplung der Carboxygruppen an verschiedene Aminosäuren oder Dipeptide Differenz Rezeptoren besitzen einen hydrophoben Kern auf Affinität für Proteine und verschiedene Umfänge berechnet vorsehen entwickelten Vermittlung differentielle Bindung. Mit diesem System wurden verschiedene Proteine und Proteingemische durch Messen der Fluoreszenzlöschung von den Rezeptoren durch die Wechselwirkung mit den Analyten 3,4 identifiziert. In einer anderen Studie wurde eine Bibliothek von 29 CRRs Tripeptid und Boronsäurereste enthalten in einer kombinatorischen Art und Weise synthetisiert auf einem hexasubstituierte Benzolgerüst wurde zur Erfassung Proteine mit einem Indikator-Aufnahme kolorimetrischen Nachweis 5,6 entwickelt. Mit einer solchen Konstruktion, zeigte jeder Rezeptor Differenzbindungskapazität mit Proteinen auf der Basis der Abweichung in den Peptid Arme und der Boronsäuren der Differenzierung von Proteinen aus Glycoproteinen begleitet. In jüngerer Zeit eine Reihe von verschiedenen kationischen funktionalisierten Goldnanopartikel mit einem anionischen fluoreszierenden Polymer Poly (p-phenylenethinylen) (PPE) konjugiert zusammen wurde geschaffen, um zu detektieren und zu identifizieren Proteine 7. Die kompetitive Bindung zwischen Protein Analyten und abgeschreckt PPE / Gold-Nanopartikel-Komplexen regeneriert Fluoreszenz, Herstellung verschiedene Erkennungsmuster für Proteine. In dieser Studie wurden die funktionalisierten Nanopartikel-Protein-Wechselwirkungen durch Variieren physikochemischen Eigenschaften der Nanopartikel-Endgruppen abgestimmt. Weiterhin wurde gezeigt, dass dieser Ansatz wirksam ist für die Proteinanalyse in komplexen und eiweißreichen Medium, wie beispielsals Humanserum bei physiologisch relevanten Konzentrationen, was zeigt, das Potenzial der eT in Profi realen Proben für die Diagnose von Krankheitszuständen 8.
Wenn auch sehr vielversprechend, haben diese Systeme einige inhärente Einschränkungen. Sie erfordern Planung und Synthese von 5-29 CRRs mit recht komplizierten Strukturen. Darüber hinaus, im Gegensatz zu dem olfaktorischen System, der sich mit folgenden jeder Messung Protein Erkundung erfordert Herstellung eines Arrays pro Probe. Schließlich sind die Überwachung in Echtzeit Bindungsereignisse extrem schwierig.
In diesem Zusammenhang wurde ein kombinatorischer Ansatz unter Verwendung einer kleinen Anzahl von einfachen und leicht zugänglichen Molekülen mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften als Bausteine (BBS) 9 vorgeschlagen (hydrophile, hydrophobe und positiv geladene, negativ geladene, neutrale, etc.). Durch Mischen BBs in unterschiedlichen und kontrollierten Anteilen und man die Mischungen zur Selbstorganisation an der Goldoberfläche einerPrisma, ein Array von Flächen mit entsprechenden kombinatorischen Eigenschaften zum Binden von Protein wurde erstellt. Bemerkenswert ist, die selbstorganisierte Monolagen auf diesem System ermöglichen eine einfache Abstimmung der eine Reihe von Oberflächeneigenschaften in einem stark divergent, so dass diverse kombikreuzreaktive Rezeptoren (CoCRRs), um schnell und effizient produziert. Protein Erfassungs wurde unter Verwendung eines optischen Erfassungssystems, Oberflächenplasmonresonanz-Bildgebung (SPRi). Kurz gesagt, beleuchtet ein Breitstrahl monochromatisch polarisierte Licht von einem LED-Array das gesamte CoCRR Bereich auf der Oberfläche des Prismas. Eine hochauflösende CCD-Videokamera bietet Echtzeit-Differenzbilder über alle Orte der CoCRR Array. Es erfasst alle lokalen Änderungen an der Oberfläche des CoCRR Array mit detaillierten Informationen über die Bindungsereignisse und kinetischen Prozessen 10. Dessen mit Hilfe der Bildbearbeitungssoftware SPR entsprechenden Bilder Flecken werden automatisch Variationen der Reflektivität Versu umgewandelts Zeit, Erzeugen einer Reihe von kinetischen Bindungskurven genannte Sensorgrammen. So erlaubt SPRi ein Etikett frei, synchrone, parallele und Echtzeit-Beobachtung von Bindungsereignissen. Zusätzlich wird die erhaltene CoCRR Array regenerierbar und wiederverwendbar für die Proteinanalyse.
Dieses Protokoll beschreibt die Konstruktion des elektronischen Zunge mit nur zwei kleine Moleküle als Bausteine und zeigt seine Anwendung zur Analyse von Proteinen gemeinsam, die auf kontinuierlichen Erkennungsmuster mit SPRi erhalten.
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Protokoll
1. Herstellung der verschiedenen Lösungen und Protein-Proben
- Planen 100 ml Phosphatpufferlösung (PBS-G), der 50 mM NaH 2 PO 4, 50 mM NaCl und 10% Glycerin bei pH 6,8.
- Planen 250 ml HEPES-Pufferlösung, enthaltend 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005% Tween 20 bei pH 7,4.
- Bereiten Stammlösung von Baustein 1 (BB1) Laktose und Baustein 2 (BB2) sulfatierte Laktose (Abbildung 1) bei 0,2 mM in PBS-G.
- Vorbereitung 1 ml der Proteinlösung in HEPES: A rachis hypogaea Lectin (AHL) bei 500 nm, Myoglobin bei 1 uM, und Lysozym bei 500 nM.
- Es werden 20 ml 1% SDS in ultrareinem Wasser.
2. Herstellung der CoCRR Array
- 75% Sauerstoff, 25% Argon, 0,6 mbar, Leistung 40 W.: die Goldoberfläche des Prismas 48 Stunden vor der mit einem Plasma-Reiniger für 3 min unter diesen Bedingungen Gebrauch zu reinigen
- Bereiten elf reinen und gemischten solutions BB1 und BB2 mit [BB1] / ([BB1] + [BB2]) Verhältnisse zwischen 0 und 100% in Schritten von 10% bei einem Gesamt BB Konzentration von 0,1 mM in PBS-G.
- Hinterlegung 8 nl Tröpfchen dieser reinen und gemischten Lösungen auf der Prismenoberfläche unter Verwendung eines berührungs Spotter vierfach für jede Verhältnis mit 44 Vertiefungen insgesamt (Abbildung 2).
HINWEIS: 10% Glycerin in PBS-g ist sehr wichtig, um die Lösungsmittelverdampfung und die Änderung der Konzentration BB nach der Abscheidung zu reduzieren. - Legen Sie das Prisma in einer Petrischale mit 1 ml hochreinem Wasser und lassen Sie es O / N bei RT Selbstorganisation von BB1 und BB2 auf der Goldoberfläche. Hierin wird angenommen, dass die durchschnittliche Oberflächenzusammensetzung in der gemischten SAMs spiegelt die Zusammensetzung der Abscheidungslösung gemischt (Figur 3) 11.
- Gründlich waschen das Prisma mit hochreinem Wasser und trocknen Sie sie unter einem Strom von Argon.
3. Proteinerkennung durch SPRi
- Stellen Sie die incubator, in dem die SPRi Vorrichtung wird bei 25 ° C platziert, um Änderungen des Brechungsindex durch die Temperaturänderung während der Proteinerfassungs induzierte vermeiden.
- Legen Sie eine nicht funktionalisierte Spülen Prisma in der 10 ul Polyether-Ether-Keton (PEEK), die Durchflusszelle mit einem Computer gesteuert Spritzenpumpe, einem Entgaser und einem 6-Tor-Mitteldruck-Einspritzventil (4). Füllen Sie das Flusssystem mit frisch gefiltert und entgast Laufpuffer HEPES.
- Entfernen Sie die Spülung Prisma und legen das Prisma, das die CoCRR Array in der Durchflusszelle. Run HEPES bei einer 100 ml / min Volumenstrom. Mit Hilfe der CCD-Kamera entfernen alle auf der Prismenoberfläche vorliegenden Luftblasen, indem Laufpuffer schnell.
- Definieren Arbeitsbereich für jeden Punkt durch Zeichnen eines Kreises mit dem gleichen Durchmesser für den Bereich von Interesse auf der Basis eines kontrastreichen Bildes der Anordnung und mit Hilfe der integrierten Software SPRi System.
- Spurenplasmonenkurven, die reflektieren darstellenduktivität Kurven in Abhängigkeit von dem Einfallswinkel für alle Flecken.
- Wählen Sie die Arbeitswinkel (Position, an der kinetischen Kurven werden aufgezeichnet) auf der höchsten Steigung der Reflexionskurven. Drehen Sie den Scanspiegel, um den ausgewählten Arbeitswinkel für kinetische Messungen zu beheben.
- Weiterhin HEPES durch den Strömungssystem laufen, bis Reflexionssignal für alle Flecken stabil und konstant ist.
- Injizieren von 1 ml AHL-Lösung mit einer Spritze in die Probenschleife (500 ul) mit dem Einspritzventil auf Position "Last". Dann legen Sie das Einspritzventil zu "Injektion" zu positionieren. Die Flussrate für die gesamte Protein Injektion verwendet wurden 100 ul / min.
- Starten kinetische Messungen durch Überwachung Reflektivität Variationen gegen die Zeit gleichzeitig auf allen Flecken.
- Am Ende des Protein-Injektion, Spülung der Anordnung mit Laufpuffer für 8 min. Schließlich injizieren 1 ml 1% SDS, um es zu regenerieren.
- Wiederholen Sie den Vorgang für die andere proteins.
4. Datenverarbeitung und Analyse
- Nach Eingabe der Proteinlösung in der Strömungszelle, molekulare Bindung auftritt, und bewirkt eine Verschiebung des Plasmonen Kurven und eine Veränderung des Reflexionsvermögens. Die Bildaufnahme-Software wandelt die gemessenen Lichtintensitätswerte Grauskalapegel, wodurch SPR Bilder 5a und erzeugt die Veränderung des Reflexionsvermögens als Funktion der Zeit, so dass Sensorgramme (5B).
- Verwenden Sie ein Mathe-Computing-Software, um die Reflektivität (R%) am Ende jedes Proteins Injektion gegenüber dem [BB1] Grundstück / ([BB1] + [BB2]) Verhältnis zu 2D kontinuierliche Entwicklung Profil (CEP) für jede Probe zu erzeugen (Abbildung 5C).
- Fügen Sie die [BB1] / ([BB1] + [BB2])-Verhältnis im Sensorgramme (5B), um 3D-Landschaft kontinuierliche Entwicklung (CEL) für jedes Protein (5D) zu erzeugen.
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Ergebnisse
Um die Fähigkeit der elektronischen Zunge für gemeinsame Protein-Analyse zu untersuchen, wurden drei Proteine verwendet: AHL, Myoglobin und Lysozym. Für jedes Protein eine deutliche 2D kontinuierliche Entwicklung Profil CEP wurde die ET erzeugt wird, wie in 6 gezeigt.
Darüber hinaus dank SPRi, die in der Lage, um die Echtzeit-Adsorption und Desorption Kinetik zu überwachen, für jedes Protein eine zeitabhängige kontinuierliche Erkennungsmuster ist, die so genannte 3D-Landsc...
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Diskussion
Die wichtigsten Schritte zur Konstruktion dieser eT sind bemüht, eine gute Reproduzierbarkeit des Systems zu gewährleisten. Beispielsweise die Reinigung der Goldoberfläche des Prismas mit einem standardisierten Verfahren vor Verwendung Zugabe von 10% Glycerin in den elf reinen und gemischten Lösungen BB1 und BB2 zur Lösungsmittelverdampfung während BBs selbstorganisierende auf der Goldoberfläche des Prismas zu vermeiden, Abscheiden mehrerer Wiederholungen für jede [BB1] / ([BB1] + [BB2])-Verhältnis, etc. ...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.
Danksagungen
Die Autoren möchten sich bei der Doktorarbeit des LANEF in Grenoble für die Unterstützung von Laurie-Amandine Garçon bedanken. Diese Arbeit wurde von der französischen Nationalen Forschungsagentur finanziell unterstützt (ANR-Stipendium 06-NANO-045).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| SPRi Apparate | Das SPRi-Gerät von Horiba Scientific-GenOptics | wird in einen temperaturgeregelten Inkubator bei 25 °C gestellt. | |
| Inkubator | Memmert | ||
| Spritzenpumpe | Cavro wissenschaftliche Instrumente | Cavro XLP 6000 | |
| Micro Elite Entgaser | Alltech | AT590507 | |
| Mitteldruck-Einspritzventil mit 6 Anschlüssen | Upchurch Scientific | Das Volumen der verwendeten Injektionsschleife beträgt 500 μl. | |
| Femto-Plasmareiniger (Version 7) | Diener Electronic | Online-Entgasungssystem mit 2 Kanälen. | |
| Spotter | Siliflow | Es handelt sich um einen berührungslosen piezoelektrischen Spotter. | |
| SPRi-Biochip | Horiba Scientific-GenOptics | 36000067 | Das Prisma besteht aus einem Glasprisma mit hohem Brechungsindex, das mit einem dünnen Goldfilm (45 nm) beschichtet und speziell für bildgebende Zwecke entwickelt wurde. |
| Erythrina cristagalli Lektin | Sigma-Aldrich | L5390 | |
| Arachis hypogaea Lektin | Sigma-Aldrich | L0881 | |
| Myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| Lysozym | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| CXCL12α | Zur Verfügung gestellt von Dr. Hugues Lortat-Jacob; Einzelheiten zur Vorbereitung finden Sie in den unterstützenden Informationen in Referenz 9 | ||
| CXCL12γ | Zur Verfügung gestellt von Dr. Hugues Lortat-Jacob; Einzelheiten zur Zubereitung siehe unterstützende Informationen in Referenz 9 | ||
| Lactose | Bereitgestellt von Prof. David Bonnaffé; Einzelheiten zur Zubereitung siehe unterstützende Informationen in Referenz 9 | ||
| Sulfatierte Lactose | Bereitgestellt von Prof. David Bonnaffé; Einzelheiten zur Zubereitung siehe unterstützende Informationen in Referenz 9 | ||
| Glycerin | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Natriumphosphat einbasisch | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Natriumchlorid | Sigma-Aldrich | S3014 |
Referenzen
- Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
- Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).
- Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors. J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).
- Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins. J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).
- Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. Differential receptors create patterns that distinguish various proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).
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- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).
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- Hou, Y., et al. Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).
- Campbell, C. T., Kim, G. SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics. Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).
- Stranick, S. J., et al. Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers. Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).
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